CN104017728B - 用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系 - Google Patents

用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于人类卵子、精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液以及培养体系，所述的培养装置包括：至少两个恒温培养室，所述的培养室为一密闭空间，密闭空间的容积至少100毫升；两个小型气瓶室；一混合气体过滤装置；一气体压力保护装置；一混合气体预热恒温室；供气管等；培养液包含：氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸、牛磺酸、丙酮酸钠、左旋乳酸钠、葡萄糖、庆大霉素、丙氨酸-谷氨酰胺二肽以及除丙氨酸和谷氨酰胺以外的十八种左旋氨基酸等。采用本发明装置和培养液，即可完成人类卵子和精子体外授精和着床前胚胎发育的全过程，并且优质囊胚形成率及胚胎着床率显著提高。

Description

用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系
技术领域
本发明涉及一种用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置及培养体系。
背景技术
人类的体外授精-胚胎移植技术(InVitro-FertilizationandEmbryoTransfer,IVF-ET)发展了三十多年，已经取得了较大的进展。目前的体外授精和胚胎培养均在二氧化碳培养箱中完成，依赖培养箱中恒定的温度和恒定浓度的二氧化碳与培养基中的化学成分互相作用和交流，来维持精卵授精和胚胎生长所需的生理环境。但现有的培养系统中无论是硬件设备(培养装置或培养箱)上还是在培养基方面都存在一些缺陷或不足。就硬件而言，现有的培养装置(培养箱)是一个开放式的系统，培养箱内的气体需不断地与箱外即胚胎实验室内的空气交流才能维持培养箱内或装置内气体的平衡与稳定，因此这样的开放式系统存在以下明显的不足或缺陷：一是装置内的气体浓度和温度实际上是处于一种动态的平衡状态，气体浓度和温度在一定的范围内波动，波动的大小则取决于装置或培养箱的型号和质量；二是实验室内的挥发性有机物、有害的理化因子如臭氧等可以通过这一开放式的气体交流体系进入到培养箱内，导致胚胎的损伤，甚至死亡；其三是当培养箱开门时，箱内的气体大量溢出而不可避免地造成培养箱内的气体浓度和温度剧烈地波动，随着开门次数的增加，这种剧烈波动造成胚胎伤害的程度也随之增大。就培养基而言，目前商业化的一程式培养基也至少需要授精和胚胎培养两种培养基才能完成体外授精和胚胎培养的全过程，如序贯培养基则需三种不同的培养基才能完成此过程。培养基种类的增多除了成本增加以外，更主要的缺陷是在授精、卵裂及囊胚培养的不同阶段中需要及时准确地更换不同的培养基，在一次完整的培养过程中多次换液就不可避免，从而不但增加了培养箱的开门次数，致使培养效果下降，而且同时也可能因使用错误的培养基类型导致培养失败的风险也随之增大。
在现有的开放式培养体系中，三级或以上卵裂胚的囊胚形成率一般在50-70％之间，而顶级囊胚形成率则在15-25％之间，囊胚的着床率在45-60％之间。
发明内容
为解决现有的开放式培养体系中存在的上述问题，本发明的目的之一在于提供一种用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置；
本发明的另一目的在于提供一种用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养液；
本发明的再一目的在于提供一种用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系。
本发明提供的技术方案如下：
一种用于人类卵子和精子体外授精和胚胎早期发育的培养装置，其特征在于，包括：
至少两个恒温培养室，所述的培养室内设一密闭空间，密闭空间的容积至少100毫升，密闭空间内设有用于放置培养皿的多孔板，多孔板下方设有容纳水的空间；该培养室设有可打开或密封的保温盖板；并设有一进气管以及一出气阀；
