CN110747160B - 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法 - Google Patents

一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110747160B
CN110747160B CN201911185332.0A CN201911185332A CN110747160B CN 110747160 B CN110747160 B CN 110747160B CN 201911185332 A CN201911185332 A CN 201911185332A CN 110747160 B CN110747160 B CN 110747160B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pipe
culture
cavity
culture dish
tube
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911185332.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110747160A (zh
Inventor
梁俊勇
刘厉君
王邵雨
董信阳
王争光
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201911185332.0A priority Critical patent/CN110747160B/zh
Publication of CN110747160A publication Critical patent/CN110747160A/zh
Priority to JP2020028827A priority patent/JP6759497B1/ja
Application granted granted Critical
Publication of CN110747160B publication Critical patent/CN110747160B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/06—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for in vitro fertilization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/52—Mobile; Means for transporting the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/04—Seals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C12M41/14—Incubators; Climatic chambers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，包括以下步骤：卵母细胞培养、精液处理、体外受精、受精卵子培养，所述受精卵子培养需放在培养箱中进行，所述培养箱包括箱体、箱体内放有多个培养皿、用于多个培养皿单独升降的升降装置、控制箱体内温度和CO2及O2的控制装置、培养皿拿取或存放过程中与箱体隔绝的隔绝机构。本发明提高受精卵成活率，通过培养箱的设置在不断查看受精卵过程中，能够保持培养箱内的营养环境。

Description

一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法
技术领域
本发明涉及动物受精卵培养技术领域，尤其是涉及一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法。
背景技术
随着现代繁殖生物技术的发展及胚胎体外生产技术的逐步完善，羊胚胎体外生产技术(体外受精或克隆)已成为加快品种选育和优良种群扩繁速度的重要途径。虽然通过胚胎体外生产技术已经获得了活的后代，但体外受精或克隆获得的体外胚胎在培养过程中普遍存在发育阻断现象，即胚胎发育到一定阶段后停止发育并发生退化，导致体外胚胎的囊胚发育率远低于体内胚胎。目前的羊胚胎体外培养的营养环境是导致上述问题的关键原因之一，如查看羊受精卵子过程中，需把受精卵子从培养箱中拿取出来，拿取过程中对培养箱内的温度、湿度、氧气、二氧化碳等影响较大。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，包括以下步骤：
a、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入10-20枚卵母细胞，在38-39℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养22-26h，卵母细胞复合体成熟为卵子；
