CN115287253A - 木蝴蝶苷a或其类似物在制备提高体外胚胎质量产品中的应用 - Google Patents

木蝴蝶苷a或其类似物在制备提高体外胚胎质量产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于体外胚胎技术领域，涉及哺乳动物植入前胚胎体外培育技术。本发明提供了木蝴蝶苷A或其类似物在制备提高体外胚胎质量和发育能力产品中的应用及提高体外胚胎发育能力的产品，木蝴蝶苷A或其类似物在提高体外胚胎质量中的应用及提高体外胚胎发育能力的方法。本发明发现木蝴蝶苷A或其类似物能提高体外胚胎培养的囊胚率，保护体外胚胎细胞的线粒体功能，提高体外胚胎细胞的增殖能力，从而有效提高体外胚胎质量和发育能力。

Description

木蝴蝶苷A或其类似物在制备提高体外胚胎质量产品中的 应用
技术领域
本发明属于体外胚胎技术领域，涉及哺乳动物植入前胚胎体外培育技术，具体涉及木蝴蝶苷A或其类似物在制备提高体外胚胎质量和发育能力的产品中的应用。
背景技术
体外胚胎生产是胚胎工程技术的关键环节，是用于畜牧业、人类辅助生殖技术和植入前胚胎发育机制研究的一项关键技术[1]。体外胚胎生产主要包括体外受精和体外胚胎培养。体外胚胎培养是在体外将激活的卵母细胞培养成囊胚的过程[2]。卵母细胞的激活分为3种：自发激活(常见于行孤雌生殖的动物和老化卵母细胞)、精子激活(自然条件下有性生殖动物的精卵结合)和人工激活。通过人工模拟自然条件下卵母细胞的激活机理，在体外也可以通过各种理化刺激使处于MII期的卵母细胞激活，即为卵母细胞的人工孤雌激活。孤雌活化卵母细胞在一定的培养条件下可以开始卵裂并发育，期间经历2-细胞、4-细胞、8-细胞、16细胞、桑葚胚阶段，最后发育至囊胚。顺利发育至囊胚阶段是非常关键的一步，囊胚具有紧密排列的滋养层和松散排列的内细胞团，一般在卵母细胞激活后的第5至7天才形成囊胚，只有质量好的胚胎才能发育成为囊胚，通过囊胚移植能更好地提高胚胎植入率。在体外胚胎生产期间，植入前胚胎的质量会影响后续的胚胎植入和早期胎儿发育。即使目前技术的体外胚胎培养系统已经尽可能地模拟体内胚胎发育的微环境，但是体外生产的胚胎发育能力和发育质量依然无法达到体内生产的水平，出现囊胚率低[3]，胚胎质量下降，胚胎植入后妊娠率低等问题。
为了解决这些问题，一些现有技术通过在体外胚胎培养过程中将胚胎聚集的技术来提高体外胚胎的质量和发育能力，但是利用胚胎聚集技术增强体外胚胎质量和发育能力的效果因物种而异，例如已经有报道该技术不能改善克隆牛胚胎和马种间体细胞核移植胚胎的发育[4,5]。还有报道通过优化体外胚胎培养的培养基成分也可以提高体外胚胎的发育能力，例如在培养基中添加输卵管液和褪黑素；然而，输卵管液是一个高度动态的微环境，它受到广泛而复杂的不同效应器和影响变量的调节，需要根据胚胎不断变化的发育过程不断优化调整输卵管液成分，操作复杂，难以控制；褪黑素首关效应大，口服生物利用度较低，需要较大剂量才能起作用，而大量应用褪黑素会扰乱内分泌系统，存在一定局限性[3,6]。目前迫切需要寻找新的药物，改善体外胚胎培养基的成分，以提高体外胚胎的发育能力和质量。
中国专利CN 104586873 A公开了木蝴蝶苷A在制备治疗癌症药物中的应用，证实木蝴蝶苷A有抑制肿瘤血管生成的作用，能够明显抑制肿瘤细胞的增殖和生长，诱导肿瘤细胞呈衰老样死亡、周期阻滞和细胞凋亡，抑制肿瘤细胞粘附、迁移、侵袭和血管生成；对荷瘤小鼠肿瘤的生长具有很好的抑制作用。然而，并未见关于木蝴蝶苷A在制备提高体外胚胎质量和发育能力产品中的应用。
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发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎质量和发育能力产品中的应用。木蝴蝶苷A(Oroxin A)，也称黄芩素-7-O-葡萄糖苷(Baicalein 7-O-glucoside)，是从天然木蝴蝶中提取获得的黄酮类化合物，其具有如下化学结构式：
Figure BDA0003764716350000021
申请人惊讶地发现该成分在早期植入前胚胎中具有提高囊胚率，保护线粒体功能以及提高细胞增殖能力的作用，从而提高体外胚胎培养质量以及发育能力，有利于体外胚胎培养。
本发明的第一方面，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎质量产品中的应用。根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎发育能力产品中的应用。
