CN105802868A - 一种混合甲烷菌及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体是一种混合甲烷菌及其培养方法；其组成为：嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照体积比1-3:1-5的比例混合。该方法的目的在于提供一种从污泥中筛选出高效的产甲烷菌，经过驯化直接应用于沼气发酵过程中，解决在沼气发初次发酵过程中，由于自然存在的甲烷菌数量少、产气量低、产气较晚、启动时间慢的问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体是一种混合甲烷菌及其培养方法。
背景技术
当前，随着新农村建设的大力推进，以及养殖业的迅速发展，沼气事业发展出现空前可喜的局面，各种规格(大、中、小型)沼气设施均有了较大的改进，特别是太阳能的应用，让一年四季产沼气成为可能。但是由于各地气候、作物秸秆、畜禽粪便等的原料不同，配料差异很大，加上用户操作技术上的差异，出现产沼气不稳定，春夏秋三季产气不均衡，北方冬季严寒季节不产气等现象，在一定程度上制约了沼气的发展。通过人为添加产甲烷菌剂，以提高并稳定甲烷产生量，业已成为新建沼气池和大型沼气设施的重要措施之一。
目前发现产甲烷菌中甲烷生物合成过程有三种途径：以乙酸为原料的甲烷合成途径、以H2与CO2为原料的甲烷合成途径和以甲基化合物为原料的甲烷合成途径。在厌氧处理过程中，产甲烷菌能够利用产氢产乙酸阶段产生的H2、CO2和乙酸等，合成甲烷。乙酸产甲烷和二氧化碳与氢气产甲烷是厌氧处理过程中两种主要产甲烷过程，分别对应两类产甲烷菌：嗜乙酸产甲烷菌和嗜氢产甲烷菌。由于约70％的有机物经酸化、水解会转化为乙酸，而氢气产生量较少，导致厌氧处理过程中产生的甲烷超过70％来自于乙酸转化，因此嗜乙酸产甲烷菌在传统厌氧消化的产甲烷菌群中占优势，乙酸产甲烷是甲烷化的主要途径。然而，在目前发现的所有产甲烷菌中，仅有2属(八叠甲烷球菌属-Methanosarcinasp.和丝状甲烷菌-Methanothrixsp.)为嗜乙酸产甲烷菌，而有机物水解、酸化的另外两种产物-H2和CO2可以被上述两属产甲烷菌外的其它产甲烷菌所利用，来产生甲烷。
中国专利号CN101705199A公开了一种产甲烷复合菌剂及其制备方法，由嗜乙酸甲烷八叠球菌、甲酸甲烷杆菌、嗜树甲烷短杆菌、延达尔甲烷叶菌、肯氏鬓发甲烷菌通过单独逐级扩大培养后混配而成；专利号CN101921707A公开了一种产甲烷菌剂及其制备技术，以热纤维梭菌、拜氏梭菌、詹氏产甲烷石状菌、沃氏甲烷嗜热杆菌、嗜热甲烷八叠球菌和巴氏甲烷八叠球菌按1-2:1-3：1：1：1：1-4的质量比配合组成；专利号CN102533609A公开了一种沼气干发酵复合菌，按细胞数量百分比包括25％-45％的纤维素分解细菌、9％-15％的蛋白分解细菌、8％-15％的脂肪分解细菌、8％-12％产氢产乙酸细菌、18％-31％的硫酸盐还原菌和2.5％-9.5％的产甲烷古菌；专利号CN101948752A公开了一种用于沼气发酵的复合菌剂，按重量份数比包括8-15份溶纤维素拟杆菌发酵液、12-20份巴氏芽孢梭菌发酵液、30-45份黑海甲烷袋状菌发酵液及20-50份马氏甲烷八叠球菌发酵液混合组成。
本发明通过对甲烷菌筛选，再驯化培养高、中、低温型产甲烷菌加快了沼气产生量，提高了沼气生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从污泥中筛选出高效的产甲烷菌，经过驯化直接应用于沼气发酵过程中，解决在沼气发初次发酵过程中，由于自然存在的甲烷菌数量少、产气量低、产气较晚、启动时间慢的问题。
根据上述目的提出具体的操作方法：
一种混合甲烷菌，其组成为：嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照1-3:1-5的比例混合；
一种混合甲烷菌培养方法，其具体操作步骤如下：
(1)甲烷菌的筛选：在河流、沼泽或湖泊底部采集含有甲烷菌的厌氧活性污泥，将其污泥接种到葡萄糖和蛋白胨组成的培养基中，通入氮气排净空气，在厌氧条件下，保持温度为25-30℃，搅拌速度为30-50r/min，富集培养5-8天；所述厌氧污泥和培养基的体积比为1:3-6；培养过程中每隔10-16小时，按基础培养基的5％-8％增加培养基；所述培养基中葡萄糖与蛋白胨的重量比为：1-3:1-3；