b、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，浆受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡2-3h；
c、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30-50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38-39℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养18-24h；
d、受精卵子培养：精子与卵子受精培养18-24h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养6-8天；
其中，所述步骤d中的培养箱包括箱体、箱体内放有多个培养皿、用于多个培养皿单独升降的升降装置、控制箱体内温度和CO2及O2的控制装置、培养皿拿取或存放过程中与箱体隔绝的隔绝机构，所述升降装置包括等距环形分布固定设于箱体上的多个空心管、与多个空心管内腔连通设置的空心盘、位于空心管内的活塞杆、固定设于活塞杆上端用于放培养皿的固定座、位于空心盘轴心处且插入空心盘内的进气管、设于空心盘上的吸气管、设于空心盘内用于密封空心管的密封件、设于密封件上的空腔、用于密封件上空腔与进气管连通的连接管、固定设于进气管上的大齿轮、与大齿轮齿合设置的小齿轮、用于驱动小齿轮转动的第一电机；吸气管把空心盘和空心管内的空气吸出，位于空心管内的活塞杆下降最底端，固定座上的培养皿位于培养箱体内，取其中某一个培养皿，第一电机驱动小齿轮转动，带动大齿轮转动，所述大齿轮固定设于进气管上，从而带动进气管转动，进气管与密封件通过连接管连接，从而带动密封件以进气管为轴心转动，密封件位移需要取的培养皿正下方，即空心管正下方，该空心管通过密封件上的空腔和连接管与进气管连通，进气管注入气体，带动活塞杆和固定座及培养皿整体上升，完成培养皿的单个拿取。本发明通过吸气管把空心盘和空心管内的空气吸出，使位于空心管内的活塞杆下降最底端并完成固定，使固定座上的培养皿位于培养箱体内；取其中某一个培养皿过程中，通过第一电机驱动小齿轮转动，使大齿轮转动，所述大齿轮固定设于进气管上，从而驱动进气管转动，所述进气管与密封件通过连接管连接，从而驱动密封件以进气管为轴心转动，密封件位移需要取的培养皿正下方，即空心管正下方时，该空心管通过密封件上的空腔和连接管与进气管连通，再通过进气管注入气体，使活塞杆和固定座及培养皿整体上升，完成培养皿的单个拿取，上升过程中通过隔绝机构使培养箱内的环境与外部隔绝，避免外部的环境对箱内的环境造成影响；培养箱内的氧气、二氧化碳等不断消耗时，通过控制装置对消耗的氧气等补充，使营养箱内的环境保持不变；上述方法提高受精卵成活率，再通过培养箱的设置在不断查看受精卵过程中，能够保持培养箱内的营养环境。
所述步骤a中的成熟液在M199培养基原液中加入：8-12g/mL FSH(促卵泡素)、8-12g/mLLH(促黄体素)、0.5-1.5g/mL E2(雌激素)、0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇和10-20％ESS(发情母羊血清)，培养液在使用前制作成40-60μL/滴的成熟液微滴；有利于缩短卵母细胞的繁殖间隔，卵母细胞成熟为卵子，大幅提高羊的遗传改良速度和生产效率。
所述步骤c中的受精液在SOF(输卵管合成液)中加入：0.1-0.2μmol/L青霉胺、0.1-0.2μmol/L亚牛磺酸、5-10μg/mL肝素和2-10％ESS(发情母羊血清)；有利于提高受精率及缩短受精卵的受精间隔，大幅提高羊的遗传改良速度和生产效率。
所述控制装置包括氧气管、位于氧气管上方的湿气管、位于湿气管上方的二氧化氮管、等距环形分布设于氧气管上的多个出氧管、等距环形分布设于湿气管上的多个出气管、等距环形分布设于二氧化碳管上的多个出碳管、分别插入多个出氧管内和出气管内及出碳管内的多个插杆、位于多个插杆中间的转轴、用于驱动转轴转动的驱动件、贯穿固定设于转轴上的型腔轮、转动设于插杆一端的滚珠、用于混合氧气和二氧化碳及湿气的多个混气管、分别设于混气管上方的多个挡气柱，型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状；驱动件驱动转轴不停的转动，所述型腔轮固定设于转轴上，从而带动型腔轮转动，所述型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状，多个插杆分别在出氧管和出气管及出碳管内移动，完成出氧管和出气管及出碳管的开启和关闭，不断的补充箱体内的氧气、二氧化碳和湿气，混气管对出来的氧气、二氧化碳和湿气进行混合再从混气管上端排出。通过驱动件驱动转轴不停的转动，所述型腔轮固定设于转轴上，从而使型腔轮转动，所述型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状，使多个插杆分别在出氧管和出气管及出碳管内移动，使出氧管和出气管及出碳管的开启和关闭，不断的补充箱体内的氧气、二氧化碳和湿气及温度，所述湿气管、氧气管和二氧化碳管循环且有一定的压力，使氧气、二氧化碳和湿气能够从湿气管、氧气管和二氧化碳管出来，再通过混气管对出来的氧气、二氧化碳和湿气进行混合，再从混气管上端排出，所述混气管上端设有挡气柱，使混合均匀的气体能够分散开来，使培养箱内的氧气、二氧化碳和湿气更均匀。
