CN102876573B - 一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法 - Google Patents
一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及的是一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法，该培养器是由流路通道层和主体层粘合而成，流路通道层内设有流路通道，流路通道中部下方设有电磁线圈，电磁线圈通过导线与方波发生器连接；主体层上设置有膜片，膜片周围设有培养室，培养室之间通过流路通道连通；膜片上设置有磁片，磁片位于电磁线圈的上方；所述的导线上设置有线路开关。该培养方法简要如下：设定方波发生器的频率；从培养室向流路通道中注入胚胎发育所需的培养液、矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室中；接通线路开关；将整个培养器放到含5%二氧化碳的培养箱中培养。本发明模拟胚胎在哺乳动物体内显微环境，刺激胚胎生长发育，提高了囊胚发育率和增加囊胚内细胞团的细胞数。
Description
技术领域
本发明涉及的是动物胚胎培养技术领域，具体涉及的是一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法。
背景技术
胚胎体外培养技术是胚胎工程中胚胎体外生产的最基本的关键技术之一。传统的胚胎体外培养装置主要是培养皿或培养盘，这类培养装置仅能为胚胎提供一种静态的、宏观的、二维的体外生长环境，与胚胎在体内生长环境相差很大。因此，使用这类培养装置常常会改变胚胎的生长速率、形态、胞内代谢活动等相关特性，致使体外受精的胚胎在后续使用培养皿或培养盘进行体外培养时，囊胚的发育率较低，以小鼠为例，囊胚的发育率只有30%～40%，内细胞团的细胞数也达不到培育要求的数目。
另外，胚胎在体内发育期间，还会受到输卵管平滑肌的挤压，摩擦以及输卵管液的层流剪切等力的作用；同时，胚胎在生长、发育过程中不仅需要培养液提供的营养物质，除此之外，也需要一定的物理性机械力的刺激，促进其生长发育。而这些物理性机械力的刺激是传统胚胎体外培养皿或培养盘无法直接提供的。
发明内容
本发明的发明目的是针对上述问题提供一种哺乳动物胚胎体外培养器，同时提供一种使用该培养器的培养方法，用于解决体外受精的胚胎在后续使用培养皿或培养盘进行体外培养时，因无法直接提供物理性机械力的刺激而存在囊胚发育率低、内细胞团的细胞数少的问题。
本发明通过以下技术方案来实现：一种哺乳动物胚胎体外培养器是由位于下方的流路通道层和位于上方的主体层粘合而成，其中，流路通道层内设有流路通道，流路通道中部下方设有电磁线圈，电磁线圈通过导线与方波发生器连接；主体层上设置有膜片，膜片周围设有培养室，培养室之间通过流路通道连通；膜片上设置有磁片，磁片位于电磁线圈的上方；所述的导线上设置有线路开关。
所述的流路通道层下方粘有玻璃片。
使用上述培养器进行胚胎培养时的培养方法，步骤如下：
ⅰ、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器的频率；
ⅱ、从培养室向流路通道中注入胚胎发育所需的培养液、矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室中，同时将将该培养器放置显微镜下，确认胚胎已置于培养室中；
ⅲ、接通线路开关；
ⅳ、将整个培养器放到含5%二氧化碳的培养箱中培养。
采用上述技术方案的积极效果：