根据本发明的一些具体实施例，如通过检测/计算体外胚胎的囊胚率、细胞线粒体膜电位和/或总细胞数以及EdU阳性细胞率所证明的，木蝴蝶苷A和/或其类似物提高了体外胚胎的质量以及发育能力。
根据本发明的一些实施例，通过检测/计算体外胚胎的囊胚率来评价体外胚胎的质量以及发育能力。
根据本发明的一些实施例，通过检测/计算体外胚胎细胞的线粒体膜电位来评价体外胚胎的质量以及发育能力。线粒体是动植物细胞生成ATP的主要地点，是促进细胞能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器。线粒体在产生能量时会将电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧，质子及其他离子浓度的不对称分布就会形成线粒体膜电位。正常的线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，线粒体膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能；线粒体膜电位的降低是线粒体功能下降的表现之一，不健康的线粒体其膜电位会下降或丧失，因此线粒体膜电位是评价细胞线粒体功能的重要指标之一。
根据本发明的一些实施例，通过检测/计算体外胚胎细胞的增殖能力来评价体外胚胎的质量以及发育能力，其中可以通过检测/计算体外胚胎总细胞数、EdU阳性细胞率来评价体外胚胎细胞的增殖能力。EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷)是一种含有一个乙炔基团的胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，当将其对体外培养的细胞进行孵育，这些小分子能够迅速渗入到细胞中，可以在细胞增殖时期代替胸苷(T)掺入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基团能与荧光标记的叠氮化合物探针在铜离子催化下发生“点击”反应形成稳定的三唑环，可以使新合成的DNA被相应的荧光探针所标记，使用适当的荧光检测设备可以检测到增殖的细胞，从而通过计算EdU阳性细胞率(EdU阳性细胞数与总细胞数的比率)来评价细胞的增殖能力。
根据本发明的一些实施例，所述提高体外胚胎发育能力包括提高体外胚胎囊胚率、提高体外胚胎细胞线粒体膜电位、提高体外胚胎总细胞数和/或体外胚胎EdU阳性细胞率。
在一些实施例中，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎囊胚率。优选地，如通过体外胚胎囊胚率测试所验证的，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品使体外胚胎囊胚率提高了20％-45％。
具体地，在本发明的一些实施例中，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品使体外胚胎囊胚率提高了21％-41％。在本发明的一些具体实施例中，施用本发明产品使体外胚胎囊胚率至少提高了约40％。在本发明的另一些实施例中，施用本发明产品使体外胚胎囊胚率提高至30-55％；优选地，施用本发明产品使体外胚胎囊胚率提高至35-50％，更优选地，至少提高至约46％。
在一些实施例中，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎细胞线粒体膜电位。优选地，如通过体外胚胎细胞线粒体膜电位测试所验证的，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品提高了体外胚胎细胞线粒体膜电位的25％-35％。
具体地，在本发明的一些实施例中，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品使体外胚胎细胞线粒体膜电位提高了30-35％。在本发明的一些具体实施例中，施用本发明产品使体外胚胎细胞线粒体膜电位至少提高了约34％。
在一些实施例中，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎总细胞数。优选地，如通过体外胚胎总细胞数测试所验证的，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品提高了体外胚胎总细胞数的10％-20％。