所述隔绝机构包括设于培养皿上方固定设于箱体内的第一隔板和第二隔板、位于多个固定座正上方且分别位于第一隔板和第二隔板上的多个型腔管、设于第一隔板上的多个通孔、设于型腔管上的排气管、设于第二隔板上的溢气阀、用于密封型腔管的密封盖、固定设于型腔管上端呈弧状的环形凸块、与环形凸块配合使用设于密封盖上的弧形圆槽、用于密封盖翻盖的多组翻盖组件；活塞杆上升，带动固定座和培养皿上升，固定座和培养皿上升至型腔管内，固定座与型腔管形成密封，固定座继续上升，位于型腔管内的气体通过排气管排出，固定座上升至排气管口处停止上升，固定座对排气管密封，翻盖组件驱动密封盖开启，培养皿位于箱体外便于拿取，放培养皿过程中，先驱动翻盖组件把密封盖盖住型腔管，活塞杆下降，带动固定座和培养皿下降，排气管开启，箱体内的气体进入型腔管中，活塞杆带动固定座和培养皿下降最低点后停止下降，培养皿位于培养箱内。通过活塞杆上升带动固定座和培养皿上升，使固定座和培养皿位于型腔管内，通过固定座与型腔管形成密封完成与培养箱内的隔断，固定座继续上升，位于型腔管内的气体通过排气管排出，避免压力对受精卵造成影响，固定座上升至排气管口处停止上升，固定座再对排气管密封，使培养箱与培养皿完全隔断，再通过翻盖组件驱动密封盖开启，使培养皿位于箱体外便于拿取；放培养皿过程中，先驱动翻盖组件把密封盖盖住型腔管，活塞杆下降，带动固定座和培养皿下降，使排气管开启，箱体内的气体进入型腔管中，活塞杆带动固定座和培养皿下降最低点后停止下降，培养皿位于培养箱内，完成培养皿的拿取和放置。
所述翻盖组件包括固定设于密封盖上的第一固定板、固定设于箱体上的第二固定板、一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上的第一转杆和第二转杆、用于驱动第二转杆转动的第二电机、固定设于箱体上的弧形导轨、设于弧形导轨上的弧形滑块、位于弧形导轨内用于弧形滑块归位的弹簧，所述弧形滑块与第二转杆固定连接；第二电机驱动第二转杆转动，以第二电机轴心转动，弧形滑块在弧形导轨上移动，密封盖跟着第二转杆转动，所述第一转杆一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上，第二转杆转动带动第一转杆转动，完成密封盖翻盖工作，第二电机停止工作，弹簧驱动弧形滑块归位，即第二转杆归位，最终驱动密封盖盖住型腔管。通过第二电机驱动第二转杆转动，使第一固定板以第二电机轴心转动，即密封盖转动，所述弧形滑块固定在第二转杆上，使弧形滑块在弧形导轨上移动，所述第一转杆一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上，使密封盖转动过程中并进行翻转，通过该设置能够避免环形凸块与密封盖上的弧形圆槽磨损而导致漏气，完成密封盖翻盖工作；盖密封盖过程中第二电机停止工作，通过弹簧驱动弧形滑块归位，即第二转杆归位，最终驱动密封盖盖住型腔管，通过弹簧对第二转杆的推力，使密封盖压紧型腔管上端，使密封效果更好。
本发明具有以下优点：上述方法提高受精卵成活率，再通过培养箱的设置在不断查看受精卵过程中，能够保持培养箱内的营养环境。
附图说明
图1为本发明的结构示意图。
图2为隔绝机构的部分结构示意图一。
图3为图2中的A处放大图。
图4为控制装置的正面示意图。
图5为图4中的B处放大图。
图6为本发明的剖面示意图一。
图7为图6中的C处放大图。
图8为图6中的D处放大图。
图9为本发明的剖面示意图二。
图10为控制装置的剖面示意图。
图11为图10中的E处放大图。
图12为为隔绝机构的部分结构示意图二。
图13为升降装置的剖面结构示意图。
图14为升降装置的部分结构示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例一
一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，包括以下步骤：
a、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入15枚卵母细胞，在389℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养24h，卵母细胞复合体成熟为卵子；
b、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，浆受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡2h；
