CN204474690U - 精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，由二氧化碳细胞培养箱、溶解氧浓度传感器、二氧化碳传感器、氧气浓度传感器、专用细胞培养瓶、氧气浓度控制系统、二氧化碳气瓶和氮气气瓶组成。本实用新型的有益效果为：本实用新型提供的一种精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，通过实时监控培养瓶内培养液溶解氧浓度的变化，进一步反馈调节培养箱氧气的供给，因细胞大量增殖造成的培养液溶解氧浓度降低，则可通过增加培养箱氧气的供给即提高培养箱内的氧气浓度，而实现维持培养液溶解氧浓度的恒定。

Description

精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统

技术领域

本实用新型涉及细胞体外培养技术领域，具体涉及精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统。

背景技术

体外细胞培养是从生物体内取出活的组织（多指组织块）或活细胞（尤其是分散的细胞），接种于特定培养容器内的液态培养基中，其中含有组织或细胞生长繁殖所必需的多种营养成分，并将其放置在模拟特定生物体体内生存环境（恒定的温度、湿度和气体环境）的培养箱内，使之生长、增殖。

在科学研究中，经常需要研究气体环境尤其是缺氧环境对细胞生长、分裂、增殖等过程的影响。缺氧细胞培养的常规方法是控制低氧细胞培养箱（三气细胞培养箱）内气体环境中氧气的浓度处于缺氧水平（低于21%），则箱内细胞培养液溶解氧浓度也将处于缺氧水平，从而实现模拟缺氧细胞培养。由于细胞是浸没在液态培养基中进行培养的，实时监测并调控培养液溶解氧浓度恒定是建立稳定的缺氧细胞培养的关键。传统的低氧细胞培养箱的氧气浓度传感器监测的是培养箱内部气体环境的氧气浓度，而非培养液溶解氧浓度。但是，在细胞培养过程中，由于细胞在培养液中大量增殖，当细胞的耗氧速率超过了培养液的溶氧速率时，则培养液溶解氧浓度降低，此时虽然培养箱内的氧气浓度是恒定的，但是培养液溶解氧浓度已经低于最初细胞培养时的氧浓度，这将导致细胞培养过程中细胞缺氧的程度不恒定，最终将影响实验结果的准确性，尤其在极度缺氧（氧气浓度低于10%，培养液溶氧速率明显降低）时影响更为显著。

此外，影响液体溶解氧浓度的主要因素还包括含盐量、大气压等。常见的基础细胞培养液如MEM、DMEM、RPMI-1640、199细胞培养液等，它们的成分存在差异，尤其是盐分含量不同，造成相同氧气浓度条件下培养液溶解氧的浓度不同，此时如果使用不同的培养液进行细胞培养，虽然设定相同的培养箱氧气浓度，但是培养液溶解氧浓度不同，则细胞缺氧的程度也不同。在开展细胞实验时常常需要往培养液中给药，尤其是大剂量给药人为造成培养液盐分浓度的改变，也可造成相同氧气浓度条件下培养液溶解氧的浓度不同，此时未给药组与给药组细胞的缺氧程度是不同的。而在不同培养阶段细胞新陈代谢产物造成的培养液酸碱度的变化，也可造成培养液溶氧量的差别。另外，实验室所处的海拔高度不同则大气压强亦不同，此时相同的培养液溶解氧浓度也存在差异，因此，不同海拔的实验室虽然设定相同的培养箱氧气浓度，但是由于培养液溶解氧浓度不同，细胞缺氧的程度也不同。由以上因素造成的细胞缺氧程度不同，最终造成实验结果的不一致。

开展缺氧细胞培养实验需要恒定的培养液溶解氧浓度条件，而传统的低氧细胞培养箱显然不能完全保证此条件，只有通过监测并调控培养液中的溶解氧浓度才能保证细胞培养缺氧程度的一致性。因此，有必要研发一种能够精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统。

实用新型内容

本实用新型的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统。

为了实现上述目的，本实用新型提供的技术方案为：精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，所述细胞培养系统由二氧化碳细胞培养箱1、溶解氧浓度传感器3、二氧化碳传感器4、氧气浓度传感器5、专用细胞培养瓶6、氧气浓度控制系统7、二氧化碳气瓶8和氮气气瓶9组成；所述二氧化碳细胞培养箱1内设置有隔板2；所述隔板2上设置有专用细胞培养瓶6，所述专用细胞培养瓶6上设置有传感器电极插孔10；所述溶解氧浓度传感器3的一端插入至传感器电极插孔10内，另一端连接在氧气浓度控制系统7上并由氧气浓度控制系统7控制；所述二氧化碳细胞培养箱1的上部设置有二氧化碳传感器4和氧气浓度传感器5；所述二氧化碳传感器4和氧气浓度传感器5连接在氧气浓度控制系统7上并由氧气浓度控制系统7控制；所述氧气浓度控制系统7分别通过管路11与二氧化碳细胞培养箱1内部、二氧化碳气瓶8和氮气气瓶9连通并控制各气体流量。

