JP6759497B1 - 胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法 - Google Patents

胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法 Download PDF

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Abstract

【課題】胎のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵培養方法を提供する。【解決手段】卵母細胞の培養工程と、精液処理工程と、インビトロ受精工程と、受精卵子の培養工程と、含み、前記工程における培養インキュベータは、インキュベータ本体と、インキュベータ本体内に配置される複数個の培養皿と、複数個の培養皿を単独に昇降させる昇降装置と、インキュベータ本体内の温度およびＣＯ２およびＯ２を制御する制御装置と、培養皿の取出または送入過程中でインキュベータ本体と隔離させる隔離手段を含む。受精卵の生存率が向上するだけでなく、さらに培養インキュベータを設けることにより、絶えずに受精卵を観察する過程において、培養インキュベータ内の栄養条件を維持できるようになる。【選択図】なし

Description

本発明は、動物受精卵の培養技術の分野に関するもので、特に胚のインビトロ培養用の高
生存率のヒツジ受精卵の培養方法に関する。
生殖工学技術および胚のインビトロ生産技術の発展に伴い、ヒツジ胚のインビトロ生産技
術（インビトロ受精やクローン）は品種の選別と優良品種の繁殖を加速する重要な手段と
なっている。胚のインビトロ生産技術は、生きた子孫を得られるという現状であるが、イ
ンビトロ受精やクローンにより得たインビトロ胚が、培養中において発育遅滞が多く、一
定の段階になると停止や退化に至ることもある。インビトロ胚の胚盤胞率が、インビボ胚
よりも遥かに低い。従来のヒツジ胚のインビトロ培養では、上記の問題に関して、栄養条
件がキーの原因の一つである。例えば、受精卵を観察する過程では、培養インキュベータ
から受精卵を取り出す必要があるが、このような取り出すことが、培養インキュベータ内
の温度、湿度、酸素、二酸化炭素などの条件に大きく影響する。
本発明は、従来の技術における欠陥を克服するために、胚のインビトロ培養用の高生存率
のヒツジ受精卵の培養方法を提供する。
上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術方案を採用する。胚のインビトロ培
養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法は以下の工程を含む。
ａ、卵母細胞の培養
採集された卵母細胞の複合体を成熟液中に移入し、成熟液の微滴ごとに１０〜２０個の卵
母細胞を移入し、３８〜３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境で２２〜２６時間培養し
、卵母細胞の複合体を卵子に成熟させる。
ｂ、精液処理
新鮮または解凍後の精液を取り、精子希釈液と希釈し、受精液滴ごとに精子希釈液を移入
し、受精液滴を含み培養皿や培養プレートをＣＯ２培養インキュベータ中に入れて２〜３
時間静置する。
ｃ、インビトロ受精
成熟液における成熟卵子を、受精液滴ごとに３０〜５０個の成熟卵子の比で受精液滴中に
移入し、そして３８〜３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境の培養インキュベータ中に
入れてインビトロ受精し、１８〜２４時間培養する。
ｄ、受精卵子の培養
精子と卵子を受精させて１８〜２４時間培養した後、受精卵子の周囲にある顆粒細胞およ
び付着される精子を除去し、１５〜４０個／滴の密度で胚の発育液滴中に入れて、飽和湿
度の培養インキュベータにおいて６〜８日にわたってインビトロ培養する。
前記工程ｄにおける培養インキュベータは、インキュベータ本体１と、インキュベータ本
体内に配置される複数個の培養皿２と、複数個の培養皿を単独に昇降させる昇降装置と、
インキュベータ本体内の温度およびＣＯ２およびＯ２を制御する制御装置と、培養皿の取
出または送入過程中でインキュベータ本体と隔離させる隔離手段を含む。前記昇降装置は
、インキュベータ本体に等距離で環状に固定設置される複数個の中空チューブ３０と、複
数個の中空チューブのチャンバーに連通設置される中空トレイ３１と、中空チューブ内に