(2)将富集培养后的污泥进行甲烷菌筛选：①将富集培养后的污泥加3-5倍水制成菌悬液，按照培养基体积的12-18％接种到液体培养基中，25℃厌氧培养4-6天，获得菌悬液；再取菌悬液接种到液体培养基中，重复培养3-4次；接着取多次培养后的菌悬液，加无菌厌氧水稀释3-5倍，再接种到固体培养基中，重复培养3-4次，多次分离纯化，得到嗜乙酸产甲烷菌为主的产甲烷菌；②将厌氧污泥接种到甲烷菌筛选液体培养基中，通入直流电，搅拌发酵培养15-20天，培养过程中每3-5天添加一次培养基，得到以嗜氢产甲烷菌为主的混合甲烷菌。
所述液体培养基为：5.4％-7.2％葡萄糖、1.21％-1.35％的乙酸钠、0.01％-0.08％氯化镁、0.01％-0.38％氯化钠、0.06％-0.12％磷酸二氢钾、0.01％-0.05％的氯化铵、1.23％-1.54％硫化钠、0.91％-1.14％甲醇、余量水，pH6.8-7.2；
所述步骤(2)中固体培养基组成为：18％-22％琼脂、1.21％-1.35％的乙酸钠、0.01％-0.08％氯化镁、0.01％-0.38％氯化钠、0.06％-0.12％磷酸二氢钾、0.01％-0.05％氯化铵、1.63％-1.85％碳酸铵、1.23％-1.54％硫化钠、0.91％-1.14％甲醇、余量水，pH6.8-7.2，在121℃，20min灭菌。
一种低温、中温、高温甲烷菌驯化培养方法，其具体操作如下：
低温甲烷菌驯化培养方法：将甲烷菌驯化培养基升温至20℃，按培养基体积的10-12％接种上述筛选得到的混合甲烷菌；边搅拌边缓慢升温至25℃，升温在2-3天内完成，再停止搅拌，按照基础培养基的4-6％增加培养基，保持25℃恒温培养3-6天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷菌；
中温甲烷菌驯化培养方法：将培养基升温至25℃，接着将上述低温驯化得到的低温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至30℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至42℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至45℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的中温甲烷菌；
高温甲烷菌驯化培养方法：将培养基升温至45℃，将上述中温驯化得到的中温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至48℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至50℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至55℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的高温甲烷菌；
所述搅拌速度为：40-60r/min；
所述驯化培养基为：农作物秸秆、落叶杂草、有机垃圾、有机废渣、废水和农副产品加工的下脚料等农业有机废弃物、人和家禽粪便、生活污水、食品加工废物和废水、工业和生活有机废物的一种或多种。
本发明有益效果在于：(1)本发明从在河流、沼泽或湖泊底部采集含有甲烷菌的厌氧活性污泥，并从中筛选异于传统的厌氧处理优势产甲烷菌群的高效产甲烷菌群，所筛选的甲烷菌活菌种群数量大，产气率高；(2)本发明通过菌种驯化培养得到低温、中温、高温甲烷菌，将驯化好的高温甲烷菌直接应用与高温发酵制备沼气过程中，减少了高温发酵的步骤和发酵所用时间，解决了目前高温发酵工程运行耗能高、产气效率低的问题；(3)本发明在菌种驯化培养过程中采用逐渐加热、缓慢升温的方法，有利于提高高温甲烷菌的数量和活性；(4)本发明在菌种驯化培养过程中，以农作物秸秆、落叶杂草、有机垃圾、有机废渣、废水和农副产品加工的下脚料等农业有机废弃物、人和家禽粪便、生活污水、食品加工废物和废水、工业和生活有机废物为培养基，驯化出适合于各种底物发酵的甲烷菌；(5)本发明步骤简单，操作方便，含菌量大，可提高产气率。
具体实施方式
根据本发明内容，下面具体的操作说明；
实例1、一种甲烷菌的筛选方法；