进一步的，上述的精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，所述溶解氧浓度传感器3远离专用细胞培养瓶6的一端通过电缆12与氧气浓度控制系统7连接。

进一步的，上述的精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，所述二氧化碳传感器4和氧气传感器5分别通过电缆12与氧气浓度控制系统7连接。

本实用新型的二氧化碳细胞培养箱为市面常见细胞培养箱，具体功能包括：采用水套式或气套式保温，内胆设有风道，装有风机形成强制对流，提高了箱内温度均匀性及二氧化碳、氧气等气体浓度的均衡性；培养箱内温度采用温度控制系统保持恒定；培养箱外配置二氧化碳钢瓶，并通过管路输入到培养箱内，采用二氧化碳浓度控制系统使培养箱内的二氧化碳浓度可在0～20%范围内任意设定。

本实用新型的溶解氧浓度传感器为商品化的专门用于检测液体溶解氧浓度的传感器电极，检测范围为0.00～20.00mg/L，分辨率为0.01mg/L，精度为±0.15mg/L。传感器由电极和电缆组成，工作时电极插入到培养箱内的专用细胞培养瓶电极插座上，且电极浸入到培养液中，并通过电缆与位于培养箱外的氧气浓度控制系统相连接。

本实用新型所使用的专用细胞培养瓶，采用的是公开号CN203530332U的专利所公开的《一种可监测细胞培养液体环境的细胞培养装置》。该细胞培养瓶的形状、大小和制作材料均与传统的细胞培养瓶相似，在远离瓶口的一端有一个内陷式、内壁圆柱形的电极插座，插座内壁向下延伸至距瓶底1cm处，插座入口有橡胶密封圈，并可用高密度聚乙烯材质的塞子盖紧，保证密封不透气。工作时，应保证细胞培养瓶内培养液液面高度至少为8mm，溶解氧浓度传感器电极插入到电极插座内之后可充分浸入到培养液中。

本实用新型的氧气浓度控制系统中主要部件为溶解氧浓度检测器、AT89S51单片机和空气氮气混合器。溶解氧浓度传感器首先将溶解氧浓度信号传送至溶解氧浓度检测器，转变成电流信号，经调理放大、A/D转换后传送至单片机。单片机可进行独立的两种工作模式：工作模式一，设置培养箱氧气浓度百分数，据此控制混合气体比例；工作模式二，设置培养液溶解氧浓度，据此控制混合气体比例。单片机通过LED显示培养箱内实时的氧气浓度百分数和实时的培养液溶解氧浓度。根据已设置的氧气浓度百分数和溶解氧参数，单片机控制空气氮气混合器中的步进电机及气体阀门，实现对空气和氮气等压气体流量的控制。溶解氧平衡程序及自动调控程序：为了尽快稳定至已设定的培养液溶解氧浓度，实际工作中单片机先采用工作模式一，根据理论计算或经验得到的氧气浓度百分数对空气和氮气等压气体流量进行控制，平衡6～24小时后，再开启工作模式二实时监测培养液溶解氧浓度反馈调节功能，如高于设定值，则增加输入到培养箱内的混合气体中空气的比例以增加氧气浓度的百分比，反之则降低。由于氧气溶入到培养液并达到稳定平衡需要一定的时间，因此，自动反馈调节的策略是：控制氧气浓度百分比的增加或降低幅度为0.5%、时间为1小时，如仍未达到预定溶解氧浓度，则继续自动反馈调节，直至达到预定的溶解氧浓度，此过程大约需要6～12小时，之后才能开展细胞低氧培养实验。开展实验期间，细胞开始大量增殖，如果培养液溶解氧浓度发生波动，尤其是溶解氧浓度降低时，反馈调节系统就会自动启动，增加氧气浓度的百分比，以维持恒定的培养液溶解氧浓度。

本实用新型的有益效果为：传统的低氧细胞培养箱或三气细胞培养箱氧分压传感器位于培养箱腔体内，通过调节培养箱氧气浓度恒定而实现固定氧气浓度低氧细胞培养。由于细胞培养过程中，细胞在培养箱内大量增殖，细胞耗氧量不断增大，势必造成培养瓶内培养液溶解氧浓度的局部降低，再加上细胞代谢产物的增多造成培养液溶氧量下降，此时虽然培养箱氧气浓度是恒定的，但是培养液溶解氧浓度已经下降，二者并不同步。

本实用新型提供的一种精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，通过实时监控培养瓶内培养液溶解氧浓度的变化，进一步反馈调节培养箱氧气的供给。如因细胞大量增殖造成的培养液溶解氧浓度降低，则可通过增加培养箱氧气的供给即提高培养箱内的氧气浓度，而实现维持培养液溶解氧浓度的恒定。