1、本发明使用时，首先向培养室内加入胚胎培养液、矿物油，通过方波发生器间接带动膜片运动，从而使胚胎培养液、矿物油运动，模拟胚胎在哺乳动物体内显微环境条件下生长发育，刺激胚胎，使胚胎处于动态的、微观的、三维的生长环境，提高了囊胚发育率和增加囊胚内细胞团的细胞数；
2、本发明操作简单、使用方便，适合推广应用。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
图中：1流路通道层，2主体层，3流路通道，4电磁线圈，5导线，6方波发生器，7线路开关，8膜片，9培养室，10磁片，11玻璃片。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合具体图示，进一步阐述本发明的内容。
如图1所示，一种哺乳动物胚胎体外培养器是由位于下方的流路通道层1和位于上方的主体层2粘合而成。其中，流路通道层1内设有流路通道3，并在流路通道3中部的下方设置电磁线圈4，电磁线圈4通过导线5与方波发生器6连接，导线5上设置有线路开关7。主体层2上设置有膜片8，膜片8周围设有培养室9，培养室9之间通过流路通道3连通；膜片8上设置有磁片10，磁片10位于电磁线圈4的上方。接通方波发生器6后，磁片10会带动膜片8一起运动，膜片8运动就会带动培养室9以及流路通道3内的液体运动，从而达到模拟体内胚胎发育的目的，刺激胚胎生长，提高了囊胚发育率，增加了囊胚内细胞团的细胞数。
本发明中流路通道层1、主体层2以及膜片8在生产时，可选用生物相容性强、透明度高、对细胞无毒性的聚二甲基硅氧烷材料进行制备。同时，为了进一步提高整体的牢固程度，还可在流路通道层1下方加设玻璃片11，玻璃片11与流路通道层1粘合为一体。
本发明中磁片10可选用钕铁硼材质的磁片。
采用本发明所述的培养器进行胚胎培养的方法，步骤如下：
ⅰ、首先根据不同哺乳动物胚胎发育的要求条件，对方波发生器6的频率进行设定；
ⅱ、将胚胎发育所需的培养液、矿物油从培养室9注入流路通道3中，并将体外受精的胚胎放入培养室中，同时将该培养器放置显微镜下，确认胚胎已置于培养室中；
ⅲ、接通线路开关7；
ⅳ、将整个培养器放到含5%二氧化碳的培养箱中培养，根据不同哺乳动物的要求进行设置时间的长短，以小鼠为例，通常需要培养96小时。
为进一步说明，使用本发明对体外受精的胚胎在后续体外培养时，囊胚发育率提高程度以及囊胚内细胞团细胞数的增加程度，可通过对比试验，比较使用培养皿与使用本发明所述的培养器的差别。
下面以小鼠为例，培养前，首先在同样的条件下完成超数排卵、培养基准备、卵母细胞采取、小鼠精子采集、体外受精、胚胎的鉴定以及初步培养。初步培养后的胚胎在相同的条件下分别植入培养皿和本发明所述的培养器中，在同样的条件下分别进行培养，并最终测得囊胚发育率和内细胞团的细胞数。
具体试验方法以及试验结果如下：
试验方法：
1．超数排卵
取昆明品系各60日龄段小鼠30只，在下午6时每只小鼠腹腔注射10IU的孕马血清促性腺激素，48小时后再注射10IU的人绒毛膜促性腺激素，对小鼠进行超数排卵处理，小鼠在注射人绒毛膜促性腺激素后13到18小时内收集卵母细胞。
2．培养基准备
采用市售的人输卵管培养基，于采卵前一天在直径35毫米的培养皿中做好6～10个培养液滴，用矿物油覆盖，放入37℃含5％的二氧化碳培养箱中平衡12小时以上。
3．卵母细胞的采取
颈椎脱臼的方法处死小鼠，剖腹取出连带输卵管和卵巢的子宫，然后剪下输卵管放入矿物油中，在输卵管的膨大部用解剖针稍稍刺破，将卵母细胞团引出，并导入到市售的磷酸缓冲液液滴中。然后用含有0.25%胰蛋白酶的磷酸缓冲液脱颗粒细胞处理5至10分钟，然后用吸卵针反复吸吹，直到颗粒细胞完全脱落后用配制好培养基洗3次，备用。
4．小鼠精子采集与体外受精