具体地，在本发明的一些实施例中，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品使体外胚胎总细胞数提高了13％-18％。在本发明的一些具体实施例中，施用本发明产品使体外胚胎总细胞数至少提高了约17％。
在一些实施例中，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎EdU阳性细胞率。优选地，如通过体外胚胎EdU阳性细胞率测试所验证的，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品提高了体外胚胎EdU阳性细胞率的10％-20％。
具体地，在本发明的一些实施例中，相对于未施用本发明产品的情况，施用本发明产品使体外胚胎EdU阳性细胞率提高了13％-18％。在本发明的一些具体实施例中，施用本发明产品使体外胚胎EdU阳性细胞率至少提高了约15％。在本发明的另一些实施例中，施用本发明产品使体外胚胎EdU阳性细胞率提高至50％-60％；优选地，施用本发明产品使体外胚胎EdU阳性细胞率提高至50％-55％，更优选地，至少提高至约52％。
在关于提高体外胚胎发育能力效果的数值的上下文中，所使用的“提高至”的数值为施用本发明产品情况下的测量值。在关于提高体外胚胎发育能力效果的数值的上下文中，所使用的“提高了”的数值通过以下方式计算：[(施用本发明产品的测量值)-(未施用本发明产品的测量值)]/(未施用本发明产品的测量值)。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎囊胚率产品中的应用。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎细胞线粒体膜电位产品中的应用。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎细胞增殖能力产品中的应用。根据本发明的另一些具体实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎总细胞数产品中的应用。根据本发明的一些具体实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎EdU阳性细胞率产品中的应用。
优选地，该产品包括药物组合物、培养基、试剂盒。
优选地，该体外胚胎包括哺乳动物体外胚胎。优选地，该哺乳动物包括但不限于人类、家养动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物(如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、骆驼、野牛、家牛、奶牛)、灵长类动物(如猿、猴子、猩猩和黑猩猩)、犬科动物(如狗和狼)、猫科动物(如猫、狮子和老虎)、马科动物(如马、驴和斑马)、食用动物(如奶牛、猪和羊)、有蹄类动物(如鹿和长颈鹿)，以及啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)。在优选的实施例中，该哺乳动物包括猪。
优选地，该哺乳动物体外胚胎包括哺乳动物的体外孤雌激活胚胎、哺乳动物体外受精胚胎。优选地，该哺乳动物体外胚胎包括孤雌激活卵母细胞、受精卵细胞以及由孤雌激活卵母细胞和/或受精卵细胞发育而成的2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚和囊胚。
本发明的第二方面，提供了一种用于提高体外胚胎发育能力的产品，该产品包括木蝴蝶苷A和/或其类似物。
优选地，该木蝴蝶苷A类似物包括木蝴蝶苷B(Oroxin B)、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷(Oroxylin A 7-O-glucuronide)。
优选地，该提高体外胚胎发育能力的产品包括药物组合物、培养基、试剂盒。
优选地，该药物还包括药学上可接受的辅料。优选地，该辅料包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、载体、粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。该药物可以是多种形式，例如液体、半固体和固体剂型。在本发明的另一些实施例中，该药物的形式包括液体溶液(例如可注射和可输注的溶液)、喷雾剂、分散体或混悬剂。在本发明的一些具体实施例中，该药物为液体溶液。
优选地，该培养基还包括基础培养基、无机盐、溶剂、抗生素、有利于体外胚胎细胞发育的营养功能因子。