c、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中40个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养20h；
d、受精卵子培养：精子与卵子受精培养20h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以30枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养6天；
如图1-14所示，所述步骤d中的培养箱包括箱体1、箱体内放有多个培养皿2、用于多个培养皿单独升降的升降装置、控制箱体内温度和CO2及O2的控制装置、培养皿拿取或存放过程中与箱体隔绝的隔绝机构，所述升降装置包括等距环形分布固定设于箱体上的多个空心管30、与多个空心管内腔连通设置的空心盘31、位于空心管内的活塞杆32、固定设于活塞杆上端用于放培养皿的固定座33、位于空心盘轴心处且插入空心盘内的进气管34、设于空心盘上的吸气管35、设于空心盘内用于密封空心管的密封件36、设于密封件上的空腔37、用于密封件上空腔与进气管连通的连接管38、固定设于进气管上的大齿轮39、与大齿轮齿合设置的小齿轮300、用于驱动小齿轮转动的第一电机310；吸气管把空心盘和空心管内的空气吸出，位于空心管内的活塞杆下降最底端，固定座上的培养皿位于培养箱体内，取其中某一个培养皿，第一电机驱动小齿轮转动，带动大齿轮转动，所述大齿轮固定设于进气管上，从而带动进气管转动，进气管与密封件通过连接管连接，从而带动密封件以进气管为轴心转动，密封件位移需要取的培养皿正下方，即空心管正下方，该空心管通过密封件上的空腔和连接管与进气管连通，进气管注入气体，带动活塞杆和固定座及培养皿整体上升，完成培养皿的单个拿取。
所述控制装置包括氧气管40、位于氧气管上方的湿气管41、位于湿气管上方的二氧化氮管42、等距环形分布设于氧气管上的多个出氧管43、等距环形分布设于湿气管上的多个出气管44、等距环形分布设于二氧化碳管上的多个出碳管45、分别插入多个出氧管内和出气管内及出碳管内的多个插杆46、位于多个插杆中间的转轴47、用于驱动转轴转动的驱动件48、贯穿固定设于转轴上的型腔轮49、转动设于插杆一端的滚珠400、用于混合氧气和二氧化碳及湿气的多个混气管410、分别设于混气管上方的多个挡气柱420，型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状；驱动件驱动转轴不停的转动，所述型腔轮固定设于转轴上，从而带动型腔轮转动，所述型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状，多个插杆分别在出氧管和出气管及出碳管内移动，完成出氧管和出气管及出碳管的开启和关闭，不断的补充箱体内的氧气、二氧化碳和湿气，混气管对出来的氧气、二氧化碳和湿气进行混合再从混气管上端排出。
所述隔绝机构包括设于培养皿上方固定设于箱体内的第一隔板50和第二隔板51、位于多个固定座正上方且分别位于第一隔板和第二隔板上的多个型腔管52、设于第一隔板上的多个通孔53、设于型腔管上的排气管54、设于第二隔板上的溢气阀55、用于密封型腔管的密封盖56、固定设于型腔管上端呈弧状的环形凸块57、与环形凸块配合使用设于密封盖上的弧形圆槽58、用于密封盖翻盖的多组翻盖组件59；活塞杆上升，带动固定座和培养皿上升，固定座和培养皿上升至型腔管内，固定座与型腔管形成密封，固定座继续上升，位于型腔管内的气体通过排气管排出，固定座上升至排气管口处停止上升，固定座对排气管密封，翻盖组件驱动密封盖开启，培养皿位于箱体外便于拿取，放培养皿过程中，先驱动翻盖组件把密封盖盖住型腔管，活塞杆下降，带动固定座和培养皿下降，排气管开启，箱体内的气体进入型腔管中，活塞杆带动固定座和培养皿下降最低点后停止下降，培养皿位于培养箱内。
所述翻盖组件59包括固定设于密封盖上的第一固定板591、固定设于箱体上的第二固定板592、一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上的第一转杆593和第二转杆594、用于驱动第二转杆转动的第二电机595、固定设于箱体上的弧形导轨596、设于弧形导轨上的弧形滑块597、位于弧形导轨内用于弧形滑块归位的弹簧598，所述弧形滑块与第二转杆固定连接；第二电机驱动第二转杆转动，以第二电机轴心转动，弧形滑块在弧形导轨上移动，密封盖跟着第二转杆转动，所述第一转杆一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上，第二转杆转动带动第一转杆转动，完成密封盖翻盖工作，第二电机停止工作，弹簧驱动弧形滑块归位，即第二转杆归位，最终驱动密封盖盖住型腔管。
上述第一电机和第二电机为市场上购买得到的。
实施例二
一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，包括以下步骤：
