CN105232568A

CN105232568A - 木蝴蝶苷b的应用及含木蝴蝶苷b的药物

Info

Publication number: CN105232568A
Application number: CN201410328759.2A
Authority: CN
Inventors: 周泉生; 曹志飞; 傅士龙
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN105232568B

Abstract

本发明属于药物化学技术领域，公开了木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物。本发明提供了木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物、MKK3激动剂、P38激动剂、DDIT3促进剂中的应用。木蝴蝶苷B在体内外具有很好的抗癌作用，尤其是对恶性淋巴瘤具有较强的抑制作用，且无明显地毒副作用。其抗癌机制为：木蝴蝶苷B能诱导淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，有效地降低肿瘤细胞的致瘤性；其分子机制是通过激活淋巴瘤细胞中应激-反应体系的MKK3-P38通路，促进关键抑瘤基因DDIT3的表达，特异性地激活细胞内内质网应激和肿瘤细胞胀亡，从而起抗癌效应；对正常淋巴细胞无明显抑制作用，还能适度地升高体内血液中白血病和血小板。

Description

木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，特别涉及木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物。

背景技术

木蝴蝶为一种常用的中药，《中国药典》收载其来源为紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子，也被称为千张纸。木蝴蝶性味苦、甘、凉，入肺、肝、胃经，有清肺利咽止咳、疏肝和胃以及生肌之效。现代医学研究表明，木蝴蝶具有镇痛、抗炎、抗菌、抗氧化、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用，但是，但是还不能确定哪一个组分发挥的主要作用。研究发现，木蝴蝶化学成分复杂，包括黄酮及其苷类化合物、对羟基苯乙醇、环己醇、紫檀碱及挥发油等，以黄酮及其苷类化合物为主。

从木蝴蝶植物中分离得到三十多种黄酮类化合物：黄芩苷元、白杨素、千层纸苷、粗毛豚草素、5-羟基-6,7-二甲氧基黄酮、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B等。木蝴蝶苷B，(OroxinB，OB)，是其中的主要成分之一，其分子式为C₂₇H₃₀O₁₅，分子量为594.52，具有式I所示结构；

MAPKs信号转导通路存在于大多数的细胞内，是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用，也是细胞内应激-反应体系的关键信号通路，具有生物进化的高度保守性。MAPKs信号转导通路包括：MAP激酶(MAPK)、MAPK激酶(MEK、MKK或MAPK激酶)和MEK激酶(MEKK、MKKK或MAPK激酶激酶)。研究发现存在多条MAPKs信号转导通路途径：Ras-Raf-ERK途径、JNK途径、p38MAPK途径、ERK5/BMK1途径。针对p38MAPK途径，其包括4种激酶：PAK(MAPKKKK)、MLK(MAPKKK、MKKK或MEKK)、MKK3/6/4(MAPKK、MKK或MEK)、p38MAPK(MAPK)，它们构成了一个连续的蛋白激酶反应链，控制多种转录因子的基因表达活性。研究发现，p38MAPK途径在多种疾病的发生、发展中都发挥一定作用，所以对该途径的研究具有十分重要的意义。目前，还没有关于木蝴蝶苷B对这一途径的作用的研究报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物，本发明发现木蝴蝶苷B通过激活细胞中应激-反应体系的MKK3-P38通路，促进关键抑瘤基因-DNA损伤-诱导转录因子3(DNA-damage-inducibletranscript3，DDIT3)的表达，特异性地激活细胞内内质网应激和肿瘤细胞胀亡，从而起抗癌效应，其能诱导淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，有效地降低肿瘤细胞的致瘤性，且对正常淋巴细胞无明显抑制作用，能够应用于制备防治肿瘤的药物。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了木蝴蝶苷B在制备MKK3激动剂中的应用。

本发明还提供了木蝴蝶苷B在制备P38激动剂中的应用。

本发明还提供了木蝴蝶苷B在制备DDIT3促进剂中的应用。

本发明还提供了木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用。

本发明中的MKK3激动剂是指能够促进MKK3的表达、使MKK3磷酸化或激活的药物或药物组合物，但不局限于药物或药物组合物。研究报道MKK3与肿瘤和免疫性疾病相关。

本发明中的P38激动剂是指能够提高P38磷酸化水平的药物或药物组合物，但不局限于药物或药物组合物。研究报道P38与肿瘤、炎症和神经退行性病变等疾病相关。

本发明中的DDIT3促进剂是指能够提高DDIT3基因表达水平，进而提高DDIT3含量的药物或药物组合物，但不局限于药物或药物组合物。研究报道DDIT3与多种恶性肿瘤和细胞凋亡等相关。

本发明首次揭示了木蝴蝶苷B在体内外具有很好的抗癌作用。抗癌机制研究显示，木蝴蝶苷B能选择性诱导淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，有效地降低肿瘤细胞的致瘤性；其分子机制是通过激活淋巴瘤细胞中应激-反应体系的MKK3-P38通路，促进关键抑瘤基因-DNA损伤诱导转录因子3(DNA-damage-inducibletranscript3，DDIT3)的表达和肿瘤抑制活性，从而有效地起抗癌效应。实验结果发现，木蝴蝶苷B一方面能够有效促进MKK3的高表达，另一方面使其磷酸化和激活，所以，木蝴蝶苷B可以用于制备MKK3激动剂。实验结果还发现，木蝴蝶苷B作用于淋巴瘤细胞之后，P38的磷酸化水平显著增加，所以，木蝴蝶苷B可以用于制备P38激动剂。实验结果还发现，木蝴蝶苷B通过激活DDIT3基因启动子，促进了DDIT3表达，所以，木蝴蝶苷B可以用于制备DDIT3促进剂。体外实验和体内效果实验都证实了，木蝴蝶苷B具有良好的抗癌作用，可以用于制备防治肿瘤的药物。

优选地，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的肿瘤为恶性肿瘤。

优选地，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的恶性肿瘤为恶性淋巴瘤。

优选地，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的恶性淋巴瘤为：恶性B细胞淋巴瘤、恶性T细胞淋巴瘤。其中，恶性B细胞淋巴瘤具体为何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤；恶性T细胞淋巴瘤具体为T细胞淋巴瘤或NK细胞淋巴瘤。鉴于临床上淋巴瘤病人大多数属于恶性B细胞淋巴瘤，在本发明的一些实施例中，所针对的恶性淋巴瘤具体为恶性B淋巴瘤。

