CN108715829A - 一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法 - Google Patents

一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备体外受精培养液，来提高人类体外受精胚胎发育率。其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种，所述的中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为6.0ug/mL、2.0 ug/mL和3.0ug/mL。本发明通过研究标明，在常规培养液中加入中药单体成份黄芩苷制备的受精液，对人类卵母细胞胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药成分的对照组。

Description

一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法
技术领域
本发明属于再生医学领域，具体涉及一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法。
背景技术
受精-胚胎移植(IVF-ET)又称“试管婴儿”，是将体内来源的精子和卵子在试管内发育成受精卵，然后再移植回母体子宫，以达到受孕目的的一种技术。是人类辅助生殖技术的主要手段。IVF技术经历了 30多年的发展，使得哺乳动物卵母细胞的成熟、受精以及胚胎的发育可在体外更加直观的进行研究，并得到了广泛的应用，为不孕不育症患者获得健康的后代作出了巨大贡献。
人类医学界著名的“胎源假说”认为：辅助生殖技术解决了人类诸多生育问题，但体外培养过程人为地引入了大量非生理性的操作，在生命形成过程的初始阶段，最关键、最易受外界影响的受精和胚胎早期发育阶段对生殖过程进行干预，势必会对配子和胚胎发育造成一定的影响。由于体内外发育环境的较大差异，体外培养条件的不适宜，使得人类体外受精(IVF)胚胎体外发育效率及质量远低于体内胚胎。迄今为止，体外受精胚胎的发育率仍然是亟待解决的问题，这主要与卵母细胞体外成熟质量密切相关。目前，体外受精技术主要采用完全成熟的卵母细胞，卵母细胞体外成熟是胚胎体外生产过程的关键环节，因为它决定卵母细胞的质量，影响胚胎的发育。而且人类卵母细胞体外成熟(IVM)体系仍不完善，导致人类卵母细胞的体外成熟质量不高、胚胎发育受阻，制约了其在生殖医学上的研究。
另体外受精胚胎的体外培养也是IVF技术的一个关键环节，也是卵母细胞体外成熟和体外受精技术最终效果的体现和检验。在体外受精后，受精卵在向囊胚发育过程中将需经历一系列重要的变化，包括合子的形成、第一次卵裂、胚胎基因组的激活、致密化以及形成囊胚。这一过程中，外界环境的变化会导致基因表达发生改变，从而影响胚胎的正常发育及质量。目前，哺乳动物早期胚胎的体外培养研究主要集中在改善培养液成分以满足不同发育阶段的胚胎营养需求。
近年来，诸多研究进展证明，中药单体成分有利于促进人类IVF胚胎体外发育，在卵母细胞成熟率、囊胚发育率、胚胎孵化率、孵化胚胎细胞数目和胚胎移植后出生率、成活率及移植效果方面都有显著效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种添加中药单体的人类卵母细胞体外受精液，以研究黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪对人类体外受精胚胎体外发育效果的影响。
为了建立良好的人类胚胎体外培养体系，以体外成熟培养的人类卵母细胞为材料，分别研究中药单体成分黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪对人类体外受精胚胎培养效果的影响。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备受精液，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。其中，当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为4.5-7.5ug/mL；当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为1.25-3.0ug/mL。当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为2.0-3.5ug/mL。
上述方案中，人卵母细胞常规受精液为改良Tyrode's培养液。
本发明进一步提出了上述中药单体在制备用于提高人类体外胚胎发育的卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。
本发明提出了一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，具体实施步骤如下：
1)将卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液中培养30h。
2)将培养成熟的MII卵母细胞置于添加有中药单体的卵母细胞体外受精液中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。
3)当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比) 范围为4.5-7.5ug/mL；当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为1.25-3.0ug/mL。当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比(或体积比)范围为2.0-4.0ug/mL。
4)将处理过的成熟卵母细胞与受选精子在二氧化碳培养箱中共孵育。
5)将受精卵洗涤后，转到预平衡的胚胎培养液中，置于二氧化碳培养箱中培养待移植。
本发明的有益效果在于：
本发明通过在体外受精液中添加中药单体成分黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪，结果证明这些成分对人类胚胎发育具有良好的促进作用，在卵裂率和囊胚发育率等方面均好于未加中药单体的对照组。本试验中黄芩苷添加组能显著提高人类体外受精胚胎发育的囊胚率，表明添加适宜浓度的中药单体成分可提高人类体外受精胚胎的发育率，这可能与中药的抗氧化、抑菌、促进细胞分裂增殖等特性有关，但其确切的调节机制还需要进一步研究。
具体实施方式：
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1制备含有中药单体黄芩苷的人类卵母细胞体外受精液