一种甲烷菌的筛选方法，其具体操作步骤如下：
(1)在河流、沼泽或湖泊底部采集含有甲烷菌的厌氧活性污泥，将其污泥接种到葡萄糖和蛋白胨组成的培养基中，通入氮气排净空气，在厌氧条件下，保持温度为25-30℃，搅拌速度为30-50r/min，富集培养5-8天；所述厌氧污泥和培养基的体积比为1:3-6；培养过程中每隔10-16小时，按基础培养基的5％-8％增加培养基；所述培养基中葡萄糖与蛋白胨的重量比为：1-3:1-3；
(2)将富集培养后的污泥进行甲烷菌筛选：①将富集培养后的污泥加3-5倍水制成菌悬液，按照培养基体积的12-18％接种到液体培养基中，25℃厌氧培养4-6天，获得菌悬液；再取菌悬液接种到液体培养基中，重复培养3-4次；接着取多次培养后的菌悬液，加无菌厌氧水稀释3-5倍，再接种到固体培养基中，重复培养3-4次，多次分离纯化，得到嗜乙酸产甲烷菌为主的产甲烷菌；②将厌氧污泥接种到甲烷菌筛选液体培养基中，通入直流电，发酵培养15-20天，得到以嗜氢产甲烷菌为主的混合甲烷菌；
所述液体培养基为：7.2％葡萄糖、1.35％的乙酸钠、0.08％氯化镁、0.01％氯化钠、0.12％磷酸二氢钾、0.05％的氯化铵、1.54％硫化钠、1.14％甲醇、余量水，pH7.2；
所述固体培养基组成为：22％琼脂、1.35％的乙酸钠、0.08％氯化镁、0.38％氯化钠、0.06％磷酸二氢钾、0.01％氯化铵、1.85％碳酸铵、1.23％硫化钠、0.91％甲醇、余量水，pH7.2，在121℃，20min灭菌；
实例2、低温甲烷菌驯化培养方法；
一种混合甲烷菌，其组成为：上述筛选得到的嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照1:1的比例混合，得到混合甲烷菌；
上述甲烷菌的筛选方法，操作步骤与实例1相同
低温甲烷菌驯化培养方法：将甲烷菌驯化培养基升温至20℃，按培养基体积的10-12％接种上述筛选得到的混合甲烷菌；边搅拌边缓慢升温至25℃，升温在2-3天内完成，再停止搅拌，按照基础培养基的4-6％增加培养基，保持25℃恒温培养3-6天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷混合菌；
所述搅拌速度为：40-60r/min；
所述培养基为：农作物秸秆、落叶杂草、人和家禽粪便。
实例3、中温甲烷菌驯化培养方法；
一种混合甲烷菌，其组成为：上述筛选得到的嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照2:1的比例混合，得到混合甲烷菌；
上述甲烷菌的筛选方法，操作步骤与实例1相同
中温甲烷菌驯化培养方法：将培养基升温至25℃，接着将上述低温驯化得到的低温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至30℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至42℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至45℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷混合菌；
所述搅拌速度为：40-60r/min；
所述培养基为：食品加工废物和废水、工业和生活有机废物的一种或多种。
实例4、高温甲烷菌驯化培养方法；
一种混合甲烷菌，其组成为：上述筛选得到的嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照3:5的比例混合，得到混合甲烷菌；
一种甲烷菌的筛选方法，操作步骤与实例1相同；
高温甲烷菌驯化培养方法：将培养基升温至45℃，将上述中温驯化得到的中温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至48℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至50℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至55℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷混合菌；
所述搅拌速度为：40-60r/min；