在本发明的一些实施例中，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的恶性肿瘤为白血病、黑色素瘤、胶质瘤、脑星形胶质母细胞瘤、胃癌、盲肠腺癌、胶质母细胞瘤、恶性胚胎横纹肌瘤、骨肉瘤、肝癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺浸润性导管癌、肾上腺神经母细胞瘤或骨髓瘤。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的恶性肿瘤为白血病、黑色素瘤、胶质瘤、脑星形胶质母细胞瘤、胃癌、盲肠腺癌、胶质母细胞瘤、恶性胚胎横纹肌瘤或骨肉瘤。

在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的恶性肿瘤为白血病、黑色素瘤或胶质瘤。

本发明提供的木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用中，所针对的白血病为：淋巴细胞异常引起的白血病或髓细胞异常引起的白血病。淋巴细胞异常引起的白血病具体为T淋巴细胞白血病、B淋巴细胞白血病。髓细胞异常引起的白血病为原髓细胞白血病、慢性髓原白血病、单核细胞白血病、巨核细胞白血病。优选为T淋巴细胞白血病和B淋巴细胞白血病。

本发明还提供了一种药物，该药物包括木蝴蝶苷B和药学上可接受的辅料。

本发明提供的药物可以选自以下任何方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、局部给药、非肠道给药(如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入；或借助一种外置的储器用药)，其中优选为口服、肌肉、腹膜内或静脉内用药方式。

本发明提供的药物的药物剂型可以是液体剂型或非液体剂型。液体剂型可以是真溶液、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型或混悬剂。非液体剂型可以是片剂、胶囊剂、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针、包合物、埋植剂、贴剂或擦剂。在液体剂型中，更优选为注射剂、混悬剂、糖浆剂或乳剂。在非液体制剂中，更优选为片剂、胶囊剂或颗粒剂。

优选地，本发明提供的药物的药物制剂中，当该药物的药物制剂为液体剂型时，药学上可接受的辅料包括分散润湿剂、乳化剂、载体、防腐剂、稳定剂。

优选地，本发明提供的药物的药物制剂中，当该药物的药物制剂为非液体剂型时，药学上可接受的辅料包括粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或稳定剂。

优选地，本发明提供的药物中，以质量百分比计，其中木蝴蝶苷B的含量为51％～99.5％。更为优选地，其中木蝴蝶苷B的含量为51％～95％。

本发明提供的含木蝴蝶苷B的药物，当制成各种剂型的口服胶囊剂药物时，成人口服，常用剂量一次80mg，1日3次，最大剂量的木蝴蝶苷B含量应为每天240mg，饭后服用，儿童用药酌情减量。但也可以不按照上述的剂量，而根据治疗对象的种类和体重、疾病的性质和严重程度、制剂的类型和药物的给药方式，以及给药周期或时间间隔。

本发明提供了木蝴蝶苷B的应用及包含木蝴蝶苷B的药物，木蝴蝶苷B可以用于制备防治肿瘤的药物、MKK3激动剂、P38激动剂、DDIT3促进剂。本发明证实了木蝴蝶苷B在体内外具有很好的抗癌作用，尤其是在体内对恶性淋巴瘤具有较强的抑制作用，且无明显地毒副作用。本发明还提出其抗癌机制为：木蝴蝶苷B能选择性诱导淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，有效地降低肿瘤细胞的致瘤性；其分子机制是通过激活淋巴瘤细胞中应激-反应体系的MKK3-P38通路，促进关键抑瘤基因DDIT3的表达，特异性地激活细胞内内质网应激和肿瘤细胞胀亡，从而起抗癌效应；对正常淋巴细胞无明显抑制作用，还能适度地升高体内血液中白血病和血小板。所以，木蝴蝶苷B能够应用于制备防治肿瘤的药物、MKK3激动剂、P38激动剂、DDIT3促进剂。

附图说明

图1示实施例2中实验结果，其中：图1A示不同浓度木蝴蝶苷B对Raji和Namalwa细胞体外增殖的影响，曲线1为Namalwa细胞，曲线2为Raji细胞；图1B示不同浓度木蝴蝶苷B对人淋巴母细胞HMY2-CIR细胞增殖的影响；图1C示不同浓度木蝴蝶苷B对人正常外周血单核细胞细胞增殖的影响；

图2示实施例3实验结果，其中：图2A示不同浓度的木蝴蝶苷B作用48h的Raji细胞的集落形成实验；1代表对照；2代表木蝴蝶苷B的浓度为5μmol/L；3代表木蝴蝶苷B的浓度为10μmol/L；4代表木蝴蝶苷B的浓度为20μmol/L；图2B示各组别的集落数目；

图3示实施例4中各个组别肿瘤生长情况实验结果，其中：图3A为各个组别肿瘤体积变化，曲线1为对照组，曲线2为给药组；图3B为第28天时，各个组别肿瘤重量；图3C为各个组别肿瘤生长情况；

图4示实施例4中各个组别待测样品对小鼠的毒性作用，其中，图4A为对照组和给药组小鼠体重的变化，其中曲线1为给药组，曲线2为对照组；图4B为对照组和给药组小鼠的脏器系数，其中1为对照组，2为给药组；

图5示实施例5中不同浓度的木蝴蝶苷B对Raji细胞作用的检测结果，其中图5A、图5B为不同浓度的木蝴蝶苷B对Raji细胞的凋亡作用，图5A中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为0、5、10μmol/L，图5B中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为20、30、40μmol/L；在单个浓度下，流失细胞检测结果中第一、二象限的细胞为凋亡晚期细胞，第三象限为正常细胞，第四象限为凋亡早期细胞；图5C、图5D为不同浓度的木蝴蝶苷B对非致瘤性淋巴母细胞HMY2-CIR的凋亡作用，其中图5C中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为0、5、10μmol/L，图5D中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为20、30、40μmol/L；图5E为不同浓度木蝴蝶苷B作用于Raji细胞的凋亡统计分析结果；图5F为不同浓度木蝴蝶苷B作用于HMY2-CIR细胞的凋亡统计分析结果；