优选地，该基础培养基包括TCM-199培养基、PZM-5培养基、CR1-aa培养基、Ham’SF10培养基、Ham’S F12、NCSU-37培养基、NCSU-23培养基。
优选地，该无机盐包括氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、碳酸氢钠。
优选地，该抗生素包括庆大霉素、青霉素、链霉素、卡那霉素。
优选地，该有利于体外胚胎细胞发育的营养功能因子包括激素、能量底物、氨基酸、生长因子。
根据本发明的一些实施例，该激素包括促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、孕马血清促性腺素(PMSG)、雌二醇(E2)。
根据本发明的一些实施例，该能量底物包括葡萄糖、丙酮酸盐、乳酸盐。
根据本发明的一些实施例，该氨基酸包括必需氨基酸、非必须氨基酸。根据本发明的一些具体实施例，该氨基酸包括L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-盐酸精氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐、L-盐酸组氨酸一水物、L-赖氨酸盐酸盐。
根据本发明的一些实施例，该生长因子包括表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)。
本发明的第三方面，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎质量中的应用。优选地，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎发育能力中的应用。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎囊胚率中的应用。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎细胞线粒体膜电位中的应用。
根据本发明的一些实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎细胞增殖能力中的应用。根据本发明的另一些具体实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎总细胞数中的应用。根据本发明的一些具体实施例，提供了木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎EdU阳性细胞率中的应用。
优选地，该体外胚胎包括哺乳动物体外胚胎。优选地，该体外胚胎包括哺乳动物的体外孤雌激活胚胎。更优选地，该体外胚胎包括猪的体外孤雌激活胚胎。更优选地，该体外胚胎包括猪的体外孤雌激活卵母细胞。
本发明的第四方面，提供了一种用于提高体外胚胎发育能力的方法，其包括以下步骤：
向体外胚胎施加有效量的木蝴蝶苷A和/或其类似物。
该方法可用于非治疗目的。具体地，该方法可以用于科学研究，例如体外细胞培养研究、体外胚胎培养研究以及植入前胚胎发育机制研究等。
根据本发明的一些实施例，该方法包括如下步骤：
S1.向体外胚胎施加有效量的木蝴蝶苷A和/或其类似物；
S2.培养体外胚胎直至囊胚期。
优选地，有效量的木蝴蝶苷A和/或其类似物可以以本发明第一方面实施例制得或者第二方面实施例的产品的形式施用。
优选地，S1中木蝴蝶苷A和/或其类似物可在体外胚胎发育至囊胚阶段期间的任何时间点施加，包括卵母细胞经孤雌激活后，精卵受精后，以及发育至2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、桑葚胚、囊胚阶段的任何时间点。
优选地，S1中木蝴蝶苷A和/或其类似物可以施用一次，但更优选地施用多次。根据本发明的一些实施例，木蝴蝶苷A和/或其类似物可以从每天施用一次至每周施用一次。具体地，木蝴蝶苷A和/或其类似物可以每天施用一次、每两天施用一次、每三天施用一次、每四天施用一次、每五天施用一次、每六天施用一次、每周施用一次。