位置されるピストンレバー３２と、ピストンレバーの上端に固定設置される培養皿配置用
の固定基底３３と、中空トレイの軸芯に位置されかつ中空トレイ内に差し込まれる入気チ
ューブ３４と、中空トレイに設けられる吸気チューブ３５と、中空トレイ内に設けられる
中空チューブ封止用の封止部材３６と、封止部材に設けられるキャビティ３７と、封止部
材に設けられるキャビティと入気チューブを連通させる接続チューブ３８と、入気チュー
ブに固定設置される大ギア３９と、大ギアと噛み合う小ギア３００と、小ギアを回動駆動
する第１モータ３１０とを含む。吸気チューブは中空トレイと中空チューブ内の空気を吸
い出すように形成される。中空チューブ内のピストンレバーを最下端に下降させると、固
定基底に配置される培養皿が培養インキュベータ内に位置する。ある1つの培養皿を取る
ときには、第１モータにより小ギアを回動駆動して、大ギアが連動して回動する。前記大
ギアが入気チューブに固定設置されるので、入気チューブが連動して回動する。入気チュ
ーブと封止部材とが接続チューブにより接続されるので、封止部材が連動して入気チュー
ブを軸芯として回動する。封止部材が、取り出そうとする培養皿の直下に位置し、即ち中
空チューブの直下に位置すると、該中空チューブが封止部材上のキャビティと接続チュー
ブにより入気チューブに連通するようになり、さらに入気チューブに気体を送り入れるこ
とにより、ピストンレバーと固定基底および培養皿が連動して一緒に上昇する。このよう
にすると、単一の培養皿の取出しがなされる。本発明は、吸気チューブにより中空トレイ
と中空チューブ内の空気を吸い出して、中空チューブ内に位置されるピストンレバーを最
下位置に下降させて、固定がなされる。このとき、固定基底上の培養皿を培養インキュベ
ータ内に位置させる。ある一つの培養皿を取る時には、第１モータにより小ギアを回動駆
動して、大ギアを回動させる。前記大ギアが入気チューブに固定設置されるので、入気チ
ューブを回動駆動するようにする。前記入気チューブと封止部材とが接続チューブを介し
て接続されるので、封止部材を入気チューブを軸芯として回動させるように駆動する。封
止部材が、取り出そうとする培養皿の直下に位置し、即ち中空チューブの直下に位置する
と、該中空チューブが封止部材に設けられるキャビティと接続チューブにより入気チュー
ブに連通するようになる。さらに入気チューブにより気体を注入する。これにより、ピス
トンレバーと固定基底および培養皿を一緒に上昇させて、単一の培養皿の取り出しがなさ
れる。上昇過程では、隔離手段により培養インキュベータ内の環境を外部と隔離させて、
外部からインキュベータ内の環境への影響を回避することができる。培養インキュベータ
内の酸素ガス、二酸化炭素等が絶えずに消費されるに対しては、制御装置により費やされ
た酸素ガスなどを補充して、インキュベータ内の環境を不変維持する。上記手段により、
受精卵の生存率を向上する。さらに培養インキュベータを設けることにより、絶えずに受
精卵を観察する過程で、培養インキュベータ内の栄養条件を維持することが可能になる。
前記工程ａにおける成熟液は、Ｍ１９９の培地に８〜１２ｇ／ｍＬのＦＳＨ（卵胞刺激ホ
ルモン）、８〜１２ｇ／ｍＬのＬＨ（ルトロピン）、０．５〜１．５ｇ／ｍＬのＥ２（エ
ストロゲン）、０．０５〜０．１５ｍｍｏｌ／Ｌのβーメルカプトエタノールおよび１０
〜２０％のＥＳＳ（発情期羊血清）を加えて、培養液を使用する前に４０〜６０μＬ／滴
の成熟液の微滴に製作する。これにより、卵子と成熟させる卵母細胞の繁殖間隔を短縮化
することができる。ヒツジの遺伝改良速度と生産効率を大幅に向上する。
前記工程ｃにおける受精液は、ＳＯＦ（卵管合成液）に０．１〜０．２μｍｏｌ／Ｌのペ
ニシリミン、０．１〜０．２μｍｏｌ／Ｌのタウリン、５〜１０μｇ／ｍＬのヘパリンお
よち２〜１０％のＥＳＳ（発情期羊血清）を加える。これにより、受精確率を向上すると
ともに受精卵の受精間隔を短縮化させることができ、ヒツジの遺伝改良速度と生産効率を
大幅に向上する。
前記制御装置は、酸素ガスチューブ４０と、酸素ガスチューブの上方に位置される水分チ
ューブ４１と、水分チューブの上方に位置される二酸化窒素チューブ４２と、酸素ガスチ
ューブに等間隔にて環状に配布される複数個の酸素流出チューブ４３と、水分チューブに
等間隔にて環状に配布される複数個の排気チューブ４４と、二酸化炭素チューブに等間隔
にて環状に配布される複数個の炭素流出チューブ４５と、それぞれ複数個の酸素流出チュ
ーブ、排気チューブおよび炭素流出チューブ内に差し込まれる複数個の挿入ロッド４６と