一恒温装置，该恒温装置用以提供培养室的恒温环境；所述的恒温装置可以为水浴、或其它方式，如电加热方式；
一用于去除气体中的颗粒杂质及挥发性有机物的气体过滤装置；
一混合气体预热恒温室；所述的恒温室可以为水浴或其它加热方式，如电加热方式；
供气管，该供气管进口端连接混合气体供气装置，出口端连接培养室的进气管，从混合气体供气装置的出口连接的供气管连接气体过滤装置，气体过滤装置出口的供气管经过混合气体预热恒温室，再进入培养室；混合气体预热恒温室使气体进入培养室之前温度上升到与培养室里的温度相同。
其中，恒温培养室的数量可以为2-50个，优选为6-10个。然而，不限于此，也可以可以根据需要设置为其它数量。
其中，密闭空间的容积可以为100-10000ml,优选为150-1000ml,体积如果过大，容器气体浪费；过小，如低于100ml，则不能保证室内的混合气体能支持胚胎发育的全过程。更优选为150-500ml，在此范围内，即可保证整个发育过程无需更换气体，又节约了气体使用量。特别优选为200-250ml。
其中，供气管在混合气体预热恒温室内设有螺旋段，以保证气体进入培养室之前被加温到所设定的温度。
其中，所述的供气管经过混合气体预热恒温室之后，分为通向培养室的复数个支路，每个支路上设一开关阀，该开关阀可以为手动开关阀或电子开关阀。
其中，培养室的出气阀设于盖板的一端，进气管设于培养室的另一端的底部。
其中，进气管的出气口处设起泡器，以保证均匀湿化后再进入培养室。
其中，混合气室的进气管段设有压力保护装置。
其中，出气阀包括一柱体以及一帽体，该柱体中下部外壁上设有通气凹槽，盖板上设有通孔，通孔周围设一密封圈，出气阀位于该通孔内，当其向下拧紧下压时，帽体和密封圈接触，此时密封；当其向上拧松一距离，使通气凹槽露出上盖时，可通过通气凹槽排气。
其中，盖板的开闭结构如下：盖板的一端侧面设有L形凹槽，凹槽底部设有若干个弹簧，弹簧上设不锈钢垫片，不锈钢垫片上设复数个滚珠；滚珠上设“工”字形卡接件，培养室侧壁上设有卡位凹槽。
本发明提供的又一技术方案如下：
一种用于人类卵子和精子体外授精和胚胎早期发育的培养液，包括如下组分：
为后续描述简要起见，发明人将其命名为YuS培养液。
本发明提供的再一技术方案如下：
一种用于人类卵子和精子体外授精和胚胎早期发育的培养体系，其包括培养装置，所述的培养装置包括：
至少两个恒温培养室，所述的培养室内设一密闭空间，密闭空间的容积至少100毫升，密闭空间内设有放置培养皿的多孔板，多孔板底部设有容纳水的空间；该培养室设有可打开或密封的保温盖板；并设有一进气管以及一出气阀；
一恒温装置，该恒温装置用以提供培养室的恒温环境；
一气体过滤装置；
一混合气体预热恒温室；
供气管，该供气管进口端连接混合气体供气装置，出口端连接培养室的进气管，从混合气体供气装置出口连接的供气管连接气体过滤装置，气体过滤装置的出口的供气管经过混合气体预热恒温室，再进入培养室；混合气体预热恒温室保证气体进入培养室之前温度上升到与培养室里的温度相同。
培养室内可放置一次性培养皿，数量优选为1-2个，内盛有YuS培养液，其成分和浓度如下：
本发明提供了一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系，所述的营养液为自己设计的YuS一程式培养基，可以支持从卵子与精子体外授精以及着床前各个阶段的胚胎发育，不必更换其它培养液，不但提高了胚胎的培养效果，还节约了简化了操作、降低了成本及降低了培养基使用错误的风险。本发明培养装置也可以使用商业化的培养液，如Vitralife公司的G系列序贯培养基，也可以使用其它厂家的一程式培养基，但其授精与胚胎培养时需使用不同的培养液，其中序贯培养基则授精培养液、卵裂胚培养液和囊胚培养液均为不同的培养液，需更换三种不同的培养液才能完成卵子与精子授精、以及着床前各阶段胚胎发育的过程。
现有的开放式培养体系的主要缺点有：