优选地，S1中该有效量为0.2-10μmol/L，更优选地为0.4-7.5μmol/L，最优选地为0.5-3.5μmol/L。如本说明书和在权利要求中使用的术语“有效量”是指与未施用该化合物的情况相比，施用足以提供预期效果的化合物的量，该量按所施加的二氢杨梅素和/或其衍生物的质量与所施加液体环境(例如培养基)的体积计；该预期效果包括显著提高体外胚胎囊胚率，和/或显著提高体外胚胎细胞线粒体膜电位，和/或显著提高体外胚胎细胞增殖能力，该提高体外胚胎细胞的增殖能力包括提高体外胚胎总细胞数和/或EdU阳性细胞率。显著提高体外胚胎的囊胚率是指与未施用该化合物的情况相比，体外胚胎囊胚率提高了20％-45％，优选地提高了21％-41％，更优选地提高了至少约40％。显著提高体外胚胎细胞线粒体膜电位是指与未施用该化合物的情况相比，体外胚胎细胞线粒体膜电位提高了25％-35％，优选地提高了30％-35％，更优选地提高了至少约34％。显著提高体外胚胎细胞的增殖能力是指与未施用该化合物的情况相比，体外胚胎总细胞数提高了10％-20％，优选地提高了13％-18％，更优选地提高了至少约17％；和/或体外胚胎EdU阳性细胞率提高了10％-20％，优选地提高了13％-18％，更优选地提高了至少约15％。
优选地，S2中培养温度为36-40℃，培养时间为40-50h。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开了木蝴蝶苷A或其类似物在制备提高体外胚胎发育能力药物中的应用，此前未见报道木蝴蝶苷A或其类似物与体外胚胎发育能力相关，拓展了木蝴蝶苷A或其类似物的应用范围。
木蝴蝶苷A或其类似物可以通过提高囊胚率，有效保护线粒体功能，提高细胞增殖能力，从而有效提高体外胚胎的发育质量以及发育能力。
木蝴蝶苷A是传统中药木蝴蝶的黄酮类天然提取物，对哺乳动物细胞无毒副作用，来源广泛，容易获得，在培养基中添加木蝴蝶苷A或其类似物，操作简单，易于控制，效果显著。
木蝴蝶苷A或其类似物可用于制备促进胚胎发育的药物组合物、培养基或试剂盒等，具有良好的工业应用前景。
附图说明
结合以下附图对实施例进行描述，将使本发明的上述和/或附加的方面和优点变得明显和容易理解，其中：
图1显示了实施例2中不同浓度木蝴蝶苷A对体外胚胎囊胚率的影响；数据表示为平均值±标准误；n＝6次独立的平行试验；显著性差异表示为：*P<0.05，***P<0.001。
图2显示了实施例3中木蝴蝶苷A对体外胚胎线粒体功能的影响，显示了对照组与实验组胚胎的JC-1相对荧光强度水平(红色/绿色荧光)的定量；数据表示为平均值±标准误；n＝3次独立的平行试验；显著性差异表示为：***P<0.001。
图3显示了实施例4中木蝴蝶苷A对体外胚胎细胞增殖能力的影响。其中，图3A显示了对照组与实验组体外胚胎的EdU阳性细胞率；图3B显示了对照组与实验组的体外胚胎总细胞数；数据表示为平均值±标准误；n＝5次独立的平行试验；显著性差异表示为：**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
材料样品预处理
1.猪卵母细胞的收集：
从屠宰场收集来自青春期前小母猪的卵巢，置于37℃的0.9％生理盐水中运送至实验室。用注射器吸出卵巢中直径3-6mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合物(oocyte-cumuluscomplex，COC)和卵泡液，置于摇菌管中，并在38℃水浴锅中静置15min，直至COC沉淀至管底，。弃除上清液。加入适量含0.1％(w/v)聚乙烯醇(PVA，SIGMA，P8136)和0.05g/L庆大霉素(SIGMA，E003632)的HEPES缓冲液(SIGMA，H6147)重悬沉淀，静置15min后弃除上清液，重复该步骤三次。将COC沉淀移至培养皿中，加入适量HEPES缓冲液，在体式显微镜下用玻璃吸管挑选卵母细胞的胞质均匀且卵母细胞周围有三层及以上致密卵丘细胞的COC。
2.猪卵母细胞的体外成熟：
将挑选出来的COC用成熟培养基IVM洗涤三次；该成熟培养基IVM为：在TCM-199(GIBCO，11150-059)中加入0.1g/L丙酮酸钠(SGMA，P4562)、0.6mmol/L L-半胱氨酸(SIGMA，C7477)、10ng/mL表皮生长因子(SIGMA，E4127)、10％猪卵泡液、10IU/mL黄体生成素(宁波第二激素厂)、10IU/mL卵泡刺激素(宁波第二激素厂)。在4孔培养皿中加入500mL成熟培养基IVM，用500mL矿物油覆盖培养基，然后将洗涤三次的COC置于成熟培养基IVM中。将4孔培养皿置于38.5℃，5％CO2，湿度饱和的培养箱中培养44h，44h后卵母细胞成熟，达到MⅡ期。
3.猪卵母细胞的孤雌激活：
用移液枪将达到MⅡ期的COC移至0.125％的透明质酸酶中，反复吹打，去除卵母细胞周围的卵丘细胞，得到裸露的卵母细胞。将裸露卵母细胞移至297mmol/L(mM)甘露醇(pH7.2，SIGMA，M9546)溶液中，该甘露醇溶液含有0.1mM CaCl2(SIGMA，C7902)、0.05mMMgSO4(SIGMA，M1880)、0.01％(w/v)PVA、0.5mM HEPES。通过每次60μs的电场强度为1.2kV/cm的直流脉冲，一共进行两次，对裸露卵母细胞进行孤雌激活。