图6示实施例6中木蝴蝶苷B对Raji细胞凋亡相关蛋白的作用的检测实验结果，其中图6A为Westernblot技术检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况；图6B为通过分离线粒体和胞浆来分别提取各自蛋白来观察细胞色素C的分布情况；图6C为细胞色素C的免疫荧光实验的实验结果；

图7示实施例7中木蝴蝶苷B引起的各组别细胞的形态学变化检测结果，其中，图7A为Raji细胞在低浓度的木蝴蝶苷B作用下细胞形态的变化结果，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0、5、10、20μmol/L；图7B为Namalwa细胞在低浓度的木蝴蝶苷B作用下细胞形态的改变结果，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0、5、10、20μmol/L；图7C为HMY2-CIR细胞在木蝴蝶苷B作用下形态的改变结果，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0、5、10、20μmol/L；

图8示实施例8中木蝴蝶苷B对多种重要信号通路相关蛋白的作用实验结果，其中，图8A为Westernblot检测各个蛋白表达量的实验结果；图8B为P38/p-P38随木蝴蝶苷B浓度增加的变化结果；

图9示实施例9中木蝴蝶苷B对P38上游MKKs的激活作用的检测结果，其中，图9A为采用RT-PCR技术检测MKKs家族相关基因的表达情况；图9B为Westernblot技术检测MKKs家族相关蛋白的表达情况；图9C为木蝴蝶苷B作用不同时间时，各个蛋白的表达情况；图9D为不同浓度的木蝴蝶苷B对MEKKs家族的蛋白的作用；

图10示实施例10中木蝴蝶苷B对P38下游DDIT3基因表达影响的检测结果，其中，图10A为RT-PCR检测Raji细胞中DDIT3基因的表达情况；图10B为QT-PCR检测Raji细胞中DDIT3基因的表达情况；图10C为在木蝴蝶苷B处理Raji细胞24h，48h，72h后收集RNA进行RT-PCR的检测结果；图10D为在木蝴蝶苷B处理Raji细胞24h，48h，72h后收集RNA进行QT-PCR的检测结果；图10E为不同浓度的木蝴蝶苷B处理Raji细胞48后的蛋白样品的蛋白免疫印迹检测结果；图10F为不同浓度的木蝴蝶苷B处理Raji细胞48后的DDIT3蛋白表达检测结果；图10G为不同浓度的木蝴蝶苷B处理正常人外周血单核细胞和Raji细胞48后的DDIT3蛋白表达检测结果；图10H为木蝴蝶苷B对B淋巴母细胞HMY2-CIR的DDIT3基因的作用；图10I为木蝴蝶苷B对B淋巴母细胞HMY2-CIR的DDIT3蛋白表达的影响；

图11示实施例11中木蝴蝶苷B对Raji细胞中DDIT3启动子活性的作用检测结果，其中，图11A示DDIT3基因启动子的三个不同部位；图11B示不同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子A片段作用的统计结果；图11C示同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子B片段作用的统计结果；图11D示不同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子C片段作用的统计结果。

具体实施方式

本发明公开了木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物。本领域技术人员可以参考本文内容，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的木蝴蝶苷B的应用及含木蝴蝶苷B的药物中所用到的试剂和原料均可由市场购得。

为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1木蝴蝶苷B对多种肿瘤细胞生长的抑制作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株

用于木蝴蝶苷B抗肿瘤细胞试验的30株人肿瘤细胞如下：人Burkitt's淋巴瘤细胞(Raji，Namalva)、人T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat)、人黑色素瘤高转移细胞株(C8161)、人单核细胞白血病细胞(THP-1)、人原髓细胞白血病细胞(HL-60)、人T淋巴细胞(H9)、人组织细胞淋巴瘤细胞(U937)、人胶质瘤细胞(SHG44)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、人脑星形胶质母细胞瘤(U-87MG)、人胃癌细胞(HGC-27)、人盲肠腺癌细胞(Hce-8693)、人胶质母细胞瘤细胞(A172)、人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD)、人骨肉瘤细胞(U-2OS，LP-1)、人肝癌细胞(HepG2，HCCC-9810)、人宫颈癌肠转移细胞(Caski)、人巨核细胞白血病细胞(Dami)、人结肠癌细胞(SW480)、人肺癌细胞(NCI-H292、H1299、95-D)、人宫颈癌细胞(Hela)、人卵巢癌细胞(Hey1B)、人乳腺浸润性导管癌旁皮肤细胞(CCD-1095SK)、人肾上腺神经母细胞瘤细胞(脑转移)(KP-N-NS)、人B淋巴瘤母细胞(HMY2-CIR)。细胞培养基DMEM(高糖)和RPMI1640为Hyclone公司产品。

(2)受试药物

木蝴蝶苷B(HPLC纯度98％以上)用二甲基亚砜(DMSO)助溶，配置成100mM的储存液，-80℃保存，临用前用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

实验方法:

细胞培养：细胞用含体积分数10％小牛血清及1％双抗(抗青霉素和抗链霉素)的RPMI1640或DMEM(高糖)培养液常规培养。每48-72h用0.25％胰酶消化，1:2～1:4扩瓶传代。

AlamarBlue法测定：将实验室30株肿瘤细胞培养至对数生长期，取对数生长期的各种贴壁细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为3×10⁴/mL，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板，CO₂培养箱继续培养24h，待贴壁后，吸走上清，每孔分别加入200μL含有终浓度0、1、10、100μmol/L的木蝴蝶苷B。取对数生长期的各种悬浮细胞，调整细胞浓度为5×10⁴/mL，以100μL/孔接种于96孔细胞培养板，每孔直接加入100μL含有各浓度的木蝴蝶苷B。当药物作用46小时后，以10μL/孔加AlarmaBlue染液至各孔内，轻拍混匀，于37℃继续孵育2小时后待检测。将孔板置于多功能酶标仪中进行检测，并于560/590nm测取各孔的荧光单位值。用Excel进行数据整理，药物抑制率(％)＝1-(实验组RFU值-空白孔RFU值)/(对照组RFU值-空白孔RFU)×100％，将整理所得数据用SPSS16.0进行统计分析，计算各浓度药物对30株肿瘤细胞增殖的抑制率及有效半数抑制浓度IC₅₀(抑制率为最高抑制率一半时的药物浓度)。