4.1小鼠精子采集
精子采集取昆明品系的雄性小鼠，3月龄左右的20只，按Nakagata 的方法，颈椎脱臼处死后，连同附睾一起取出睾丸，剪下附睾的上体部，用解剖针刺破后挤出精子，再用解剖针挑取精子放入事先准备好的人输卵管培养基，在体外受精前放入二氧化碳培养箱中培养1小时，使精子充分获能，备用。
4.2体外受精
将培养1小时的精子悬浮液在显微镜下检查精子活力和精子数量，然后用移液器按每个培养基液滴10微升，约含精子1000个/微升，移入卵母细胞10～15枚，放入二氧化碳培养箱中培养12小时。
4.3 2-细胞期胚胎的鉴定
在体外受精后5至7小时，将培养皿从二氧化碳培养箱中取出，用吸卵针将受精卵从受精液移入到新的胚胎培养基液滴中清洗3次后，再放入新的胚胎培养基液滴中，放回二氧化碳培养箱培养，12小时后，确认2-细胞期胚胎数。
5.胚胎初步培养
常规液滴培养法是将2-细胞期胚胎，放到事先在37℃、5%二氧化碳培养箱中平衡好的CZB培养液中，CZB培养液全称为Chatot C. Z., Ziomek C. A and Bavister B.D.培养液。
将胚胎在相同的条件下分别植入培养皿和本发明所述的培养器中，进行培养，其中，培养皿按照常规方法操作，同时使用本发明所述的培养器进行胚胎培养的方法，步骤如下：
ⅰ、针对小鼠胚胎发育所需条件，将方波发生器6的频率设定在5～10赫兹；
ⅱ、从培养室9向流路通道3中注入小鼠胚胎发育所需的CZB培养液、矿物油，该矿物油为市售的胚胎培养用矿物油，英文名称为mineral oil；将体外受精的小鼠胚胎放入培养室中，同时将将该培养器放置显微镜下，确认胚胎已置于培养室中；
ⅲ、接通线路开关7；
ⅳ、将整个培养器放到含5%二氧化碳、温度为37摄氏度的培养箱中培养。
在培养96小时时，确认囊胚发育率和使用赫斯特荧光染料33342染色检查囊胚内细胞团的细胞数。
重复三次上述试验步骤，并将试验结果统计如下：
| 组别 | 2-细胞期胚胎数（枚） | 囊胚发育率（%） | 囊胚内细胞团的细胞数（个） |
| 培养皿 | 96 | 35.4（34/96） | 45.2±5.3 |
| 本发明所述的培养器 | 121 | 58.7 (71/121) | 63.5±6.5 |
根据试验结果，可进一步证明本发明所述的培养器以及培养方法在进行胚胎体外培养时同培养皿比较，更具明显提高囊胚发育率、囊胚内细胞团的细胞数的效果。
Claims (3)
1.一种哺乳动物胚胎体外培养器，其特征在于：该培养器是由位于下方的流路通道层（1）和位于上方的主体层（2）粘合而成，其中，流路通道层内设有流路通道（3），流路通道（3）中部下方设有电磁线圈（4），电磁线圈（4）通过导线（5）与方波发生器（6）连接；主体层（2）上设置有膜片（8），膜片（8）周围设有培养室（9），培养室（9）之间通过流路通道（3）连通；膜片（8）上设置有磁片（10），磁片（10）位于电磁线圈（4）的上方；所述的导线（5）上设置有线路开关（7）。
2.根据权利要求1所述的一种哺乳动物胚胎体外培养器，其特征在于：所述的流路通道层（1）下方粘有玻璃片（11）。
3.使用权利要求1或2所述的一种哺乳动物胚胎体外培养器进行胚胎培养的方法，包括以下步骤：
ⅰ、按照不同哺乳动物胚胎发育所需条件，设定方波发生器（6）的频率；
ⅱ、从培养室（9）向流路通道（3）中注入胚胎发育所需的培养液、矿物油，并将体外受精的胚胎放入培养室中，同时将该培养器放置显微镜下，确认胚胎已置于培养室中；
ⅲ、接通线路开关（7）；
ⅳ、将整个培养器放到含5%二氧化碳的培养箱中培养。
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