a、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入20枚卵母细胞，在39℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养26h，卵母细胞复合体成熟为卵子；
b、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，浆受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡3h；
c、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在39℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养24h；
d、受精卵子培养：精子与卵子受精培养24h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养8天；
实施例三
一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，包括以下步骤：
a、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入10枚卵母细胞，在38℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养22h，卵母细胞复合体成熟为卵子；
b、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，浆受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡2h；
c、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38℃、5％CO2、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养18h；
d、受精卵子培养：精子与卵子受精培养18h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养6天。

Claims (1)

1.一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
a 、卵母细胞培养：将采集到的卵母细胞复合体移入成熟液滴中，每滴成熟液微滴中移入10-20枚卵母细胞，在38-39℃、5% CO2、饱和湿度环境下培养22-26h，卵母细胞复合体成熟为卵子；
b 、精液处理：取新鲜或者解冻后的精液，稀释成精子稀释液，在每个受精液滴中移入精子稀释液，将受精液滴连同培养皿或培养板一同放入CO2培养箱中平衡2-3h；
c 、体外受精：将成熟液中的成熟卵子按每个受精液滴中30-50个成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38-39℃、5% CO2、饱和湿度环境下培养箱中进行体外受精并培养18-24h；
d 、受精卵子培养：精子与卵子受精培养18-24h后，去除受精卵子周围的颗粒细胞和附着的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎发育液滴中，在饱和湿度的培养箱中进行体外培养6-8天；
其中，所述步骤d中的培养箱包括箱体（1）、箱体内放有多个培养皿（2）、用于多个培养皿单独升降的升降装置、控制箱体内温度和CO2、O2的控制装置、培养皿拿取或存放过程中与箱体隔绝的隔绝机构，所述升降装置包括等距环形分布固定设于箱体上的多个空心管（30）、与多个空心管内腔连通设置的空心盘（31）、位于空心管内的活塞杆（32）、固定设于活塞杆上端用于放培养皿的固定座（33）、位于空心盘轴心处且插入空心盘内的进气管（34）、设于空心盘上的吸气管（35）、设于空心盘内用于密封空心管的密封件（36）、设于密封件上的空腔（37）、用于密封件上空腔与进气管连通的连接管（38）、固定设于进气管上的大齿轮（39）、与大齿轮齿合设置的小齿轮（300）、用于驱动小齿轮转动的第一电机（310）；吸气管把空心盘和空心管内的空气吸出，位于空心管内的活塞杆下降最底端，固定座上的培养皿位于培养箱体内，取其中某一个培养皿，第一电机驱动小齿轮转动，带动大齿轮转动，所述大齿轮固定设于进气管上，从而带动进气管转动，进气管与密封件通过连接管连接，从而带动密封件以进气管为轴心转动，密封件位移需要取的培养皿正下方，即空心管正下方，该空心管通过密封件上的空腔和连接管与进气管连通，进气管注入气体，带动活塞杆和固定座及培养皿整体上升，完成培养皿的单个拿取；