实验结果：

对不同浓度的木蝴蝶苷B对本实验室30种人肿瘤细胞株的增殖能力进行检测，所得IC₅₀值见表1。结果显示木蝴蝶苷B对人淋巴瘤和白血病等血液细胞有较强的抑制作用，对其他多种肿瘤也有一定的抑制作用。其中抗人恶性B淋巴瘤细胞Raji和Namalva的作用很强，而对非致瘤性的人B淋巴瘤母细胞HMY2-CIR的作用较小，结果提示木蝴蝶苷B对人恶性淋巴瘤细胞增殖具有抑制作用，且这种抑制作用为选择性抑制作用。

表1木蝴蝶苷B对30种肿瘤细胞株的IC₅₀值

实施例2木蝴蝶苷B对恶性淋巴瘤细胞体外生长的选择性抑制作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：B淋巴瘤Raji和Namalwa细胞株、非致瘤性的淋巴母细胞HMY2-CIR来源于美国ATCC。细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

(2)受试药物：木蝴蝶苷B用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度(0～40μmol/L)。

实验方法：

用人淋巴细胞分离液Lympholyte-H将正常人的血液进行分离，实验主要步骤是：抽取正常人的外周血后(加入肝素)，然后将外周血慢慢加入放有Lympholyte-H分离液的离心管中，进行离心，去中间的单核细胞层，在用PBS进行两次洗涤，去除分离液和血小板，得到单核细胞后，计数后分别与不同浓度药物(用RPMI1640培养基稀释，木蝴蝶苷B药物浓度分别为0、2.5、5、10、20、40μmol/L)混合后，接种于96孔板孔内。同时，取对数生长期的Raji、Namalwa、HMY2-CIR，以及人外周血单个核白细胞(PBMNCs)以100μL/孔接种于96孔细胞培养板，每孔直接加入100μL含有各浓度的OB。在药物作用48小时后，加10μLAlarmaBlue染液至各孔内，轻拍混匀后于37℃孵育2小时，测板。将孔板置于多功能酶标仪中进行检测，并于560/590nm测量，获取各孔细胞的荧光单位值。实验独立重复3次。

实验结果：

用不同浓度的木蝴蝶苷B分别处理Raji和Namalwa细胞48h后，通过AlarmaBlue方法检测木蝴蝶苷B对Raji和Namalwa细胞的体外生长的作用。结果见图1中1A，其中曲线1代表Namalwa细胞；曲线2代表Raji细胞，图1中每个数值表示一次实验中六个复孔的平均值，正负偏差用±s.d.表示，本实验至少重复三次得到相似的结果。结果显示，在处理48h后木蝴蝶苷B对Raji细胞的IC₅₀为(11.1±1.5)μmol/L，对Namalwa细胞的IC₅₀为(13.2±1.7)μmol/L，说明随着药物浓度的增加，木蝴蝶苷B对Raji和Namalwa细胞体外生长的抑制率均呈递增趋势，具有剂量依赖性。

图1B为木蝴蝶苷B对HMY2-CIR细胞的生长抑制作用，结果显示，随着药物浓度的增加，木蝴蝶苷B对非致瘤性的淋巴母细胞HMY2-CIR体外生长的抑制作用远低于Raji细胞，其IC₅₀为(71.7±2.3)μmol/L。图1C为木蝴蝶苷B对正常血液细胞PBMNCs的生长抑制作用，结果显示，在较低浓度(0-20μmol/L)时，其对正常血液细胞(PMNBCs)的生长无抑制作用，当其浓度高达40μmol/L时，抑制率依然很低。

综上所述，实验结果显示木蝴蝶苷B对B淋巴瘤生长的抑制作用具有选择性，其在较低浓度下就可以明显抑制恶性B淋巴瘤Raji和Namalwa的生长，但是对正常人外周血白细胞的生长没有明显的抑制作用。

实施例3木蝴蝶苷B有效地降低恶性淋巴瘤细胞的致瘤性

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：B淋巴瘤Raji来源于美国ATCC。细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

(2)受试药物：木蝴蝶苷B用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度(0-20μmol/L)。

实验方法：

集落形成能力是衡量细胞致瘤性的金标准，所以本实施例通过集落形成实验来测定被木蝴蝶苷B作用后的恶性淋巴瘤Raji细胞致瘤性是否降低，具体方法为：Raji细胞被不同浓度的木蝴蝶苷B(0、5、10、20μmol/L)作用48h以后，收集细胞计数，每个浓度取600个活细胞与甲基纤维素细胞培养基(无木蝴蝶苷B)一起震荡混匀加入30mm的小皿中。37℃继续孵育2周后待检测集落数目，进行计数和拍照，并且统计实验结果。

实验结果：

用被木蝴蝶苷B作用48h后的Raji细胞进行集落形成实验，当集落长至14D的时候进行集落计数和拍照，所得实验结果见图2A，其中1代表对照；2代表木蝴蝶苷B的浓度为5μmol/L；3代表木蝴蝶苷B的浓度为10μmol/L；4代表木蝴蝶苷B的浓度为20μmol/L；统计各组的集落数目，所得实验结果见图2B。结果发现，与对照组相比较，木蝴蝶苷B在5μmol/L的时候，就能非常显著地减少集落的数目(P<0.01)，在20μmol/L时，这种作用更加大，说明木蝴蝶苷B可以有效地降低恶性淋巴瘤Raji细胞的集落形成能力，从而降低其致瘤性。

实施例4木蝴蝶苷B对小鼠体内恶性淋巴瘤的疗效

实验材料：

(1)实验动物：品系：SCID鼠雌性，来源于南京大学模式实验动物中心；合格证：苏州大学实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0037。体重：18-22g；分实验组和对照组，每组动物数：7只。