、複数個の挿入ロッドの中央に位置される回動軸４７と、回動軸を回動駆動する駆動部材
４８と、回動軸を貫通させるように固定設置される空洞輪４９と、挿入ロッドの一端に回
動自由に設置されるローラ４００と、酸素ガス、二酸化炭素および水分を混ぜる複数個の
気体混合チューブ４１０と、気体混合チューブの上方にそれぞれ設けられる複数個のエア
バッフル柱４２０とを含む。空洞輪に三つの空洞が備えられる。ローラが三つの空洞内に
位置される。前記空洞輪の空洞が波紋状とされている。駆動部材により回動軸を絶えずに
回動駆動する。前記空洞輪が回動軸に固定設置されるので、空洞輪が連動して回動する。
前記空洞輪に三つの空洞が備えられる。ローラが三つの空洞内に位置される。前記空洞輪
の空洞が波紋状とされている。複数個の挿入ロッドをそれぞれ酸素流出チューブ、排気チ
ューブおよび炭素流出チューブ内に移動させることにより、酸素流出チューブ、排気チュ
ーブおよび炭素流出チューブの開放または閉合を実現する。インキュベータ内へ酸素ガス
、二酸化炭素および水分を補充して、気体混合チューブから出た酸素ガス、二酸化炭素お
よび水分を混ぜて、それから気体混合チューブの上端から放出する。駆動部材により回動
軸を絶えずに回動駆動する。前記空洞輪が回動軸に固定設置されるので、空洞輪が連動し
て回動する。前記空洞輪に三つの空洞が備えられる。ローラが三つの空洞内に位置する。
前記空洞輪の空洞が波紋状とされている。複数個の挿入ロッドをそれぞれ酸素流出チュー
ブ、排気チューブおよび炭素流出チューブ内に移動させることにより、酸素流出チューブ
、排気チューブおよび炭素流出チューブを開放または閉合させる。絶えずにインキュベー
タ内の酸素ガス、二酸化炭素および水分を補充して、また温度を維持する。具体的には、
前記水分チューブ、酸素ガスチューブと二酸化炭素チューブは、循環動作しながら、一定
の圧力を持っていて、酸素ガス、二酸化炭素と水分を、それぞれ酸素ガスチューブ、二酸
化炭素チューブと水分チューブから出ることができる。さらに、気体混合チューブにより
、出てきた酸素ガス、二酸化炭素と水分を混ぜて、そして気体混合チューブの上端から放
出する。前記気体混合チューブの上端にエアバッフル柱が設けられることにより、均一に
混ぜた気体を分散させて、培養インキュベータにおける酸素ガス、二酸化炭素と水分をよ
り均一にさせるようにできる。
前記隔離手段は、培養皿の上方に固定設置されるインキュベータ本体内の第１仕切板５０
および第２仕切板５１と、複数個の固定基底の直上方に、且つそれぞれ第１仕切板と第２
仕切板に位置される複数個の空洞チューブ５２と、第１仕切板に設けられる複数個の貫通
穴５３と、空洞チューブに設けられる排気チューブ５４と、第２仕切板に設けられる越流
弁５５と、空洞チューブを封止するための封止蓋５６と、空洞チューブの上端に固定設置
される弧状の環形突起５７と、環形突起と嵌合可能に封止蓋に設置される弧形円溝５８と
、蓋翻蓋を封止するための複数のフリップ構造５９とを含む。ピストンレバーが上昇する
と、固定基底と培養皿が連動して上昇する。固定基底と培養皿が空洞チューブ内に上昇す
ると、固定基底と空洞チューブが封止状態になる。固定基底が続けて上昇すると、空洞チ
ューブ内の気体が排気チューブを介して排出する。固定基底が排気チューブの管口まで上
昇すると、上昇が停止する。固定基底により排気チューブを封止する。フリップ構造によ
り封止蓋を開放駆動する。このようになると、培養皿がインキュベータの外に位置するよ
うになるので、容易に取り出される。培養皿を戻し入れる過程では、まずフリップ構造に
より封止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにして、つぎに、ピストンレバーが下降し
、固定基底と培養皿が連動して下降し、排気チューブが開放されるようになり、インキュ
ベータ本体内の気体が空洞チューブ中に入り、これによりピストンレバーに連動して固定
基底と培養皿が最下位置に下降すると、下降が停止する。このとき、培養皿が培養インキ
ュベータ内に位置するようになる。ピストンレバーを上昇させることにより、固定基底と
培養皿が連動して上昇して、固定基底と培養皿を空洞チューブ内に位置させる。固定基底
と空洞チューブにより封止状態を実現して培養インキュベータ内との隔離を実現できる。
固定基底が続けて上昇すると、空洞チューブ内の気体が排気チューブから排出する。これ
により、圧力による受精卵への悪影響を避ける。固定基底が排気チューブの管口まで上昇
すると、上昇が停止する。さらに、固定基底により排気チューブを封止することにより、