所述培养基为：农作物秸秆、落叶杂草。
Claims (7)
1.一种混合甲烷菌，其特征在于：其组成为：嗜乙酸产甲烷菌、嗜氢产甲烷菌按照体积比1-3:1-5的比例混合。
2.一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：步骤如下：
(1)甲烷菌的筛选：在河流、沼泽或湖泊底部采集含有甲烷菌的厌氧活性污泥，将其污泥接种到葡萄糖和蛋白胨组成的培养基中，通入氮气排净空气，在厌氧条件下，保持温度为25-30℃，搅拌速度为30-50r/min，富集培养5-8天；所述厌氧污泥和培养基的体积比为1:3-6；培养过程中每隔10-16小时，按基础培养基的5％-8％增加培养基；所述培养基中葡萄糖与蛋白胨的重量比为：1-3:1-3；
(2)将富集培养后的污泥进行甲烷菌筛选：①将富集培养后的污泥加3-5倍水制成菌悬液，按照培养基体积的12-18％接种到液体培养基中，25℃厌氧培养4-6天，获得菌悬液；再取菌悬液接种到液体培养基中，重复培养3-4次；接着取多次培养后的菌悬液，加无菌厌氧水稀释3-5倍，再接种到固体培养基中，重复培养3-4次，多次分离纯化，得到嗜乙酸产甲烷菌为主的产甲烷菌；②将厌氧污泥接种到甲烷菌筛选液体培养基中，通入直流电，搅拌发酵培养15-20天，培养过程中每3-5天添加一次培养基，得到以嗜氢产甲烷菌为主的混合甲烷菌。
3.根据权利要求2所述一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：所述液体培养基为：5.4％-7.2％葡萄糖、1.21％-1.35％的乙酸钠、0.01％-0.08％氯化镁、0.01％-0.38％氯化钠、0.06％-0.12％磷酸二氢钾、0.01％-0.05％的氯化铵、1.23％-1.54％硫化钠、0.91％-1.14％甲醇、余量水，pH6.8-7.2。
4.根据权利要求2所述一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中固体培养基组成为：18％-22％琼脂、1.21％-1.35％的乙酸钠、0.01％-0.08％氯化镁、0.01％-0.38％氯化钠、0.06％-0.12％磷酸二氢钾、0.01％-0.05％的氯化铵、1.63％-1.85％的碳酸铵、1.23％-1.54％硫化钠、0.91％-1.14％甲醇、余量水，pH6.8-7.2，在121℃，20min灭菌。
5.根据权利要求2所述一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：所述的混合甲烷菌接种到驯化培养基，升温至20℃，按培养基体积的10-12％接种，边搅拌边缓慢升温至25℃，升温在2-3天内完成，再停止搅拌，按照基础培养基的4-6％增加培养基，保持25℃恒温培养3-6天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷混合菌。
6.根据权利要求2所述一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：所述的混合甲烷菌接种到驯化培养基，培养基升温至25℃，接着将低温驯化得到的低温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至30℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至42℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至45℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的低温甲烷混合菌。
7.根据权利要求2所述一种混合甲烷菌培养方法，其特征在于：所述的混合甲烷菌接种到驯化培养基，升温至45℃，将中温驯化得到的中温甲烷菌，按培养基体积的10-12％接种到培养基中；边搅拌边缓慢升温至48℃，恒温培养3-6天，再停止搅拌继续缓慢升温至50℃，同时发酵培养2-3天，继续快速升温至55℃，按照基础培养基的4-6％增加培养基，在恒温条件下培养4-8天，得到菌种数量大，产气率高的高温甲烷混合菌。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160727 |