(2)肿瘤细胞株Raji细胞为本所实验室冻存。

(3)受试药物：木蝴蝶苷B用生理盐水稀释成所需浓度。

实验方法：

取实验所用小鼠是8周龄(18-22g)的雌性SCID小鼠，将其随机分为两组，分为对照组和给药组两组，每组7只，将恶性淋巴瘤Raji细胞注射于SCID小鼠的腹股沟淋巴结进行体内移植淋巴瘤模型构造，每只小鼠注射2000万(200μLPBS)的Raji细胞，然后每天腹腔注射生理盐水(对照组)和30mg/kg的木蝴蝶苷B(给药组)，并且隔天称量小鼠的体重和肿瘤的体积，肿瘤的体积计算方法：体积＝长径×短径²×0.55。当作用28天以后，对小鼠进行取血，检测血液指标的变化，并且解剖小鼠，取下肿瘤、心、肝、脾、肺、肾，进行称重和拍照，观察相关脏器系数的变化。

统计学分析：

采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验。

实验结果：

实验结果见图3A、3B和3C，实验结果表明，随着时间的延长，对照组小鼠肿瘤体积在逐渐增大，而给药组基本维持很小的肿瘤体积(图3A)。当到28天的时候，结果显示对照组肿瘤体积达到665.7±140mm³，而给药组只有162.8±20mm³(图3A)，说明木蝴蝶苷B在体内可以明显抑制Raji瘤的生长；解剖取下肿瘤称重、拍照所得实验结果为图3B和图3C，结果显示，相比对照组，木蝴蝶苷B对淋巴瘤的抑制作用非常显著(P<0.01)，抑制率达到75.5％，说明其在体内具有很好的抗淋巴瘤作用。

本实施例还通过脏器系数和多项血液指标来评估木蝴蝶苷B在体内的毒性作用。实验结果见图4A、4B和表2。

表2木蝴蝶苷B对小鼠血液指标的影响实验结果

图4A为对照组和给药组小鼠体重的变化，其中曲线1为给药组，曲线2为对照组，结果显示木蝴蝶苷B用药组和生理盐水对照组小鼠的体重未见明显差异。图4B为各个组别的小鼠的脏器系数(脏器重量/小鼠体重×1000)，其中1代表对照组，2代表给药组，结果显示两组小鼠的脏器系数没有明显差异。表2为木蝴蝶苷B对小鼠血液指标的影响实验结果，结果显示两组小鼠的血液指标也未发生显著性差异(P>0.05)：白细胞(WBC)，红细胞(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞平均压积体积(MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，红细胞分布宽度标准差(RDW-SD)，红细胞压积(HCT)，血小板体积(MPV)，血小板分布宽度(PDW)，红细胞体积分布宽度(RDW-CV)。

此外，值得一提的是，从表2中可以看出，给药组的小鼠的血小板(PLT)和白细胞的数目要高于对照组，说明木蝴蝶苷B在有效地抗肿瘤的同时还能适度地提高血液中血小板水平和白细胞数目，这一作用显然不同于目前临床上应用的传统抗肿瘤的化疗药物。众所周知，肿瘤病人的化疗和放疗常有毒副作用，引起血液学中白细胞和血小板数量降低，导致病人免疫功能下降、炎症和出血等毒副作用，影响抗癌疗效。因此，木蝴蝶苷B的选择性抗肿瘤效应以及适度升高白血病和血小板的作用，显示其特独的抗肿瘤特性和良好的应用前景。

综上所述，木蝴蝶苷B具有很好的抗淋巴瘤作用；且木蝴蝶苷B的体内毒性很低，在安全剂量范围内可以选择性地抑制肿瘤的生长，对正常外周血细胞的毒性作用很微弱，克服了临床上应用的传统治疗淋巴瘤的药物具有毒副作用大等缺陷，说明木蝴蝶苷B能够用于制备防治肿瘤的药物。

实施例5木蝴蝶苷B对Raji和HMY2-CIR细胞凋亡的作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：Raji和HMY2-CIR来源于美国ATCC。细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

(2)受试药物：木蝴蝶苷B用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用DMEM(高糖)培养基稀释成所需浓度。

实验方法：

将细胞培养至对数生长期，在生长状态良好的情况下进行实验。将细胞离心重悬计数，然后与用RPMI1640培养基配制好的木蝴蝶苷B药物接种于T25cm²细胞培养瓶，使细胞终浓度为10⁵细胞/mL。于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱内培养48小时。收集细胞，1000rpm离心5分钟，用PBS清洗一遍。先用300μLAnnexinV/FITCbindingbuffer重悬细胞，再分别依次加入3μLAnnexinV-FITC和3μLPI，避光处理细胞约15分钟。将处理好的细胞用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测。

实验结果:

采用流式细胞技术检测不同浓度木蝴蝶苷B对Raji细胞凋亡的作用，AnnexinV-FITC标记凋亡早期的细胞，PI标记凋亡晚期的细胞。实验结果见图5A、5B、5C、5D、5E、5F。图5A、图5B为不同浓度的木蝴蝶苷B对Raji细胞的凋亡作用，图5A中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为0、5、10μmol/L，图5B中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为20、30、40μmol/L；在单个浓度下，流失细胞检测结果中第一、二象限的细胞为凋亡晚期细胞，第三象限为正常细胞，第四象限为凋亡早期细胞；不同浓度木蝴蝶苷B作用于Raji细胞的统计分析结果见图5E。木蝴蝶苷B对非致瘤性淋巴母细胞HMY2-CIR的凋亡作用见图5C、图5D，其中图5C中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为0、5、10μmol/L，图5D中1、2、3分别代表木蝴蝶苷的浓度为20、30、40μmol/L，不同浓度木蝴蝶苷B作用于HMY2-CIR细胞周期分布情况的统计分析结果见图5F。本实验至少重复三次得到相似的结果，每个数值表示三次重复的平均值，正负偏差用±s.d.表示。图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01。

结果显示，木蝴蝶苷B在较低浓度(5、10、20μmol/L)时，不引起Raji细胞凋亡；较高浓度木蝴蝶苷B(30μmol/L和40μmol/L)可诱导恶性淋巴瘤细胞凋亡，凋亡的Raji细胞所占比例呈轻度增加的趋势。其中，Raji细胞经30μmol/L和40μmol/L木蝴蝶苷B作用48h后，凋亡的细胞所占比例分别为22.94％和40.14％。结合实施例1中的实验结果可知，在较低浓度下，木蝴蝶苷B对Raji细胞产生抑制作用，但是这种抑制作用不是通过诱导细胞凋亡产生的，这提示木蝴蝶苷B的抗肿瘤作用不是通过诱导细胞凋亡，而是通过其他抗肿瘤机制。