分别按黄芩苷与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)4.5ug/mL，6.0ug/mL，7.5ug/mL，加入常规培养液，定容至100mL，对应试验组别为(Bai1、Bai2、Bai3)，混匀后，使用0.22μm的微孔滤膜(Millipore)抽滤后存放入4℃冰箱备用。
实施例2制备含有中药单体淫羊藿苷的人类卵母细胞体外受精液
分别按淫羊藿苷(Ica)与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)1.25ug/mL，2.0ug/mL，3.0 ug/mL，对应试验组别为(Ica1、Ica2、Ica3)，制备混合受精液，具体实施方式参考实施例1。
实施例3制备含有中药单体川芎嗪的人类卵母细胞体外受精液
分别按川芎嗪(Lig)与人卵母细胞常规培养液的三种质量比(体积比)2.0ug/mL，3.0ug/mL，4.0 ug/mL，对应试验组别为(Lig1、Lig2、Lig3)，制备混合受精液，具体实施方式参考实施例1。
实施例4制备的含有中药单体的人类卵细胞体外受精液用于人类体外胚胎的培养
步骤一卵子准备
1)使用双腔取卵针以较低的负压(约90mmHg)在B超引导下吸取卵泡中的OCCs。在37℃的热台上将已经吸取在试管中的未成熟OCCs在体式显微镜下仔细找出，并使用斜面转动法初步鉴定卵母细胞是否成熟。
2)将拣出的卵丘卵母细胞复合体(COCs)在预平衡过的卵母细胞成熟液中洗三遍后，放入加有卵母细胞成熟液的四孔板中，四孔板中每孔加入700uLIVM，上覆盖300uL矿物油，于38℃、6％CO2培养箱中培养30h。
3)将培养后的卵丘卵母细胞复合体(COCs)转移至1X透明质酸酶溶液中使用灭菌巴氏吸管吹打数次，使卵丘细胞疏松易剥离，再用140um口径剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小心剥除。
4)在倒置显微镜下确认明显排出极体的MII卵母细胞为成熟的卵母细胞。将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至50uL受精滴中，每滴15枚卵母细胞，并置于含38℃、6％CO2，饱和湿度的恒温培养箱中备用。
步骤二精子准备
1)将原精用精子稀释液以1：4稀释，取出1mL稀释后的精液于39℃烘箱孵育30min，离心(2000r/min， 5min)弃上清，用含0.2％BSA的DPBS洗精液清洗，重复离心，用预热后的mTBM受精液将精子沉淀重悬。
2)然后利用细胞计数板进行计数，并利用受精液调整精子浓度为2×106个/mL。
步骤三体外受精
取10μL浓度为2×106个/mL的精子悬液加入到50μL受精滴中，将成熟卵母细胞与精子在38℃， 6％CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中共孵育8h。
步骤四体外受精胚胎体外培养
将成熟的卵母细胞与精子共培养8h后从受精滴中挑出，然后用预平衡的胚胎培养液将受精卵洗涤3 遍，转到预平衡的胚胎培养液中，每滴500μL移入10枚受精卵，置于38.5℃，5％CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。
实施例5人类体外受精胚胎发育检测
1)检测方法
对体外受精胚胎进行体外培养，分别于受精后48h、156h后观察卵裂率和囊胚发育率。比较了各组人类体外受精早期胚胎的体外发育效果，从而进行中药单体成分最佳浓度的筛选。
2)数据处理
使用SPSS统计软件，对卵裂率和囊胚发育率进行统计分析，数据以均值±标准差(x±s)表示。采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。
3)结果与分析
3-1黄芩苷(Bai)对人类体外受精早期胚胎发育的影响
以改良Tyrode's体外授精液为对照组，以实施例2中的三组体外授精液为试验组(Bai1、Bai2、Bai3)，观察对人类体外胚胎发育的影响，结果见表1。由表1可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Bai2高于其他各组，但并无统计学差异。体外受精胚胎发育至156h囊胚发育率Bai2均高于其他各组，有统计学差异。
表1黄芩苷对人类体外受精早期胚胎发育的影响
分组 重复次数 卵母细胞数(枚) 卵裂胚胎数(枚) 囊胚数(枚) 卵裂率(％) 囊胚形成率(％)
对照 8 200 143 69 71.25 34.45A
Bai1 8 285 213 98 74.68 34.33A
Bai2 8 283 225 120 79.45 42.35B
Bai3 8 280 210 97 75.50 34.60A
注：表格中大写字母表示差异极显著(P＜0.01)
3-2淫羊藿苷(Ica)对人类体外受精早期胚胎发育的影响
以改良Tyrode's体外授精液为对照组，以实施例3中的三组体外授精液为试验组(Ica1、Ica2、Ica3)，观察对人类体外胚胎发育的影响，结果见表2。由表2可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Ica2高于其他各组，有统计学差异。体外受精胚胎发育至156h囊胚发育率Ica1高于其他各组，并无统计学差异。
表2淫羊藿苷(Ica)对人类体外受精早期胚胎发育的影响
注：表格中大写字母表示差异极显著(P＜0.01)
3-3川芎嗪(Lig)对人类体外受精早期胚胎发育的影响
以改良Tyrode's体外授精液为对照组，以实施例3中的三组体外授精液为试验组(Lig1、Lig2、Lig3)，观察对人类体外胚胎发育的影响，结果见表3。由表3可见，体外受精胚胎发育至48h的卵裂率和156h囊胚发育率，Lig2均高于其他各组，但并无统计学差异。
表3川芎嗪(Lig)对人类体外受精早期胚胎发育的影响
分组 重复次数 卵母细胞数(枚) 卵裂胚胎数(枚) 囊胚数(枚) 卵裂率(％) 囊胚形成率(％)
对照 8 205 145 72 70.36 35.06
Lig1 8 295 219 108 74.15 36.39
Lig2 8 290 223 113 76.45 38.48
Lig3 8 292 220 110 75.17 37.98
结果表明：体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Bai2高于其他各组，但并无显著差异。体外受精胚胎发育至156h囊胚发育率Bai2均高于其他各组，有显著差异。体外受精胚胎发育至48h的卵裂率Ica2高于其他各组，有显著差异。体外受精胚胎发育至156h囊胚发育率Ica1高于其他各组，无显著差异。体外受精胚胎发育至48h的卵裂率和156h囊胚发育率，Lig2均高于其他各组，但并无显著差异。鉴于以上试验结果，可以得出如下结论：在改良Tyrode's培养液中添加最佳浓度的黄芩苷能显著提高人体外受精胚胎的发育率。