培養インキュベータと培養皿とを完全に隔離させる。さらに、フリップ構造により封止蓋
を開放駆動することにより、培養皿をインキュベータの外に位置させるようにでき、これ
で容易に取り出される。培養皿を戻し入れる過程では、まずフリップ構造により封止蓋を
駆動して空洞チューブを覆うようにして、つぎに、ピストンレバーが下降し、固定基底と
培養皿が連動して下降し、こうして、排気チューブが開放されるようになり、インキュベ
ータ本体内の気体が空洞チューブ中に入り、これによりピストンレバーに連動して固定基
底と培養皿が最下位置に下降すると、下降が停止する。このとき、培養皿が培養インキュ
ベータ内に位置する。これによって、培養皿の取出または送入が実現される。
前記フリップ構造５９は、封止蓋に固定設置される第１固定板５９１と、インキュベータ
本体に固定設置される第２固定板５９２と、一端が第１固定板に回動可能に設けられ、か
つ他端が第２固定板に回動可能に設けられる第１回動ロッド５９３および第２回動ロッド
５９４と、第２回動ロッドを回動駆動するための第２モータ５９５と、インキュベータ本
体に固定設置される弧形案内レール５９６と、弧形案内レールに設けられる弧形滑動ブロ
ック５９７と、弧形案内レール内に位置される、弧形滑動ブロックを復帰させるためのバ
ネ５９８とを含む。前記弧形滑動ブロックと第２回動ロッドとが、固定接続されている。
第２モータにより第２回動ロッドを回動駆動して、それを第２モータを軸芯として回動さ
せる。弧形滑動ブロックが弧形案内レールにおいて移動しながら、第２回動ロッドに追従
して封止蓋が回動する。前記第１回動ロッドは一端が第１固定板に回動可能に設けられ、
かつ他端が第２固定板に回動可能に設けられるので、第２回動ロッドが回動して、第１回
動ロッドが連動して回動する。このようにして、封止蓋のフリップ動作が完成する。そし
て、第２モータが動作を停止して、バネにより弧形滑動ブロックを復帰駆動し、即ち、第
２回動ロッドを復帰させる。最終的に、封止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにさせ
る。第２モータにより第２回動ロッドを回動駆動する。第２モータを軸芯として第１固定
板を回動させ、即ち、封止蓋を回動させる。前記弧形滑動ブロックが第２回動ロッドに固
定されるので、弧形案内レールにおいて弧形滑動ブロックを移動させる。前記第１回動ロ
ッドは一端が第１固定板に回動可能に設けられ、他端が第２固定板に回動可能に設けられ
るので、封止蓋を回動させながらフリップさせることができる。このような構成により、
環形突起と封止蓋の弧形円溝との摩擦による漏気を避けるとともに、封止蓋のフリップ動
作が実現する。封止蓋を覆わせる過程中では第２モータは動作停止としている。バネによ
り弧形滑動ブロックを復帰駆動させ、即ち第２回動ロッドを復帰させる。最終的には、封
止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにさせる。バネによる第２回動ロッドへの押力に
より、封止蓋を空洞チューブの上端に緊押圧させるようにでき、封止の効果がより好適で
ある。
本発明の利点は下記の通りである。
上記手段によって、受精卵の生存率が向上するだけでなく、さらに培養インキュベータを
設けることにより、絶えずに受精卵を観察する過程において、培養インキュベータ内の栄
養条件を維持できるようになる。
本発明の構成図である。 隔離手段（機構）の一部構成図である。 図2のAの拡大図である。 制御装置の正面図である。 図4のBの拡大図である。 本発明の断面図1である。 図6のCの拡大図である。 図6のDの拡大図である。 本発明の断面図2である。 制御装置の断面図である。 図10のEの拡大図である。 図12は、隔離手段（機構）の一部の構成を示す概略図である。 昇降装置の断面の構造を示す図である。 昇降装置の一部分の構成図である。
本発明の実施例および附図を利用して、本発明実施例中における技術案をさらに明確的に
、十分的に説明する。明らかには、記載した実施例は、単に本発明の一部実施例であり、
すべての実施例とは理解してはならない。本発明の実施例に基づいて、本分野の当業者に
よって創造的な労働を費やさず得られる全ての実施例は、本発明に保護を求める範囲に含
まれる。
実施例一
胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法は以下の工程を含む。
ａ、卵母細胞の培養
採集された卵母細胞の複合体を成熟液中に移入し、成熟液の微滴ごとに１５個の卵母細胞