令人感兴趣的是木蝴蝶苷B对非致瘤性淋巴母细胞HMY2-CIR的凋亡却没有影响，当木蝴蝶苷B40μmol/L的时候，非致瘤性淋巴母细胞的凋亡只有5.31％，与未用药对照组无显著性差异(P>0.05)。由此可见，较高浓度木蝴蝶苷B可以特异性地诱导部分Raji细胞凋亡，而对非致瘤性淋巴母细胞的凋亡作用无明显的作用，说明木蝴蝶苷B诱导淋巴瘤细胞的凋亡具有选择性。这一结果与上述木蝴蝶苷B体内毒副作用非常小相一致。

实施例6木蝴蝶苷B对Raji细胞凋亡相关蛋白的作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：Raji和HMY2-CIR购于美国ATCC。细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

实验方法：

收集细胞，用M-per裂解液(含蛋白酶抑制剂和DTT及磷酸酶抑制剂)对细胞冰上裂解1小时，4℃离心机离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据结果调平并加入5×SDSsamplebuffer及1mol/LDTT后95℃煮3-5min制成各浓度药物作用后的细胞蛋白样品，于-80℃冰箱中备用。用SDS-PAGE凝胶电泳于120V稳压电泳1个半小时左右，对目的蛋白进行分离。将分离出来的蛋白于250mA条件下转移至NC膜上。用5％脱脂牛奶，于室温下对转有目的蛋白的NC膜进行封闭，1小时后，再用5％牛奶或5％BSA稀释的一抗进行4℃孵育过夜。室温孵育二抗1～2小时，最后用ECL显影液通过被标记的二抗对目的蛋白表达条带于X光片上进行显影。

实验结果：

采用Westernblot技术检测细胞凋亡相关蛋白(Caspase3、Cleavedcaspase3、PARP、BAK、BAX和BCL2)的表达情况，实验结果见图6A，结果显示，当木蝴蝶苷B浓度为30-40μmol/L时，凋亡蛋白PARP激活，Caspase家族的Caspase3也发生剪切激活。

本实施例通过分离细胞线粒体和胞浆来分别提取线粒体蛋白和胞浆蛋白来检测细胞色素C(cytoC)的表达情况，检测结果见图6B；本发明还进行了细胞色素C的免疫荧光实验，检测结果见图6C；结果发现，有部分细胞色素C由线粒体释放到胞浆中，这些结果表明较高浓度木蝴蝶苷B(30-40μmol/L)激活了凋亡通路。

由此可见，中草药单体木蝴蝶苷B在较高浓度下，可以明显地诱导Raji细胞的Caspase3相关凋亡通路的激活，并且使细胞色素C由线粒体释放到胞浆中，进而诱导了Raji细胞的凋亡，与实施例5中的流式细胞技术检测细胞凋亡的结果相吻合。

实施例7木蝴蝶苷B作用机制的研究

实验材料：

实验方法：

恶性淋巴瘤细胞Raji和Namalwa，以及非致瘤性淋巴母HMY2-CIR在低浓度木蝴蝶苷B(最高只有20μmol/L，不引起细胞凋亡)的作用下培养3-9天，然后通过cytospin方法将细胞甩在载玻片上，进行瑞氏姬姆萨染色，再用OLYMPUSFSX100显微镜进行明场拍照，随机选取6个不同视野，观察木蝴蝶苷B引起的细胞形态学变化。

实验结果：

实验结果见图7A、7B、7C，其中图7A为Raji细胞在低浓度的木蝴蝶苷B作用下细胞形态的变化结果，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L；图7B为Namalwa细胞在低浓度的木蝴蝶苷B作用下细胞形态的改变结果，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L；图7C为HMY2-CIR细胞在木蝴蝶苷B作用下形态的改变，其中1、2、3、4分别代表木蝴蝶苷B的浓度为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L。

从图7A中可知，Raji细胞在较低浓度木蝴蝶苷B(0～20μmol/L)的作用下，Raji细胞的形态发生了明显的改变，细胞的胞体增大，细胞从园型变为不规则型，细胞膜出现伪足，细胞浆中出现了多个空泡和颗粒状物质，同时细胞核也发生了相应的增大。木蝴蝶苷B诱导的Raji细胞的这些形态学变化称之为灾难性空泡(catastrophicvacuolization)。从图7B中可知，木蝴蝶苷B对恶性淋巴瘤Namalwa细胞形态也产生了影响，与上述Raji细胞相类似，细胞出现了灾难性空泡现象。从图7C中可知，在同样的木蝴蝶苷B浓度下，HMY2-CIR没有出现灾难性空泡的现象。这些实验结果显示，木蝴蝶苷B能够选择性地诱导恶性淋巴瘤细胞灾难性空泡。

最新研究报道，诱导肿瘤细胞灾难性空泡的意义重大，一旦肿瘤细胞中产生灾难性空泡，继而发生细胞胀亡(oncosis)，导致肿瘤细胞死亡，这一机制完全不同于细胞凋亡，是一种全新的抗癌机制，在抗脑胶质瘤新药研发中已有一篇报道，但在抗淋巴瘤药物研发中尚未见报道。实验结果可知，木蝴蝶苷B能够选择性地诱导恶性淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，可以用于制备防治肿瘤的药物，尤其是针对恶性淋巴瘤的药物，为研发新一代高效低毒的抗淋巴瘤新药开辟了新的道路。

实施例8木蝴蝶苷B抗淋巴瘤分子机理的研究

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：Raji为来源于美国ATCC。细胞培养基DMEM(高糖)为Hyclone公司产品。

实验方法：

收集细胞，用M-per(含蛋白酶抑制剂和DTT)裂解液对细胞冰上裂解1小时，对于信号通路的相关蛋白，在M-per裂解液中再加入磷酸酶抑制剂，4℃离心机离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据结果调平并加入5×SDSsamplebuffer及1MDTT后95℃煮3-5min制成各浓度药物作用后的细胞蛋白样品于-80℃冰箱中备用。用SDS-PAGE凝胶电泳于120V稳压电泳1个半小时左右，对目的蛋白进行分离。将分离出来的蛋白于250mA条件下转移至NC膜上。用5％脱脂牛奶，于室温下对转有目的蛋白的NC膜进行封闭，1小时后，再用5％牛奶或5％BSA稀释的一抗进行4℃孵育过夜。室温孵育二抗1～2小时，最后用ECL显影液通过被标记的二抗对目的蛋白表达条带于X光片上进行显影。