实施例1向猪体外孤雌激活胚胎施加木蝴蝶苷以及体外胚胎培养：
1.经孤雌激活的卵母细胞在猪胚胎体外培养基(其中含有7.5mg/mL的细胞松弛素B)中培养3h。其中，该猪胚胎体外培养基由以下成分组成：108mmol/L(mM)氯化钠(sigma，S5886)、10mM氯化钾(sigma，P5405)、0.35mM磷酸二氢钾(sigma，P5655)、0.4mM硫酸镁(sigma，M2643)、25mM碳酸氢钠(sigma，S5761)、0.2mM丙酮酸钠(sigma，P5280)、2.0mM乳酸钙(sigma，C8356)、2.0mM谷胱甘肽(sigma，G8540)、5.0mM亚牛磺酸(sigma，H1384)、20ml/L必需氨基酸(sigma，B6766)、10mL/L非必需氨基酸(sigma，M7145)、25mg/mL庆大霉素(sigma，B6766)、4mg/mL牛血清白蛋白(sigma，A8806)，加超纯水定容至1L。
2.去除培养基，向孤雌激活的卵母细胞施加包含木蝴蝶苷A的猪胚胎体外培养基(向步骤1的培养基配方加入木蝴蝶苷A)，设置3个实验组，分别添加0.5、2.5、25μmol/L(μM)木蝴蝶苷A；设置1个对照组，向孤雌激活的卵母细胞施加不包含木蝴蝶苷A的猪胚胎体外培养基。
3.卵母细胞置于38.5℃，5％CO2，湿度饱和的培养箱中培养7天，期间不需更换培养基。
实施例2木蝴蝶苷A在提高体外胚胎囊胚率中的应用
猪体外孤雌激活胚胎的囊胚率测试：实施例1的卵母细胞体外培养至第7天，观察对照组与3个实验组的囊胚率，囊胚率＝(形成的囊胚数/所有培养的早期孤雌胚胎数)×100％。
结果如图1所示，相对于对照组，猪胚胎体外培养基中添加0.5μmol/L(μM)与2.5μM的木蝴蝶苷A均能显著提高猪体外孤雌激活胚胎的囊胚率，其中对照组的囊胚率为32.87％；木蝴蝶苷A的浓度为0.5μM时，囊胚率为40.21％，显著高于对照组(P<0.05)，比对照组提高了22.33％；浓度为2.5μM时，囊胚率为可达到45.83％，显著高于对照组(P<0.001)比对照组提高了39.43％。然而，当木蝴蝶苷A的浓度为25μM时，囊胚率为27.15％，还显著低于对照组(P<0.001)。
在培养基中添加特定浓度(0.5-2.5μM)的木蝴蝶苷A，有助于促进孤雌激活的卵母细胞顺利发育至囊胚。卵母细胞经激活后能否顺利发育至囊胚是体外胚胎培养的关键，只有具有良好发育能力和发育质量的早期胚胎才能发育至囊胚，而后续使用囊胚进行体内移植则能提高胚胎植入率。可见，木蝴蝶苷A能提高植入前早期胚胎的发育能力与发育质量，为胚胎植入奠定良好基础，同时也表明木蝴蝶苷A在制备提高体外胚胎囊胚率产品中具有良好的应用前景。
实施例3木蝴蝶苷A在提高体外胚胎细胞线粒体膜电位中的应用
猪体外孤雌激活胚胎细胞的线粒体膜电位测试：
实验组(实施例1中木蝴蝶苷A添加量为2.5μM)与对照组(实施例1中不添加木蝴蝶苷A)的卵母细胞体外培养至猪早期孤雌胚胎的4-细胞阶段，用PBS缓冲液洗涤4-细胞3次，在含有0.5mmol/L(mM)的5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基亚氨基羰基花青碘化物(JC-1)的培养基中，置于38℃，5％CO2的培养箱中孵育30min。使用荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)拍摄图像。用Image J软件分析图像，膜电位计算为红色荧光(对应于活性的线粒体(J聚集体))与绿色荧光(对应于低活性线粒体(J单体))的比率。对照组的荧光强度设置为1，计算处理组相对于对照组的相对荧光强度。
结果如图2所示，对4-细胞阶段胚胎进行JC-1染色测定线粒体膜电位，木蝴蝶苷A处理组(2.5μM)的线粒体膜电位显著高于对照组(P<0.001)，具体为对照组的1.33倍，相对于对照组提高了33％；其中线粒体膜电位是评价线粒体功能的重要指标之一，线粒体膜电位的降低是线粒体功能下降的表现之一，不健康的线粒体其膜电位会下降或丧失。因此，以上结果表明培养基中加入2.5μM木蝴蝶苷A可以有效提高线粒体膜电位以及保护线粒体功能，从而提高早期胚胎的发育质量与发育能力。同时也表明木蝴蝶苷A在制备提高体外胚胎细胞线粒体膜电位产品中具有良好的应用前景。
实施例4木蝴蝶苷A在提高体外胚胎细胞增殖能力中的应用