を移入し、３８℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境で２４時間培養し、卵母細胞の複合体
を卵子に成熟させる。
ｂ、精液処理
新鮮または解凍後の精液を取り、精子希釈液と希釈し、受精液滴ごとに精子希釈液を移入
し、受精液滴を含み培養皿や培養プレートをＣＯ２培養インキュベータ中に入れて２時間
静置する。
ｃ、インビトロ受精
成熟液における成熟卵子を、受精液滴ごとに４０個の成熟卵子の比で受精液滴中に移入し
、そして３８℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境の培養インキュベータ中に入れてインビ
トロ受精し、２０時間培養する。
ｄ、受精卵子の培養
精子と卵子を受精させて２０時間培養した後、受精卵子の周囲にある顆粒細胞および付着
される精子を除去し、３０個／滴の密度で胚の発育液滴中に入れて、飽和湿度の培養イン
キュベータにおいて６日にわたってインビトロ培養する。
図１〜１４に示すように、前記工程ｄにおける培養インキュベータは、インキュベータ本
体１と、インキュベータ本体内に配置される複数個の培養皿２と、複数個の培養皿を単独
に昇降させる昇降装置と、インキュベータ本体内の温度およびＣＯ２およびＯ２を制御す
る制御装置と、培養皿の取出または送入過程中でインキュベータ本体と隔離させる隔離手
段を含む。前記昇降装置は、インキュベータ本体に等距離で環状に固定設置される複数個
の中空チューブ３０と、複数個の中空チューブのチャンバーに連通設置される中空トレイ
３１と、中空チューブ内に位置されるピストンレバー３２と、ピストンレバーの上端に固
定設置される培養皿配置用の固定基底３３と、中空トレイの軸芯に位置されかつ中空トレ
イ内に差し込まれる入気チューブ３４と、中空トレイに設けられる吸気チューブ３５と、
中空トレイ内に設けられる中空チューブ封止用の封止部材３６と、封止部材に設けられる
キャビティ３７と、封止部材に設けられるキャビティと入気チューブを連通させる接続チ
ューブ３８と、入気チューブに固定設置される大ギア３９と、大ギアと噛み合う小ギア３
００と、小ギアを回動駆動する第１モータ３１０とを含む。吸気チューブは中空トレイと
中空チューブ内の空気を吸い出すように形成される。中空チューブ内のピストンレバーを
最下端に下降させると、固定基底に配置される培養皿が培養インキュベータ内に位置する
。ある1つの培養皿を取るときには、第１モータにより小ギアを回動駆動して、大ギアが
連動して回動する。前記大ギアが入気チューブに固定設置されるので、入気チューブが連
動して回動する。入気チューブと封止部材とが接続チューブにより接続されるので、封止
部材が連動して入気チューブを軸芯として回動する。封止部材が、取り出そうとする培養
皿の直下に位置し、即ち中空チューブの直下に位置すると、該中空チューブが封止部材上
のキャビティと接続チューブにより入気チューブに連通するようになり、さらに入気チュ
ーブに気体を送り入れることにより、ピストンレバーと固定基底および培養皿が連動して
一緒に上昇する。このようにすると、単一の培養皿の取出しがなされる。
前記制御装置は、酸素ガスチューブ４０と、酸素ガスチューブの上方に位置される水分チ
ューブ４１と、水分チューブの上方に位置される二酸化窒素チューブ４２と、酸素ガスチ
ューブに等間隔にて環状に配布される複数個の酸素流出チューブ４３と、水分チューブに
等間隔にて環状に配布される複数個の排気チューブ４４と、二酸化炭素チューブに等間隔
にて環状に配布される複数個の炭素流出チューブ４５と、それぞれ複数個の酸素流出チュ
ーブ、排気チューブおよび炭素流出チューブ内に差し込まれる複数個の挿入ロッド４６と
、複数個の挿入ロッドの中央に位置される回動軸４７と、回動軸を回動駆動する駆動部材
４８と、回動軸を貫通させるように固定設置される空洞輪４９と、挿入ロッドの一端に回
動自由に設置されるローラ４００と、酸素ガス、二酸化炭素および水分を混ぜる複数個の
気体混合チューブ４１０と、気体混合チューブの上方にそれぞれ設けられる複数個のエア
バッフル柱４２０とを含む。空洞輪に三つの空洞が備えられる。ローラが三つの空洞内に
位置される。前記空洞輪の空洞が波紋状とされている。駆動部材により回動軸を絶えずに
回動駆動する。前記空洞輪が回動軸に固定設置されるので、空洞輪が連動して回動する。
前記空洞輪に三つの空洞が備えられる。ローラが三つの空洞内に位置される。前記空洞輪
の空洞が波紋状とされている。複数個の挿入ロッドをそれぞれ酸素流出チューブ、排気チ