附图说明

图1为本实用新型提供的精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统结构示意图。

其中，1为二氧化碳细胞培养箱，2为隔板，3为溶解氧浓度传感器，4为二氧化碳传感器，5为氧气浓度传感器，6为专用细胞培养瓶，7为氧气浓度控制系统，8为二氧化碳气瓶，9为氮气气瓶，10为传感器电极插孔，11为管路，12为电缆。

具体实施方式

实施例1：

精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，如图1所示，由二氧化碳细胞培养箱1、溶解氧浓度传感器3、二氧化碳传感器4、氧气传感器5、专用细胞培养瓶6、氧气浓度控制系统7、二氧化碳气瓶8和氮气气瓶9组成；所述二氧化碳细胞培养箱1内设置有隔板2；所述隔板2上设置有专用细胞培养瓶6，所述专用细胞培养瓶6上设置有传感器电极插孔10；所述溶解氧浓度传感器3的一端插入至传感器电极插孔10内，另一端通过电缆12连接在氧气浓度控制系统7上并由氧气浓度控制系统7控制；所述二氧化碳细胞培养箱1的上部设置有二氧化碳传感器4和氧气传感器5；所述二氧化碳传感器4和氧气传感器5分别通过电缆12连接在氧气浓度控制系统7上并由氧气浓度控制系统7控制；所述氧气浓度控制系统7分别通过管路11与二氧化碳细胞培养箱1内部、二氧化碳气瓶8和氮气气瓶9连通并控制各气体流量。

应用此培养装置的具体实验过程如下：

本实验的目的是开展0.50mg/L溶解氧浓度的低氧细胞培养，细胞为RAW264.7细胞，最后与常氧组细胞进行比较，观察此条件下细胞的糖代谢相关基因转录、蛋白表达的变化差异。

低氧细胞培养箱首先开启工作模式一，设置培养箱氧气浓度百分数为2%，将未接种细胞的可插传感器电极的专用细胞培养瓶置于细胞培养箱内，DMEM培养液液面高度1cm，拧紧瓶盖后再回旋一周以利于瓶内外空气流通，拔除电极插座塞子，将溶解氧传感器电极插入到电极插座内并充分浸入到培养液中。同时，准备若干开展实验所需的普通细胞培养瓶，加入DMEM培养液后，放置在培养箱内平衡溶解氧，备用。平衡12小时后，单片机LED显示的培养液溶解氧浓度为0.57mg/L。此时，开启工作模式二，并设置培养液溶解氧浓度为0.50mg/L。再次平衡12小时后，单片机LED显示的培养液溶解氧浓度为0.50mg/L，此时，单片机LED显示的培养箱氧气浓度百分数为1.9%。随后，即可以开展低氧细胞培养实验。

按实验设计，于细胞培养瓶内分别接种5×10⁵/ml密度的细胞。

要求是：

1、必须取用已进行过0.50mg/L溶解氧平衡的培养瓶；

2、待接种的细胞必须使用已平衡过0.50mg/L溶解氧的DMEM培养液稀释；

3、接种细胞的体积应不超过培养瓶已有培养液体积的10%；

4、操作应迅速，尽量减少吹吸的过程，接种后尽快将培养瓶放入细胞培养箱；

5、可插传感器电极的细胞培养瓶接种操作与普通培养瓶一致，放入培养箱后再次插入溶解氧电极。

继续培养12、24、36、48、60、72小时，分别收获各时间点的细胞，进行后续的糖代谢相关基因转录、蛋白表达的变化差异研究。

最后应说明的是：以上所述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不用于限制本实用新型，尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。

Claims (3)

1.精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，其特征在于，所述细胞培养系统由二氧化碳细胞培养箱、溶解氧浓度传感器、二氧化碳传感器、氧气浓度传感器、专用细胞培养瓶、氧气浓度控制系统、二氧化碳气瓶和氮气气瓶组成；所述二氧化碳细胞培养箱内设置有隔板；所述隔板上设置有专用细胞培养瓶，所述专用细胞培养瓶上设置有传感器电极插孔；所述溶解氧浓度传感器的一端插入至传感器电极插孔内，另一端连接在氧气浓度控制系统上并由氧气浓度控制系统控制；所述二氧化碳细胞培养箱的上部设置有二氧化碳传感器和氧气浓度传感器；所述二氧化碳传感器和氧气浓度传感器连接在氧气浓度控制系统上并由氧气浓度控制系统控制；所述氧气浓度控制系统分别通过管路与二氧化碳细胞培养箱内部、二氧化碳气瓶和氮气气瓶连通并控制各气体流量。

2.根据权利要求1所述的精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，其特征在于，所述溶解氧浓度传感器远离专用细胞培养瓶的一端通过电缆与氧气浓度控制系统连接。

3.根据权利要求2所述的精密控制培养液溶解氧浓度的细胞培养系统，其特征在于，所述二氧化碳传感器和氧气浓度传感器分别通过电缆与氧气浓度控制系统连接。