所述步骤a中的成熟液在 M199 培养基原液中加入：8-12 g/mL促卵泡素、8-12 g/mL促黄体素、0.5-1.5 g/mL 雌激素、0.05-0.15mmol/L β - 巯基乙醇和10-20%发情母羊血清，培养液在使用前制作成 40-60μ L/滴的成熟液微滴；所述步骤c中的受精液在输卵管合成液中加入：0.1-0.2μmol/L青霉胺、0.1-0.2μmol/L亚牛磺酸、5-10μ g/mL 肝素和2 -10% 发情母羊血清;所述控制装置包括氧气管（40）、位于氧气管上方的湿气管（41）、位于湿气管上方的二氧化氮管（42）、等距环形分布设于氧气管上的多个出氧管（43）、等距环形分布设于湿气管上的多个出气管（44）、等距环形分布设于二氧化碳管上的多个出碳管（45）、分别插入多个出氧管内和出气管内及出碳管内的多个插杆（46）、位于多个插杆中间的转轴（47）、用于驱动转轴转动的驱动件（48）、贯穿固定设于转轴上的型腔轮（49）、转动设于插杆一端的滚珠（400）、用于混合氧气和二氧化碳及湿气的多个混气管（410）、分别设于混气管上方的多个挡气柱（420），型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状；驱动件驱动转轴不停的转动，所述型腔轮固定设于转轴上，从而带动型腔轮转动，所述型腔轮上设有三组型腔，滚珠位于三组型腔内，所述型腔轮上的型腔呈波浪状，多个插杆分别在出氧管和出气管及出碳管内移动，完成出氧管和出气管及出碳管的开启和关闭，不断的补充箱体内的氧气、二氧化碳和湿气，混气管对出来的氧气、二氧化碳和湿气进行混合再从混气管上端排出；
所述隔绝机构包括设于培养皿上方固定设于箱体内的第一隔板（50）和第二隔板（51）、位于多个固定座正上方且分别位于第一隔板和第二隔板上的多个型腔管（52）、设于第一隔板上的多个通孔（53）、设于型腔管上的排气管（54）、设于第二隔板上的溢气阀（55）、用于密封型腔管的密封盖（56）、固定设于型腔管上端呈弧状的环形凸块（57）、与环形凸块配合使用设于密封盖上的弧形圆槽（58）、用于密封盖翻盖的多组翻盖组件（59）；活塞杆上升，带动固定座和培养皿上升，固定座和培养皿上升至型腔管内，固定座与型腔管形成密封，固定座继续上升，位于型腔管内的气体通过排气管排出，固定座上升至排气管口处停止上升，固定座对排气管密封，翻盖组件驱动密封盖开启，培养皿位于箱体外便于拿取，放培养皿过程中，先驱动翻盖组件把密封盖盖住型腔管，活塞杆下降，带动固定座和培养皿下降，排气管开启，箱体内的气体进入型腔管中，活塞杆带动固定座和培养皿下降最低点后停止下降，培养皿位于培养箱内；
所述翻盖组件（59）包括固定设于密封盖上的第一固定板（591）、固定设于箱体上的第二固定板（592）、一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上的第一转杆（593）和第二转杆（594）、用于驱动第二转杆转动的第二电机（595）、固定设于箱体上的弧形导轨（596）、设于弧形导轨上的弧形滑块（597）、位于弧形导轨内用于弧形滑块归位的弹簧（598），所述弧形滑块与第二转杆固定连接；第二电机驱动第二转杆转动，以第二电机轴心转动，弧形滑块在弧形导轨上移动，密封盖跟着第二转杆转动，所述第一转杆一端转动设于第一固定板上另一端转动设于第二固定板上，第二转杆转动带动第一转杆转动，完成密封盖翻盖工作，第二电机停止工作，弹簧驱动弧形滑块归位，即第二转杆归位，最终驱动密封盖盖住型腔管。
CN201911185332.0A 2019-11-27 2019-11-27 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法 Active CN110747160B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911185332.0A CN110747160B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法
JP2020028827A JP6759497B1 (ja) 2019-11-27 2020-02-21 胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911185332.0A CN110747160B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110747160A CN110747160A (zh) 2020-02-04
CN110747160B true CN110747160B (zh) 2020-10-30

Family

ID=69284887

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911185332.0A Active CN110747160B (zh) 2019-11-27 2019-11-27 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6759497B1 (zh)