ューブおよび炭素流出チューブ内に移動させることにより、酸素流出チューブ、排気チュ
ーブおよび炭素流出チューブの開放または閉合を実現する。インキュベータ内へ酸素ガス
、二酸化炭素および水分を補充して、気体混合チューブから出た酸素ガス、二酸化炭素お
よび水分を混ぜて、それから気体混合チューブの上端から放出する。
前記隔離手段は、培養皿の上方に固定設置されるインキュベータ本体内の第１仕切板５０
および第２仕切板５１と、複数個の固定基底の直上方に、且つそれぞれ第１仕切板と第２
仕切板に位置される複数個の空洞チューブ５２と、第１仕切板に設けられる複数個の貫通
穴５３と、空洞チューブに設けられる排気チューブ５４と、第２仕切板に設けられる越流
弁５５と、空洞チューブを封止するための封止蓋５６と、空洞チューブの上端に固定設置
される弧状の環形突起５７と、環形突起と嵌合可能に封止蓋に設置される弧形円溝５８と
、蓋翻蓋を封止するための複数のフリップ構造５９とを含む。ピストンレバーが上昇する
と、固定基底と培養皿が連動して上昇する。固定基底と培養皿が空洞チューブ内に上昇す
ると、固定基底と空洞チューブが封止状態になる。固定基底が続けて上昇すると、空洞チ
ューブ内の気体が排気チューブを介して排出する。固定基底が排気チューブの管口まで上
昇すると、上昇が停止する。固定基底により排気チューブを封止する。フリップ構造によ
り封止蓋を開放駆動する。このようになると、培養皿がインキュベータの外に位置するよ
うになるので、容易に取り出される。培養皿を戻し入れる過程では、まずフリップ構造に
より封止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにして、つぎに、ピストンレバーが下降し
、固定基底と培養皿が連動して下降し、排気チューブが開放されるようになり、インキュ
ベータ本体内の気体が空洞チューブ中に入り、これによりピストンレバーに連動して固定
基底と培養皿が最下位置に下降すると、下降が停止する。このとき、培養皿が培養インキ
ュベータ内に位置するようになる。
前記フリップ構造５９は、封止蓋に固定設置される第１固定板５９１と、インキュベータ
本体に固定設置される第２固定板５９２と、一端が第１固定板に回動可能に設けられ、か
つ他端が第２固定板に回動可能に設けられる第１回動ロッド５９３および第２回動ロッド
５９４と、第２回動ロッドを回動駆動するための第２モータ５９５と、インキュベータ本
体に固定設置される弧形案内レール５９６と、弧形案内レールに設けられる弧形滑動ブロ
ック５９７と、弧形案内レール内に位置される、弧形滑動ブロックを復帰させるためのバ
ネ５９８とを含む。前記弧形滑動ブロックと第２回動ロッドとが、固定接続されている。
第２モータにより第２回動ロッドを回動駆動して、それを第２モータを軸芯として回動さ
せる。弧形滑動ブロックが弧形案内レールにおいて移動しながら、第２回動ロッドに追従
して封止蓋が回動する。前記第１回動ロッドは一端が第１固定板に回動可能に設けられ、
かつ他端が第２固定板に回動可能に設けられるので、第２回動ロッドが回動して、第１回
動ロッドが連動して回動する。このようにして、封止蓋のフリップ動作が完成する。そし
て、第２モータが動作を停止して、バネにより弧形滑動ブロックを復帰駆動し、即ち、第
２回動ロッドを復帰させる。最終的に、封止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにさせ
る。
上記第１モータと第２モータは、市販されるものとすればよい。
実施例二
胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法は以下の工程を含む。
ａ、卵母細胞の培養
採集された卵母細胞の複合体を成熟液中に移入し、成熟液の微滴ごとに２０個の卵母細胞
を移入し、３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境で２６時間培養し、卵母細胞の複合体
を卵子に成熟させる。
ｂ、精液処理
新鮮または解凍後の精液を取り、精子希釈液と希釈し、受精液滴ごとに精子希釈液を移入
し、受精液滴を含み培養皿や培養プレートをＣＯ２培養インキュベータ中に入れて３時間
静置する。
ｃ、インビトロ受精
成熟液における成熟卵子を、受精液滴ごとに５０個の成熟卵子の比で受精液滴中に移入し
、そして３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境の培養インキュベータ中に入れてインビ