猪体外孤雌激活胚胎细胞增殖能力的测试：采用BeyoClick EdU-647细胞增殖检测试剂盒(Beyotime)对猪体外孤雌胚胎总细胞数以及EdU阳性细胞率进行检测：
实验组(实施例1中木蝴蝶苷A添加量为2.5μM)与对照组(实施例1中不添加木蝴蝶苷A)的卵母细胞体外培养至第6天，将猪孤雌激活体外胚胎置于含有10mM EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine，5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷)的猪胚胎体外培养基(培养基其他组分同实施例1)中，在38℃，5％CO2的培养箱中培养10h。用3.7％多聚甲醛固定猪体外胚胎30min，然后用0.5％Triton X-100透化30min，然后用2％BSA在37℃下封闭1h。用PBS-PVA洗涤3次后，将猪体外胚胎与BeyoClick添加剂溶液在室温下避光孵育30min。将猪体外胚胎与10mg/mL DNA荧光染料Hoechst 33342在室温下避光孵育10min以标记细胞核。使用荧光显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)拍摄图像。用Image J软件分析图像，统计猪体外胚胎的EdU阳性细胞数以及总细胞数，计算EdU阳性细胞率：EdU阳性细胞率＝(EdU阳性细胞数/总细胞数)×100％。
结果如图3所示，图3A显示木蝴蝶苷A处理组(2.5μM)的EdU阳性细胞率显著高于对照组(P<0.01)，其中对照组为45.37％，处理组为51.88％，处理组的EdU阳性细胞率相对于对照组提高了14.35％。图3B显示木蝴蝶苷A处理组(2.5μM)的胚胎总细胞数显著高于对照组(P<0.001)，其中对照组为46.32，处理组为54.02，处理组的胚胎总细胞数相对于对照组提高了16.62％。以上结果表明培养基中加入2.5μM木蝴蝶苷A可以有效提高猪孤雌激活体外胚胎的细胞增殖能力，从而提高体外胚胎的发育质量与发育能力。同时也表明木蝴蝶苷A在制备提高体外胚胎细胞增殖能力产品中具有良好的应用前景。
数据统计：实施例2-4均采用SPSS软件进行统计分析，其中学生t检验用于比较两组数据。单因素方差分析(ANOVA)用于分析三个或更多平均值。
实施例5体外胚胎培养基
一种体外胚胎培养基，其包括2.5μM的木蝴蝶苷A，还包括基础培养基、无机盐、溶剂、抗生素、有利于体外胚胎细胞发育的营养功能因子。
综上所述，本发明证明了木蝴蝶苷A或其类似物能提高体外胚胎培养的囊胚率，保护体外胚胎细胞的线粒体功能，提高体外胚胎细胞的增殖能力，从而有效提高体外胚胎质量和发育能力。木蝴蝶苷A或其类似物在制备提高体外胚胎质量和发育能力产品中，具有良好的市场应用前景。
以上所述实施方式，只是本发明的较佳实施方式，并非来限制本发明实施范围，故凡依本发明申请专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明专利申请保护范围内。

Claims (10)

1.木蝴蝶苷A和/或其类似物在制备提高体外胚胎发育能力产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎囊胚率。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎细胞线粒体膜电位。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高体外胚胎发育能力为提高体外胚胎总细胞数和/或体外胚胎EdU阳性细胞率。
5.一种用于提高体外胚胎发育能力的产品，其特征在于，所述产品包括木蝴蝶苷A和/或其类似物。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括药物组合物、培养基、试剂盒。
7.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，木蝴蝶苷A的类似物包括木蝴蝶苷B、木蝴蝶素A-7-葡萄糖醛酸苷。
8.木蝴蝶苷A和/或其类似物在提高体外胚胎发育能力中的应用。
9.一种用于提高体外胚胎发育能力的方法，其特征在于，向体外胚胎施加有效量的木蝴蝶苷A和/或其类似物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述有效量为0.2-10μmol/L。
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