实验结果：

鉴于淋巴瘤细胞中多种信号通路被异常激活，本发明采用Westernblot技术，检测木蝴蝶苷B对细胞内多种重要信号通路的作用，包括信号传递关键蛋白P38、p-P38、JNK、p-JNK、Erk、pErk、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt、NF-κB及p-NF-κB，实验结果见图8A。用QuantityOne软件对目的基因蛋白表达的显影条带进行灰度扫描分析，获得其相对表达量(以总蛋白表达量为参照)，统计分析不同浓度药物对目的蛋白表达的作用，实验结果显示，不同浓度的木蝴蝶苷B作用于Raji细胞后，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38的磷酸化非常显著地增加，而对JNK、Erk、mTOR、Akt、NF-κB的磷酸化均无明显影响。图8B为P38/p-P38随木蝴蝶苷B浓度增加的变化，说明丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38的磷酸化水平非常显著地升高。

p38通路是细胞内应激-反应(stress-response)体系中关键的信号通路，其激活可引起抗肿瘤，增强免疫等效应。以上结果显示，中药单体木蝴蝶苷B具有特异性地激活Raji细胞P38通路的作用，提示木蝴蝶苷B的抗肿瘤作用可能是通过特异性地激活应激-反应体系的P38信号通路来实现的。

实施例9木蝴蝶苷B抗淋巴瘤分子机理的研究：木蝴蝶苷B对丝裂原活化蛋白激酶P38上游MKKs的激活作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：Raji为本实验室冻存。细胞培养基1640为Hyclone公司产品。

(2)受试药物：木蝴蝶苷B用二甲基亚砜(DMSO)助溶，用1640培养基稀释成所需浓度。

实验方法：

Raji细胞被不同浓度的木蝴蝶苷B作用48h以后，用M-per(含蛋白酶抑制剂和DTT)裂解液对细胞冰上裂解0.5-1小时，对于信号通路的相关蛋白，在M-per裂解液中再加入磷酸酶抑制剂，4℃离心机离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据结果调平并加入5×SDSsamplebuffer及1MDTT后95℃煮3-5min制备后用western-blot法进行分析。同时，收集各个木蝴蝶苷B浓度作用的细胞，提取总RNA，逆转录后用PCR检测基因表达的变化。

实验结果：

P38的激活受其上游MAPK激酶MKKs(MKK3、MKK6、MKK4和MKK7)的调控，实施例8中检测到Raji细胞中的P38通路在木蝴蝶苷B的作用下发生了激活，所以本实施例中进一步研究了木蝴蝶苷B是否激活上游MKKs，以及是否激活MKKs的上游MEKKs家族。收集经不同浓度木蝴蝶苷B作用48小时后的Raji细胞制备mRNA样品，采用RT-PCR技术检测MKKs家族相关基因(MKK3、MKK6、MKK4和MKK7)表达，检测结果见图9A。结果显示，随着木蝴蝶苷B浓度的增加，MKK3的基因表达增加，而其它相关丝裂原活化蛋白激酶MKKs(MKK6,MKK4和MKK7)没有明显变化。

收集经不同浓度木蝴蝶苷B作用48小时后的Raji细胞制备蛋白样品，采用Westernblot技术检测MKKs家族相关蛋白(MKK3、MKK6和p-MKK3/6)表达，检测结果见图9B。结果显示，随着木蝴蝶苷B浓度的增加，MKK3和p-MKK3的表达增加。

此外，本实施例还收集了经过木蝴蝶苷B不同时间(10mins、2h、8h、24h、48h)处理的蛋白样品来检测MKK3、MKK6和p-MKK3/6的表达情况，检测结果见图9C。结果发现随着时间的延长，MKK3的表达量及其磷酸化水平(p-MKK3)都逐渐增加，而对MKK6量无明显影响(图9C)，表明木蝴蝶苷B可双管齐下，一方面促进MKK3的高表达，另一方面使其磷酸化和激活。

接着，我们进一步考察了木蝴蝶苷B是否激活MKK3上游的MEKKs家族的蛋白，检测结果见图9D，结果发现，MKK3上游的MEKK4和ASK1蛋白磷酸化水平不增高，提示木蝴蝶苷B不能诱导其激活。

MEKKs家族-MKKs-MAPK(包括p38,JNK和REK)是细胞内应激-反应体系的关键信号通路，多种内、外源性因素通过诱导该通路的激活调控细胞形态和功能。结合实施例8、实施例9所得实验结果可知，中草药单体木蝴蝶苷B激活B淋巴瘤Raji细胞的MKK3，后者再选择性地激活其下游p38通路，起抗肿瘤作用。

实施例10木蝴蝶苷B抗淋巴瘤分子机理的研究：木蝴蝶苷B对P38下游DDIT3基因表达的影响

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：Raji细胞来源于美国ATCC。细胞培养基1640为Hyclone公司产品。

实验方法：

Raji细胞被不同浓度的木蝴蝶苷B作用48h以后，用M-per(含蛋白酶抑制剂和DTT)裂解液对细胞冰上裂解1小时，对于信号通路的相关蛋白，在M-per裂解液中再加入磷酸酶抑制剂，4℃离心机离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据结果调平并加入5×SDSsamplebuffer及1MDTT后95℃煮3-5min制备后用western-blot法进行分析。同时，收集各个木蝴蝶苷B浓度作用的细胞，提取总RNA，逆转录后用PCR检测基因表达的变化。

实验结果：

细胞内应激-反应体系的关键信号通路p38激活后，可促进p38下游多个关键基因的转录，其中最重要基因之一是DDIT3基因。如上所述，DDIT3称为生长停滞和DNA损伤诱导蛋白，又叫CEBP同源蛋白-10(CCAAT/Enhancer-BindingProteinHomologousProtein-10，CHOP-10)，是内质网应激的重要标志物，调控多种下游基因的表达，包括如干扰素，白血病介素IL6，IL8，IL23，TNFRSF10B/DR5，PPP1R15A/GADD34，BBC3/PUMA，BCL2L11/BIM、TRIB3和ERO1L等，通过内质网应激、增强免疫反应，抑制细胞生长，诱导细胞胀亡和凋亡，来发挥抗肿瘤效应。