トロ受精し、２４時間培養する。
ｄ、受精卵子の培養
精子と卵子を受精させて２４時間培養した後、受精卵子の周囲にある顆粒細胞および付着
される精子を除去し、４０個／滴の密度で胚の発育液滴中に入れて、飽和湿度の培養イン
キュベータにおいて８日にわたってインビトロ培養する。
実施例三
胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法は以下の工程を含む。
ａ、卵母細胞の培養
採集された卵母細胞の複合体を成熟液中に移入し、成熟液の微滴ごとに１０個の卵母細胞
を移入し、３８℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境で２２時間培養し、卵母細胞の複合体
を卵子に成熟させる。
ｂ、精液処理
新鮮または解凍後の精液を取り、精子希釈液と希釈し、受精液滴ごとに精子希釈液を移入
し、受精液滴を含み培養皿や培養プレートをＣＯ２培養インキュベータ中に入れて２時間
静置する。
ｃ、インビトロ受精
成熟液における成熟卵子を、受精液滴ごとに３０個の成熟卵子の比で受精液滴中に移入し
、そして３８℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境の培養インキュベータ中に入れてインビ
トロ受精し、１８時間培養する。
ｄ、受精卵子の培養
精子と卵子を受精させて１８時間培養した後、受精卵子の周囲にある顆粒細胞および付着
される精子を除去し、１５個／滴の密度で胚の発育液滴中に入れて、飽和湿度の培養イン
キュベータにおいて６日にわたってインビトロ培養する。

Claims (3)

  1. 胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法であって、
    ａ、卵母細胞の培養
    採集された卵母細胞の複合体を成熟液中に移入し、成熟液の微滴ごとに１０〜２０個の卵
    母細胞を移入し、３８〜３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境で２２〜２６時間培養し
    、卵母細胞の複合体を卵子に成熟させる工程aと、
    ｂ、精液処理
    新鮮または解凍後の精液を取り、精子希釈液と希釈し、受精液滴ごとに精子希釈液を移入
    し、受精液滴を含み培養皿や培養プレートをＣＯ２培養インキュベータ中に入れて２〜３
    時間静置する工程bと、
    ｃ、インビトロ受精
    成熟液における成熟卵子を、受精液滴ごとに３０〜５０個の成熟卵子の比で受精液滴中に
    移入し、そして３８〜３９℃、５％ＣＯ２、かつ飽和湿度環境の培養インキュベータ中に
    入れてインビトロ受精し、１８〜２４時間培養する工程cと、
    ｄ、受精卵子の培養
    精子と卵子を受精させて１８〜２４時間培養した後、受精卵子の周囲にある顆粒細胞およ
    び付着される精子を除去し、１５〜４０個／滴の密度で胚の発育液滴中に入れて、飽和湿
    度の培養インキュベータにおいて６〜８日にわたってインビトロ培養する工程dと、を含
    み、
    前記工程ｄにおける培養インキュベータは、インキュベータ本体１と、インキュベータ本
    体内に配置される複数個の培養皿２と、複数個の培養皿を単独に昇降させる昇降装置と、
    インキュベータ本体内の温度およびＣＯ２およびＯ２を制御する制御装置と、培養皿の取
    出または送入過程中でインキュベータ本体と隔離させる隔離手段を含み、前記昇降装置は
    、インキュベータ本体に等距離で環状に固定設置される複数個の中空チューブ３０と、複
    数個の中空チューブのチャンバーに連通設置される中空トレイ３１と、中空チューブ内に
    位置されるピストンレバー３２と、ピストンレバーの上端に固定設置される培養皿配置用
    の固定基底３３と、中空トレイの軸芯に位置されかつ中空トレイ内に差し込まれる入気チ
    ューブ３４と、中空トレイに設けられる吸気チューブ３５と、中空トレイ内に設けられる
    中空チューブ封止用の封止部材３６と、封止部材に設けられるキャビティ３７と、封止部
    材に設けられるキャビティと入気チューブを連通させる接続チューブ３８と、入気チュー
    ブに固定設置される大ギア３９と、大ギアと噛み合う小ギア３００と、小ギアを回動駆動
    する第１モータ３１０とを含み、吸気チューブは中空トレイと中空チューブ内の空気を吸
    い出すように形成され、中空チューブ内のピストンレバーを最下端に下降させると、固定