1、培养基中PH值及温度等生理环境参数波动大，降低胚胎在体外发育的质量和发育潜能，从而降低助孕成功率。上述参数波动的原因有两个方面：其一是培养箱中二氧化碳和氧气浓度的控制本身有一个波动值，所以波动是不可避免的；其二是培养箱箱门每次的开和关，会导致箱内气体的外流，气体平衡最少需10分钟以上，完全平衡甚至需要2-4个小时，因此培养基中的PH值和温度不可避免地受到影响。三气培养箱因涉及二氧化碳、氮气和氧气三种气体的平衡，因此开门后所需的气体平衡时间远大于二氧化碳培养箱。随着培养箱开启次数的增多，培养效果会越来越差，甚至导致胚胎退化或死亡。目前的克服办法有两方面：一是尽量少开培养箱的次数，每一台培养箱放一个培养物可以减少开门次数，但是培养箱的利用效率太低，导致需购置数十台培养箱才能基本满足一对一培养的要求，从而导致胚胎培养室大量的空间被挤占，大量的配套设施需跟进、大量人力资源的浪费和管理效率的降低，因此，现实中基本无法做到一对一的培养条件；其二，使用预设混合气体浓度的的培养箱，可以解决开箱后气体平衡的速度问题，因其二氧化碳、氮气和氧气是按指定浓度配置好的，无需培养箱本身来调控，因此闭门时基本上是瞬间即可平衡，又因其此类培养箱体积小，因此解决了培养室空间问题。但该设备系统也是开放式培养体系，培养箱外面环境变化也影响培养箱内的环境稳定，特别是突发事件中的紫外线和室内挥发性有机气体的影响，也不可避免地增加胚胎体外培养的安全风险，甚至导致胚胎死亡；最后是混合气体的不断外泄到实验室内，一方面是浪费了大量珍贵的气体，另一方面大量的二氧化碳和氮气(用于控制氧气浓度的气体)释放到培养室中也是一个安全隐患。
2、目前商业化的培养基需要分别使用授精培养基和胚胎生长等多类型的培养基才能完成整个体外授精和着床前的胚胎发育。序贯培养基则需授精、卵裂及囊胚培养基三种培养基来支持整个授精和培养过程；一程式培养基则需授精和胚胎培养两种培养基来支持培养，这里存在的一个潜在风险是管理风险，即错误使用不同类型的培养基时有可能导致培养失败，特别是对于培养物操作量很大的胚胎培养室，这种操作失误的风险可能会进一步放大；现有商业化培养基由于配方设计原因，在低氧环境中培养效果优于在常态氧浓度下培养，特别是囊胚培养效果差别更为明显，因此均建议使用三气培养箱在低氧环境中培养，进一步加剧了前述设备购置数量及实验室空间利用和管理上的矛盾。
针对以上缺陷，申请人设计了新的培养装置及培养基。
本发明的有益效果：
1、本发明设计了新的培养基配方，命名为YuS(优势系列培养基)，使其在低氧环境及高氧环境下培养效果几乎等同，减少了对三气培养箱的依赖。
2、本发明配方的独特之处在于培养基具有支持人类卵子与精子的体外授精以及完成着床前各阶段的胚胎发育的能力，真正做到了一种培养基支持到底，不但降低了成本、避免了因错误使用培养基导致培养失败的风险。而且结合本发明的密闭式培养装置的使用，可以使胚胎的培养质量显著提高，与开放式培养体系相比其顶级囊胚的形成率以及胚胎的着床能力均可提高10％以上。
3、设计了新的密闭式培养装置。该密闭培养装置包括有多个独立控制的密闭式培养室组成。培养物一旦放入培养室，通气2分钟后即可完全关闭气源，使培养室成为一个完全与室外隔绝的空间，而培养室里的温度和各种气体浓度则维持恒定如一的状态，而不是在一定范围内波动(指气体浓度)的动态平衡当中，从而最大程度地保证了胚胎培养环境的高度稳定。此外，密闭的培养室不受外界任何有害因素的影响，具备抵抗紫外线及有害的挥发性有机物的影响，使胚胎的体外培养十分的安全可靠，同时也避免或大幅降低了传统设备不断泄露气体的弊端或由此带来的安全风险。
4、该设备节省了实验室空间及人力资源和管理成本。本装置因体积小，且每个小培养室均为互不干扰的独立操作单元，因此一台装置相当于数台甚至十余台的普通培养箱的使用效率。本发明装置结合使用YuS培养基后，至观察卵子受精后一直到囊胚形成和移植前均不需开箱更换培养液，不但使胚胎培养的安全性大幅提高外，还简化了培养操作，提高了培养效果。
5、提高了所培养胚胎的质量，优质囊胚形成率及胚胎着床能力，即着床率(Implantationrate)均显著提高。应用本发明的培养基及密闭式培养体系培养的胚胎，其优质囊胚形成率和胚胎着床率提升10％以上，表明与现有的培养体系相比，本体系对胚胎的发育潜能得到了更有效的保护，更有利于胚胎的体外发育。
附图说明
图1为本发明培养装置的结构示意图；
图2为培养室的横切结构示意图；
图3为培养室的纵切结构示意图；
图4为出气阀的结构示意图之一，封闭状态；
图5为出气阀的结构示意图之二，通气状态；
图6为盖板的结构示意图之一，开启状态；
图7为盖板的结构示意图之二，封闭状态。