本发明利用不同浓度木蝴蝶苷B处理Raji细胞48h后，用RT-PCR和QT-PCR检测DDIT3基因的表达，检测结果见图10A、图10B。用木蝴蝶苷B(40μmol/L)处理Raji细胞，分别在24h，48h，72h收集RNA进行RT-PCR和QT-PCR检测DDIT3基因的表达检测结果见图10C、图10D。图10A、图10B、图10C和图10D所示结果显示了木蝴蝶苷B可以明显诱导Raji细胞中DDIT3基因表达升高。

收集不同浓度的木蝴蝶苷B处理48后的蛋白样品，用蛋白免疫印迹实验检测木蝴蝶苷B对Raji细胞中DDIT3蛋白表达的作用，检测结果见图10E、图10F。蛋白印迹检测结果显示，随着木蝴蝶苷B浓度的增加，Raji细胞中DDIT3蛋白的表达水平呈升高趋势。

本发明还观察了木蝴蝶苷B对正常人血液细胞的DDIT3的影响。首先收集木蝴蝶苷B作用48h后的正常人外周血单核细胞，同时制备蛋白样品，进行蛋白免疫印迹实验，检测DDIT3蛋白的表达情况，检测结果见图10G。结果显示在木蝴蝶苷B作用下，正常人外周血单核细胞的DDIT3蛋白表达没有升高。

此外，本发明还检测了木蝴蝶苷B对B淋巴母细胞HMY2-CIR的DDIT3基因和蛋白的表达作用，检测结果见图10H、图10I，结果显示木蝴蝶苷B对HMY2-CIR的DDIT3基因表达没有激活作用。

由此可见，木蝴蝶苷B可以特异性的激活肿瘤细胞Raji的DDIT3基因表达，而不引起正常外周血细胞以及非致瘤性的淋巴母细胞HMY2-CIR的DDIT3细胞基因表达。

实施例11木蝴蝶苷B抗淋巴瘤分子机理的研究：木蝴蝶苷B对Raji细胞中DDIT3启动子活性的作用

实验材料：

(1)肿瘤细胞株：人B淋巴瘤细胞Raji购自美国ATCC。细胞培养基1640为Hyclone公司产品。

实验方法：

Raji细胞被不同浓度的木蝴蝶苷B作用48h以后，用M-per(含蛋白酶抑制剂和DTT)裂解液对细胞冰上裂解0.5-1小时，对于信号通路的相关蛋白，在M-per裂解液中再加入磷酸酶抑制剂，4℃离心机离心取上清，用BCA法测定蛋白浓度，根据结果调平并加入5×SDSsamplebuffer及1MDTT后95℃煮3-5min制备后用western-blot法进行分析。

实验结果：

实施例10的实验结果显示，木蝴蝶苷B可以激活Raji细胞DDIT3基因和蛋白的表达，其机制是否是通过激活DDIT3基因的启动子活性，进而激活基因和蛋白的表达？

本发明通过检测木蝴蝶苷B作用后Raji细胞内荧光素酶报告基因的表达强度变化，来反映DDIT3启动子活性的高低，观察木蝴蝶苷B对DDIT3基因启动子的影响。首先，用不同浓度的木蝴蝶苷B对含有DDIT3不同启动子片段(A、B和C)的阳性Raji细胞处理48小时，DDIT3基因启动子的三个不同部位见图11A所示。然后，用双荧光素酶报告系统检测DDIT3启动子的活性，通过检测Raji细胞内荧光素酶报告基因的表达强度来反映DDIT3启动子活性的强弱，检测结果见图11B、图11C和图11D。不同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子A片段作用的统计结果见图11B；不同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子B片段作用的统计结果见图11C；不同浓度木蝴蝶苷B对DDIT3启动子C片段作用的统计结果见图11D。图中，*代表p<0.05，**代表p<0.01。实验结果显示木蝴蝶苷B可以显著地增加DDIT3基因启动子活性(P<0.01)。结果提示，木蝴蝶苷B通过激活DDIT3基因启动子，促进重要抑瘤基因DDIT3基因表达。

综上所述，本发明揭示了木蝴蝶苷B在体内外具有很好的抗癌作用，尤其是在体内对恶性淋巴瘤具有较强的抑制作用，且无明显的毒副作用。抗癌机制研究显示，木蝴蝶苷B能选择性诱导淋巴瘤细胞灾难性空泡和胀亡，有效地降低肿瘤细胞的致瘤性；其分子机制是通过激活淋巴瘤细胞中应激-反应体系的MKK3-P38通路，促进关键抑瘤基因-DNA损伤诱导转录因子3(DDIT3)的表达和肿瘤抑制活性，从而起抗癌效应；而对正常淋巴细胞无明显抑制作用。木蝴蝶苷B可以用于制备防治肿瘤的药物，对恶性肿瘤具有较强的抑制作用，尤其是淋巴细胞瘤。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.木蝴蝶苷B在制备防治肿瘤的药物中的应用。

2.木蝴蝶苷B在制备MKK3激动剂中的应用。

3.木蝴蝶苷B在制备P38激动剂中的应用。

4.木蝴蝶苷B在制备DDIT3促进剂中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为恶性淋巴瘤。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述恶性淋巴瘤具体为恶性B淋巴瘤。

8.根据权利要求1或5所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为白血病、黑色素瘤、胶质瘤、脑星形胶质母细胞瘤、胃癌、盲肠腺癌、胶质母细胞瘤、恶性胚胎横纹肌瘤、骨肉瘤、肝癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺浸润性导管癌、肾上腺神经母细胞瘤或骨髓瘤。

9.一种药物，其特征在于，其包括木蝴蝶苷B和药学上可接受的辅料；优选地，其药物制剂为液体制剂或非液体制剂；优选地，以质量百分比计，所述药物制剂中木蝴蝶苷B的含量为51％～99.5％。