CN (1) CN110747160B (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111876374B (zh) * 2020-08-07 2021-03-16 湖州怡辉生态农业有限公司 一种湖羊胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法
CN112400862A (zh) * 2020-11-24 2021-02-26 长沙医学院 一种精原干细胞冷冻保存系统及其保存方法
CN112625881A (zh) * 2021-01-12 2021-04-09 曹增育 一种便于胶原蛋白提取的负压培养装置
CN112931201A (zh) * 2021-01-28 2021-06-11 郭世建 一种具有自清能力的组织培养装置
IL281561A (en) * 2021-03-16 2022-10-01 Yeda Res & Dev Methods and devices for growing mouse embryos outside the uterus
CN112877278B (zh) * 2021-03-19 2023-01-06 浙江大学 一种高繁殖率的胚胎体外生产方法
CN113637555A (zh) * 2021-07-31 2021-11-12 顾怀飞 一种可调温生物细胞工程培养装置及其使用方法
CN113549552B (zh) * 2021-08-11 2024-05-31 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种脐带胎盘采集液配液装置
CN114058506B (zh) * 2021-11-25 2023-12-22 重庆市畜牧技术推广总站 一种提高卵母细胞的成熟率高效养猪方法及培养系统
CN114015571B (zh) * 2021-12-14 2024-01-09 温州医科大学 细胞培养皿细菌感染实验装置
CN115152637B (zh) * 2022-08-23 2024-01-05 湖州创感科技有限公司 一种基于林木育种的智能化林木组织培养箱
CN115895831B (zh) * 2022-11-15 2023-09-19 江苏春江生物科技有限公司 一种太岁发酵中草药降血压制剂及制备装置
CN115505503B (zh) * 2022-11-17 2023-02-07 莱芜职业技术学院 一种微生物培养繁殖一体化设备
CN115595269B (zh) * 2022-12-16 2023-07-25 珠海迪尔生物工程股份有限公司 封闭式培养箱
CN116200257B (zh) * 2023-03-10 2023-08-11 赛赋(北京)检测技术服务有限公司 一种细胞增殖智能化检测试剂盒及其使用方法
CN116555029A (zh) * 2023-05-16 2023-08-08 宁波宇泰医疗器械有限公司 一种高存活率的干细胞培养系统
CN116555030B (zh) * 2023-06-12 2023-12-08 北京康泰联和国际生物科技有限公司 一种基于脐带间充质干细胞培养的存放设备
CN116606713B (zh) * 2023-07-12 2024-03-15 无锡海拓环保装备科技有限公司 一种菌群培养装置
CN117343841B (zh) * 2023-12-05 2024-03-01 山东大学 一种密封装置及其带有密封装置的转盘式培养箱
CN117660160A (zh) * 2023-12-05 2024-03-08 山东大学 一种独立分层式培养箱
CN117683634B (zh) * 2024-01-31 2024-05-07 山东格林医学科技有限公司 一种糖尿病治疗干细胞培养装置及方法
CN118006464B (zh) * 2024-04-10 2024-06-21 江苏立维斯德生物技术有限公司 一种轻便式细胞低氧培养装置

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH04234973A (ja) * 1990-12-29 1992-08-24 Dainippon Seiki:Kk 細菌類培養装置
JP2005073523A (ja) * 2003-08-28 2005-03-24 Olympus Corp 培養装置用トレイ及び自動培養装置
CN104169413B (zh) * 2012-02-29 2016-01-20 株式会社Jtec 具有培养液更换功能的细胞培养装置
CN102676449B (zh) * 2012-05-14 2015-06-10 浙江大学 一种含ghrelin的羊胚胎体外培养液及其培养方法
CN102876573B (zh) * 2012-10-26 2013-11-20 黑龙江八一农垦大学 一种哺乳动物胚胎体外培养器及其培养方法
CN103013908B (zh) * 2013-01-08 2014-03-12 内蒙古赛科星繁育生物技术股份有限公司 牛混合羊精液体外受精新方法