1-主体2-培养室3-多孔板4-支撑条5-恒温(水浴)区6-搅拌子7-温度计8-出气阀9-进气管10-起泡器11-混合气体预热恒温(水浴)室12-气体过滤室13-混合气体气瓶室14-备用混合气瓶室15-压力保护装置16-螺旋段17-总管18-支管19-开关阀
21-密封盖板22-密封圈23-不锈钢垫片24-弹簧25-滚珠26-卡接件27-卡位凹槽28-旋转销轴
具体实施方式
实施例1
本发明的具体实施例，参照图1至图7，为用于人胚胎早期发育的培养装置的结构示意图。
该培养装置包括一主体1，该主体1内设有三个并列的长方体形密闭培养室2。每个培养室2离底部一距离水平设置一多孔板3，该多孔板3由设置在壁上支撑条4支撑，或多孔板本身自带托架，可免设支撑条。多孔板3底下，用于放水保持培养室内的湿度。
培养室2底部的下方(培养室外周围)设有恒温(水浴)区5，恒温(水浴)区5均匀设有若干个搅拌子6。恒温(水浴)区设有温度计7，其用于显示恒温(水浴)区的温度，恒温(水浴)区5用于使培养室2内部保持恒温状态。
每个培养室2都设有一进气管9以及一出气阀8，进气管9以及出气阀8设于培养室2的对角位置。其中，进气管9的出气口位于培养室底部一角，位置低于多孔板3且低于水面，而出气阀8位于顶部盖板的另一角。其中，进气管9的出气口处设有起泡器10。所述的起泡器10为一筛网，使进入培养室内的气体分散进入水中而充分湿化。
在培养室的侧后上方，设有四个室，从左到右分别为混合气体预热恒温(水浴)室11，气体过滤室12、混合气体瓶室13以及备用混合气瓶室14。混合气体预热恒温(水浴)室11与培养室2周围的恒温(水浴)区5属两个独立的控温区域，分别由两个不同的控温系统控制包括设置、显示、和校准功能及控制面板。
混合气体腔室13设有与混合供气装置连通的管路，在该管路上，还设有用于防止压力过大的压力保护装置15。压力保护装置可以采用如下实施方式，在管路上设有一直径变大的膨大部，该膨大部内设有一滚珠。在压力过大时，滚珠被推向管道膨大部的末端，堵住内径。
混合气体过滤室12配有专用固定接口，用于连接商业化的一次性气体过滤器a，气体经过气体过滤器a过滤后可以进一步除去气体中的各种挥发性有机物。
混合气体预热恒温(水浴)室11内设有水或其它加热装置，在该预热恒温(水浴)室11内，气体管道设有螺旋段16以增大气体加热行程，使管道内的混合气体被加热到设定温度。
备用混合气室14可以放置备用的备用的气体瓶，方便气瓶及时更换。
从混合气体预热恒温(水浴)室11出来的气体管道连接一总管17，该总管17再设三条分别通向三个培养室的支管18，每条支管上设有手动开关阀19。
每个培养室2的顶部设有密封盖板21，该密封盖板21为保温材料和钢板制成，可以打开以放置培养皿，扣紧后即成密封的培养室空间。
参见图2至图5，出气阀8的结构如下：出气阀8包括一柱体以及一帽体，该柱体中下部外壁上设有通气凹槽8-1。盖板2上设有通孔，通孔周围设一密封圈22，出气阀8位于该通孔内，当其向下拧紧时，帽体和密封圈22接触，此时密封；当其向上拧松一距离时，使通气凹槽8-1露出上盖时，可通过通气凹槽8-1排气。
参见图6和图7，盖板21为平推式开闭结构，具体如下：
盖板21的一端侧面设有L形凹槽21-1，凹槽底部设有若干个弹簧24，弹簧24上设不锈钢垫片23，不锈钢垫片23上设复数个滚珠25。滚珠上设“工”字形卡接件26。培养室2侧壁上设有卡位凹槽27。使用时，下压卡接件26，则卡接件26下端左侧的卡接部26-1卡接到卡位凹槽2-1中，或可以从中脱离。
当进气数分钟后即可关闭进气阀和出气阀，使培养室成为与外界完全隔绝的空间，培养室内的气体环境与温度保持高度恒定一致的稳定状态，不受外环境的任何干扰。
当培养室上盖关闭及进和出气阀关闭后培养室内的气体和温度立即恢复恒定。
不同培养室为完全的独立使用和操作，在整个操作过程中互不干扰和影响。
实施例2
本发明的YuS培养基配方如下：
实施例3
本发明的YuS培养基配方如下：
实施例4
本发明的YuS培养基配方如下：
实施例5
体外授精及受精卵培养过程如下：
1、培养基的准备：在取卵前6-12小时，准备两个培养皿，其中一个为双井皿，内放1毫升实施例2中的YuS培养基备用于精子和卵子授精；另一个为常规培养皿或微滴培养皿，用于受精卵到囊胚阶段的培养，其制备方法如下：用YuS培养基制备数个20-30微升的小滴，加数毫升胚胎培养级的石蜡油以防培养基水分蒸发；将培养皿放入设备中培养室的多孔板上，盖紧盖板后通气2分钟后关闭气体进气阀和出气阀即可。