Claims (7)

1.一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法，其特征在于，在人类卵母细胞常规培养液中加入中药单体制备一种体外授精液，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，所述的中药单体在制备用于提高人类体外胚胎发育的卵母细胞体外受精液中的应用，其中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为4.5-7.5ug/mL。
4.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为1.25-3.0ug/mL。
5.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为2.0-3.5ug/mL。
6.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，所述的人卵母细胞常规受精液为改良Tyrode's 培养液。
7.根据权利要求1所述的一种提高人类体外胚胎发育率的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
1）将卵丘卵母细胞复合体（OCCS）在预平衡过的卵母细胞成熟液中培养30h;
2）将培养成熟的MII卵母细胞置于添加有中药单体的卵母细胞体外受精液中，所述的中药单体为黄芩苷、淫羊藿苷和川芎嗪中的任意一种;
3）其中，当所述的中药单体为黄芩苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为4.5-7.5ug/mL；当所述的中药单体为淫羊藿苷时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为1.25-3.0ug/mL，
当所述的中药单体为川芎嗪时，所述中药单体与人类卵母细胞常规培养液的质量比（或体积比）范围为2.0-3.5ug/mL;
4）将处理过的成熟卵母细胞与受选精子在二氧化碳培养箱中共孵育;
5）将受精卵洗涤后，转到预平衡的胚胎培养液中，置于二氧化碳培养箱中培养待移植。
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