    基底に配置される培養皿が培養インキュベータ内に位置し、ある1つの培養皿を取るとき
    には、第１モータにより小ギアを回動駆動して、大ギアが連動して回動し、前記大ギアが
    入気チューブに固定設置されるので、入気チューブが連動して回動し、入気チューブと封
    止部材とが接続チューブにより接続されるので、封止部材が連動して入気チューブを軸芯
    として回動し、封止部材が、取り出そうとする培養皿の直下に位置し、即ち中空チューブ
    の直下に位置すると、該中空チューブが封止部材上のキャビティと接続チューブにより入
    気チューブに連通するようになり、さらに入気チューブに気体を送り入れることにより、
    ピストンレバーと固定基底および培養皿が連動して一緒に上昇し、単一の培養皿の取出し
    がなされることを特徴とする胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法
    。
  2. 前記隔離手段は、培養皿の上方に固定設置されるインキュベータ本体内の第１仕切板５０
    および第２仕切板５１と、複数個の固定基底の直上方に、且つそれぞれ第１仕切板と第２
    仕切板に位置される複数個の空洞チューブ５２と、第１仕切板に設けられる複数個の貫通
    穴５３と、空洞チューブに設けられる排気チューブ５４と、第２仕切板に設けられる越流
    弁５５と、空洞チューブを封止するための封止蓋５６と、空洞チューブの上端に固定設置
    される弧状の環形突起５７と、環形突起と嵌合可能に封止蓋に設置される弧形円溝５８と
    、蓋翻蓋を封止するための複数のフリップ構造５９とを含み、ピストンレバーが上昇する
    と、固定基底と培養皿が連動して上昇し、固定基底と培養皿が空洞チューブ内に上昇する
    と、固定基底と空洞チューブが封止状態になり、固定基底が続けて上昇すると、空洞チュ
    ーブ内の気体が排気チューブを介して排出し、固定基底が排気チューブの管口まで上昇す
    ると、上昇が停止し、固定基底により排気チューブを封止し、フリップ構造により封止蓋
    を開放駆動し、培養皿がインキュベータの外に位置するようになるので、容易に取り出さ
    れ、培養皿を戻し入れる過程では、まずフリップ構造により封止蓋を駆動して空洞チュー
    ブを覆うようにして、つぎに、ピストンレバーが下降し、固定基底と培養皿が連動して下
    降し、排気チューブが開放されるようになり、インキュベータ本体内の気体が空洞チュー
    ブ中に入り、これによりピストンレバーに連動して固定基底と培養皿が最下位置に下降す
    ると、下降が停止し、このとき、培養皿が培養インキュベータ内に位置することを特徴と
    する請求項１に記載の胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法。
  3. 前記フリップ構造５９は、封止蓋に固定設置される第１固定板５９１と、インキュベータ
    本体に固定設置される第２固定板５９２と、一端が第１固定板に回動可能に設けられ、か
    つ他端が第２固定板に回動可能に設けられる第１回動ロッド５９３および第２回動ロッド
    ５９４と、第２回動ロッドを回動駆動するための第２モータ５９５と、インキュベータ本
    体に固定設置される弧形案内レール５９６と、弧形案内レールに設けられる弧形滑動ブロ
    ック５９７と、弧形案内レール内に位置される弧形滑動ブロックを復帰させるためのバネ
    ５９８とを含み、前記弧形滑動ブロックと第２回動ロッドとが、固定接続されており、第
    ２モータにより第２回動ロッドを回動駆動して、それを第２モータを軸芯として回動させ
    、弧形滑動ブロックが弧形案内レールにおいて移動しながら、第２回動ロッドに追従して
    封止蓋が回動し、前記第１回動ロッドは一端が第１固定板に回動可能に設けられ、かつ他
    端が第２固定板に回動可能に設けられるので、第２回動ロッドが回動して、第１回動ロッ
    ドが連動して回動し、このようにして、封止蓋のフリップ動作が完成し、そして、第２モ
    ータが動作を停止して、バネにより弧形滑動ブロックを復帰駆動し、即ち、第２回動ロッ
    ドを復帰させ、最終的に、封止蓋を駆動して空洞チューブを覆うようにさせることを特徴
    とする請求項２に記載の胚のインビトロ培養用の高生存率のヒツジ受精卵の培養方法。
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