2、取卵后将卵子放入受精皿中，并在皿中加入20-80万条活动精子，授精4-18小时，其中4小时为短时授精方式，18小时为常规过夜授精方式；
3、授精18小时左右取出，常规拆卵，并在显微镜下观察，将正常受精的受精卵转入微滴培养皿中，每个微滴中不超过5个受精卵，同上盖好培养室盖子、通气2分钟，关闭进气和出气阀，如此密闭培养直到移植日或囊胚形成为止，常规移植胚胎。培养期间可以不必更换其它培养基。短时授精则4-5小时后拆卵，确定受精是否成功，如成功则继续放置到次日观察，如同常规过夜授精，挑选正常受精的卵子继续培养至囊胚阶段；如受精失败则立即实施卵胞浆内单精子显微注射术补救授精，次日再同常规过夜授精方式观察并挑选正常受精的卵子继续培养至囊胚阶段。
使用本发明装置及YuS培养基后总体上囊胚培养成功率为94.5％，可用卵裂胚(3级或以上级别)囊胚形成率70.6％，其中顶级囊胚形成率为35.5％，囊胚移植后胚胎着床率69.5％，与常规开放式培养系统相比，顶级囊胚形成率及胚胎着床率均提升10％以上。使用该方法后目前(2014年5月)已有四十多例婴儿出生，均为健康婴儿。

Claims (9)

1.一种用于人类卵子和精子体外授精和胚胎早期发育的培养液，包括如下组分：
2.一种用于人类卵子和精子体外授精和胚胎早期发育的培养体系，其特征在于，包括：
一培养装置，所述的培养装置包括：
至少两个恒温培养室，所述的培养室内设一密闭空间，密闭空间的容积至少100毫升，密闭空间内设有放置培养皿的多孔板，多孔板下方设有容纳水的空间；该培养室设有可打开或密封的保温盖板；并设有一进气管以及一出气阀；
一恒温装置，该恒温装置用以提供培养室的恒温环境；
一用于去除气体中的颗粒杂质及挥发性有机物的气体过滤装置；
一混合气体预热恒温室；
供气管，该供气管进口端连接混合气体供气装置，出口端连接培养室的进气管，从混合气体供气装置的出口连接的供气管连接气体过滤装置，气体过滤装置的出口的供气管经过混合气体预热恒温室，再进入培养室；混合气体预热恒温室保证气体进入培养室之前温度上升到与培养室里的温度相同；
恒温培养室内放置培养皿，其中内含有培养液，其成分和浓度如下：
3.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，供气管在混合气体预热恒温室内设有螺旋段，以保证气体进入培养室之前被加温到所设定的温度。
4.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，所述的供气管经过混合气体预热恒温室之后，分为通向培养室的数个支路，每个支路上设开关阀，该开关阀为手动开关阀或电子开关阀。
5.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，培养室的出气阀设于盖板的一端，进气管设于培养室的另一端的底部。
6.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，进气管的出气口处设起泡器，以保证气体均匀湿化后再进入培养室。
7.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，混合气室的进气管段设有压力保护装置。
8.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，出气阀包括一柱体以及一帽体，该柱体中下部外壁上设有通气凹槽，盖板上设有通孔，通孔周围设一密封圈，出气阀位于该通孔内，当其向下拧紧下压时，帽体和密封圈接触，此时密封；当其向上拧松一距离，使通气凹槽露出上盖时，通过通气凹槽排气。
9.如权利要求2所述的一种用于人类卵子和精子体外授精及胚胎早期发育的培养体系，其特征在于：所述培养装置中，盖板的开闭结构如下：盖板的一端侧面设有L形凹槽，凹槽底部设有若干个弹簧，弹簧上设不锈钢垫片，不锈钢垫片上设复数个滚珠；滚珠上设“工”字形卡接件，培养室侧壁上设有卡位凹槽。
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