CN103103160B (zh) * 2013-01-25 2015-08-05 内蒙古民族大学 牛体外胚胎两段培养方法
CN103392670B (zh) * 2013-08-10 2015-06-10 内蒙古赛科星繁育生物技术（集团）股份有限公司 由种公牛体外受精率对种公牛精子体内受胎率的评价方法
US10900023B2 (en) * 2013-08-22 2021-01-26 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Modular, microfluidic, mechanically active bioreactor for 3D, multi-tissue, tissue culture
CN104862226A (zh) * 2014-02-20 2015-08-26 中国科学院广州生物医药与健康研究院 显微生物培养箱
CN104017728B (zh) * 2014-06-23 2016-03-23 余裕炉 用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系
JP6477285B2 (ja) * 2015-06-19 2019-03-06 シンフォニアテクノロジー株式会社 収容物移動装置
CN207227398U (zh) * 2017-08-17 2018-04-13 石家庄君乐宝乳业有限公司 可调式培养皿盛放容器
CN108753612A (zh) * 2018-06-12 2018-11-06 湖州韩汇进出口有限公司 一种可满足多个培养要求的干细胞分离培养装置
CN109929761B (zh) * 2019-04-30 2024-02-02 杭州捷诺飞生物科技股份有限公司 细胞动态培养芯片及细胞动态培养装置
CN110317730B (zh) * 2019-06-19 2024-06-11 内蒙古璞瑞农牧业有限公司 一种用于牛胚胎体外培养装置
CN111493011B (zh) * 2019-08-31 2021-04-06 浙江大学 一种孵化率高的水产动物受精卵离体孵化设备

Also Published As

Publication number Publication date
JP6759497B1 (ja) 2020-09-23
JP2021083437A (ja) 2021-06-03
CN110747160A (zh) 2020-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110747160B (zh) 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法
EP0177738A1 (en) Process for regenerating corn
CN110846272A (zh) 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法
CN104988059B (zh) 一种用于藻类养殖的光生物反应器
CN103695313A (zh) 一种卵细胞捕获培养自动化装置
CN111849872A (zh) 一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法
CN112877278B (zh) 一种高繁殖率的胚胎体外生产方法
CN110684661A (zh) 一种可恒温自动加料的胚胎培养装置
Jaffe et al. Cell transport and the bursa of Fabricius
CN1810967A (zh) 一种生产体细胞克隆猪的方法
CN110476902B (zh) 一种蚯蚓养殖设备及养殖方法
CN202744550U (zh) 精子竞争受精皿
CN211471441U (zh) 一种辅助生殖用护理器械
CN219950955U (zh) 用于藻类生长的光生物反应器
CN103421683A (zh) 精子竞争受精皿及其使用方法
CN213475964U (zh) 一种藻类一级扩种烧瓶
CN217948150U (zh) 一种干细胞培养灌流装置
CN220897348U (zh) 一种辣椒育种用幼苗培育装置
CN108812483A (zh) 多功能水产养殖池增氧设备
CN2754353Y (zh) 一体化气动压差水气耕式生物反应器
CN110184168A (zh) 一种简易虾青素培养器及使用其培养虾青素的方法
CN110432194B (zh) 华贵栉孔扇贝与海湾扇贝的杂交制种方法
CN215683842U (zh) 用于高原香菇种植的出菇培育箱
CN112616773B (zh) 一种提高胚胎蛋中抗氧化性成分的生产方法
CN210298928U (zh) 大叶千斤拔组培苗生根培养装置

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant