CN105624083B - 一种高温甲烷菌驯化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高温甲烷菌驯化培养方法，属于微生物培养技术领域。该方法的基本工艺流程为：基础培养基—升温至25℃—接种甲烷菌—升温至35℃—恒温培养—升温至42℃—恒温培养—升温至45℃—升温至55℃—恒温培养。本发明采用四阶段升温，三阶段恒温培养的方法，得到高温驯化培养的甲烷菌；有利于提高高温甲烷菌的数量和活性。直接应用于高温发酵甲烷制备过程中，减少高温发酵的步骤和发酵所用时间，解决了目前高温发酵工程运行耗能高、产气效率低的问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体是一种高温甲烷菌驯化培养方法。
背景技术
沼气发酵过程是一个由多种微生物联合，交替作用的复杂生化过程。在发酵过程中，各种微生物进行一系列耦联生化反应，不产甲烷菌和产甲烷菌之间，相互依赖，又互相制约，在发酵过程中处于平衡状态。一般来讲，微生物生长条件不能发生骤然的变化，常规讲要有一个适应过程，驯化过程应当与原生长条件尽量一致，因此，为了维持一个良好的平衡状态，提高沼气发酵的产气速度和产气量，必须在温度、原料、水分、酸碱度以及发酵系统的密闭性能等方面，为沼气发酵微生物创造一个适宜的环境，提高发酵的效率。其中，温度是影响沼气发酵的一个重要因素，研究高温甲烷菌的培养控制方法，这对于有效地控制发酵过程，了解发酵进行的阶段，优化发酵条件，提高产气效率，具有十分重要的意义。
根据厌氧微生物处理有机物的温度，沼气发酵一般分为三种类型:运行温度为45℃-60℃的高温发酵、运行温度为25℃-45℃的中温发酵、运行温度小于25℃的低温发酵。目前主要研究和应用的是中温和高温发酵，而且对于高温甲烷菌制备沼气，虽然产气高，但是所需耗能大，过程复杂，国内尚无成熟的工艺技术。所以国内大部分沼气工程是处在中温及常温的环境条件下运行。
本发明根据现有技术，对甲烷菌进行高温富集培养，得到培养后的甲烷菌直接接种于沼气发酵液中进行高温发酵，该方法降低菌种培养费用，并保持并激活微生物菌群的活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高温甲烷菌的驯化培养方法，利用分步加热升温的培养方法得到高温甲烷菌种；该方法可减少高温发酵制备沼气的步骤，解决高温发酵制备沼气过程中工程运行耗能高、产气效率低的问题。
根据上述目的提出具体的技术方案：
一种高温甲烷菌的扩增培养方法，其基本工艺流程为：基础培养基—升温至25℃—接种甲烷菌—升温至35℃—恒温培养—升温至42℃—恒温培养—升温至45℃—升温至55℃—恒温培养，其具体步骤为：
(1)在取自河道底层含有甲烷菌的厌氧污泥中加入蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠，加入醋酸调节PH为7.0-7.2，在温度为25℃-32℃条件下，厌氧恒稳培养2-4天；其按重量比为：厌氧污泥:蛋白胨:葡萄糖:乙酸钠＝3：1：0.5：0.5；
(2)根据培养箱容积的1/5-1/4加入基础培养基，培养基PH为6.5-7.5，接着在培养箱中通入氮气排净空气，加热培养基升温至25℃，按照培养基质量的10％接种步骤(1)培养后的含有甲烷菌的混合物，与基础培养基搅拌混合均匀；
(3)将接种甲烷菌的培养基分步加热升温，首先将处于25℃培养基加热按照1天1℃升温培养10天至温度达到35℃，增加培养基同时在35℃条件下恒温厌氧培养5-7天；接着加热按照1天1℃升温培养7天至温度到达42℃，增加培养基并在42℃条件下恒温厌氧培养3-4天；继续加热在一天内升温至45℃，在45℃条件下，增加培养基按照1天1℃升温培养10天，至温度达到55℃，停止升温，并保持55℃恒温条件，增加培养基培养5-8天，至进料量达到满负荷，得到驯化培养的高温甲烷菌，直接接种与高温发酵液，进行高温发酵甲烷的制备过程。
所述基础培养基组成为：污泥、家禽粪便和土豆渣按照1-1000:1-1500:1-2000的比例混合。
所述的污泥为黑色经驯化的厌氧污泥。
所述基础培养基PH优选为7.2。
所述每次增加培养基的量为基础培养基和接种甲烷菌污泥总质量的4％-8％，优选6％。
所述分步加热升温培养过程中以30-50r/min转速连续搅拌。
本发明有益效果在于：(1)本发明首先将菌种逐渐升温至35℃，并进行低温扩增培养，得到低温甲烷菌；再将低温甲烷菌逐渐升温至42℃，进行中温扩增培养，得到中温甲烷菌；接着将中温甲烷菌快速升温至45℃，并继续逐渐升温至55℃，驯化得到高温甲烷菌，同时进行高温培养，得到菌种数量大的高温甲烷菌；(2)与现有技术相比，本发明利用四阶段升温，三阶段恒温培养的方法，得到高温驯化培养的甲烷菌；采用逐渐缓慢升温，有利于提高高温甲烷菌的数量和活性；(3)将驯化好的高温甲烷菌直接应用与高温发酵制备沼气过程中，减少了高温发酵的步骤和发酵所用时间，解决了目前高温发酵工程运行耗能高、产气效率低的问题；(4)本发明步骤简单，操作方便，含菌量大，可提高产气率。
附图说明
图1驯化工艺流程图
图2驯化过程中PH值的变化
图3测定驯化过程中总VFA浓度的变化
具体实施方式
实例1、根据本发明内容，下面提出详细的操作步骤
(1)在取自河道底层含有甲烷菌的厌氧污泥中加入蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠加入醋酸调节PH为7.2，在温度为32℃条件下，进行厌氧恒稳培养2天；其按重量比为：厌氧污泥:蛋白胨:葡萄糖:乙酸钠＝3：1：0.5：0.5。
(2)根据培养箱体积的1/4加入基础培养基，培养基PH为7.2；接着在培养箱中通入氮气排净空气，加热培养基升温至25℃，按照培养基体积的10％接种步骤(1)培养后的含有甲烷菌的混合物，与基础培养基搅拌混合均匀；
所述基础培养基组成为：污泥、家禽粪便和土豆渣按照500:1500:2000的比例混合；
所述的污泥为黑色经驯化的厌氧污泥；
(3)将接种甲烷菌的培养基分步加热升温，首先将处于25℃培养基加热按照1天1℃升温培养10天至温度达到35℃，增加培养基同时在35℃条件下恒温厌氧培养5-7天；接着加热按照1天1℃升温培养7天至温度到达42℃，增加培养基并在42℃条件下恒温厌氧培养4天；继续加热一天内升温至45℃，在45℃条件下，增加培养基按照1天1℃升温培养10天，至温度达到55℃，停止升温，并保持55℃恒温条件，增加培养基培养8天，至进料量达到满负荷，得到驯化培养的高温甲烷菌，直接接种与高温发酵液，进行高温发酵甲烷的制备过程；
所述每次增加培养基的量为基础培养基和接种甲烷菌污泥总质量的6％；
所述分步加热升温培养过程中以50r/min转速连续搅拌。
实例2、
(1)在取自河道底层含有甲烷菌的厌氧污泥中加入蛋白胨、葡萄糖、乙酸 钠，加入醋酸调节PH为7.2，在温度为32℃条件下，进行厌氧恒稳培养4天。其按重量比为：厌氧污泥:蛋白胨:葡萄糖:乙酸钠＝3：1：0.5：0.5；
(2)根据培养箱体积的1/4加入污泥、家禽粪便和土豆渣按照1000:500:500的比例混合基础培养基，培养基PH为7.2；接着在培养箱中通入氮气排净空气，加热培养基升温至25℃，按照培养基体积的10％接种步骤(1)培养后的含有甲烷菌的混合物，与基础培养基搅拌混合均匀；
(3)将接种甲烷菌的培养基分步加热升温，首先将处于25℃培养基加热按照1天1℃升温培养10天至温度达到35℃，增加培养基同时在35℃条件下恒温厌氧培养5-7天；接着加热按照1天1℃升温培养7天至温度到达42℃，增加培养基并在42℃条件下恒温厌氧培养4天；继续加热一天内升温至45℃，在45℃条件下，增加培养基按照1天1℃升温培养10天，至温度达到55℃，停止升温，并保持55℃恒温条件，增加培养基培养8天，至进料量达到满负荷，得到驯化培养的高温甲烷菌，直接接种与高温发酵液，进行高温发酵甲烷的制备过程；
所述每次增加培养基的量为基础培养基和接种甲烷菌污泥总质量的6％；
所述分步加热升温培养过程中以50r/min转速连续搅拌。
试验例
根据实例2驯化方法，在驯化过程中测定PH值和总VFA浓度的变化
(1)测定驯化过程中PH值的变化
如附图说明图2所示，在分步加热升温驯化过程PH值处于6.8-7.3；其PH值的变化趋势是：开始最低为6.8左右，随着时间的推移，PH值会稳定在7.3左右摆动，不再发生变化，PH值的变化曲线越平稳，说明运行越成功。
(2)测定驯化过程中总VFA浓度的变化
如附图说明图3所示：在驯化过程中，VFA的变化趋势是：开始最低为 1000-2000之间，随着时间的推移，VFA值会稳定在3500-4500之间，不再发生变化，曲线越平稳，说明运行越成功。
Claims (5)
1.一种高温甲烷菌驯化培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在取自河道底层含有甲烷菌的厌氧污泥中加入蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠，加入醋酸调节pH为7.0-7.2，在温度为25℃-32℃条件下，厌氧恒稳培养2-4天；其按重量比为：厌氧污泥：蛋白胨：葡萄糖：乙酸钠＝3：1：0.5：0.5；
(2)根据培养箱容积的1/5-1/4加入基础培养基，培养基pH为6.5-7.5，接着在培养箱中通入氮气排净空气，加热培养基升温至25℃，按照培养基质量的10％接种步骤(1)培养后的含有甲烷菌的混合物，与基础培养基搅拌混合均匀，其中，所述基础培养基组成为：黑色经驯化的厌氧污泥、家禽粪便和土豆渣按照1-1000：1-1500：1-2000的比例混合；
(3)将接种甲烷菌的培养基分步加热升温，首先将处于25℃培养基加热按照1天1℃升温培养10天至温度达到35℃，增加培养基同时在35℃条件下恒温厌氧培养5-7天；接着加热按照1天1℃升温培养7天至温度到达42℃，增加培养基并在42℃条件下恒温厌氧培养3-4天；继续加热在一天内升温至45℃，在45℃条件下，增加培养基按照1天1℃升温培养10天，至温度达到55℃，停止升温，并保持55℃恒温条件，增加培养基培养5-8天，至进料量达到满负荷，得到驯化培养的高温甲烷菌，直接接种于 高温发酵液，进行高温发酵甲烷的制备过程。
2.根据权利要求1所述一种高温甲烷菌驯化培养方法，其特征在于：所述基础培养基pH为7.2。
3.根据权利要求1所述一种高温甲烷菌驯化培养方法，其特征在于：所述每次增加培养基的量为基础培养基和接种甲烷菌污泥总质量的4％-8％。
4.根据权利要求3所述一种高温甲烷菌驯化培养方法，其特征在于：所述每次增加培养基的量为基础培养基和接种甲烷菌污泥总质量的6％。
5.根据权利要求1所述一种高温甲烷菌驯化培养方法，其特征在于：所述分步加热升温培养过程中以30-50r/min转速连续搅拌。
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