CN111727934A - 一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及全雄中华鳖苗种繁育技术，尤其涉及一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法。包括鳖蛋控温孵化、鳖蛋雌激素处理、稚鳖温室养殖、伪雌鳖筛选和亲鳖塘繁育步骤，其中，鳖蛋控温孵化中控制鳖蛋孵化温度为28±1℃；鳖蛋雌激素处理为在中华鳖胚胎孵化的15‑18时期，每个时期在最靠近胚胎位置的蛋壳面滴加雌二醇溶液，伪雌鳖筛选采用荧光定量PCR技术。本发明采用性激素滴加诱导伪雌鳖技术，操作简单，转化率高，稚鳖温室养殖大大缩短了性成熟周期，将利用荧光定量PCR技术筛选出的伪雌鳖与原系雄鳖正常交配可达到全雄鳖苗种。本发明提供的全雄中华鳖苗种繁育方法周期短、商品化程度高，可以显著提高经济效益。

Description

一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法

技术领域

本发明涉及全雄中华鳖苗种繁育技术，尤其涉及一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法。

技术背景

中华鳖(Pelodiscus sinensis)俗称甲鱼，是我国重要的名贵水产养殖品种。中华鳖雄鳖比雌鳖生长速度快，裙边宽厚，脂肪少，价格高，因此开展中华鳖全雄苗种单性养殖可以显著提高经济效益，对中华鳖养殖产业发展具有重大意义。

正常发育中华鳖性别决定属雌性异配型，即雌鳖性染色体为ZW型，雄鳖性染色体为ZZ型。对早期中华鳖鳖蛋进行17β-雌二醇药物处理，可以诱导中华鳖未分化的性腺向雌性性腺发育，产生中华鳖性腺为卵巢基因型为ZZ的伪雌鳖。筛选出中华伪雌鳖(ZZ)与原系中华鳖雄鳖(ZZ)进行繁殖，能够实现全雄鳖繁殖。

目前缺乏经济、高效的全雄中华鳖苗种繁育技术，尤其对于伪雌鳖的人工诱导方式还比较复杂，转化率较低；同时对伪雌鳖的鉴定方式也较为复杂，不仅会导致中华鳖死亡，也无法适用于大批量中华鳖样品鉴定。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法。

本发明采用了以下技术方案：

一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，包括以下步骤：

S1.鳖蛋控温孵化：控制鳖蛋孵化温室温度为28±1℃；

S2.鳖蛋雌激素处理：对中华鳖胚胎孵化至15-18时期的鳖蛋，每个时期进行一次药物处理，所述药物处理位置是最靠近胚胎的蛋壳面滴加雌二醇溶液；

S3.稚鳖温室养殖：稚鳖出壳后约1周时间，将稚鳖转移到温室成鳖养殖水池，控制水池温度32摄氏度并每日定时喂食。

S4.伪雌鳖筛选：设定一组中华鳖伪雌鳖性别鉴定引物对，包括一对目的基因18SrRNA和内参基因Gapdh，采用荧光定量PCR反应，利用性成熟的中华鳖表型雌鳖个体的目的基因18S rRNA在W和Z染色体上DNA拷贝数的不同将伪雌鳖筛选出来，所述目的基因18SrRNA和内参基因Gapdh引物均包括F和R两条引物，所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh的引物序列如下所示：

表一.引物序列

Table1.Perimer sequences

S5.亲鳖塘繁育：将步骤S4鉴定出的伪雌鳖与雄鳖在亲鳖塘繁殖得到子代全雄鳖。

优选的，步骤S1鳖蛋控温孵化中鳖蛋放置在温室中的孵化箱孵化，所述孵化箱底部预先铺厚度为5cm的蛭石，调整鳖蛋的动物极向上放置，并在鳖蛋上覆盖约1cm厚的蛭石，所述蛭石湿度在8-12％RH。

优选的，步骤S2中雌二醇溶液滴加剂量为5μL/次，滴加浓度为50μg/μL，所述雌二醇溶液采用95wt％乙醇为溶剂进行配置。

优选的，步骤S2中中华鳖胚胎孵化时期采用胚胎发育形态特征判断，所述15-18时期的胚胎发育形态变化特征如下：

优选的，步骤S4中每日定时喂食的时间为早9点和晚5点，每次饲料投喂量为当前稚鳖体重的5-7％。

作为上述荧光定量PCR无创鉴别中华鳖伪雌鳖的方法进一步的技术方案：

优选的，鉴别中华鳖伪雌鳖的具体步骤为：

S41、取50只以上确定性别为雄性的中华鳖血液DNA，每只个体采用20μL PCR反应液体系设置一组反应管，每组反应管中分别加入目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物对，每个目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh做3个平行重复孔，进行荧光定量PCR扩增，计算目的基因18S rRNA相对拷贝数；

S42、从步骤S41的雄性中华鳖中选取一只作为对照样本A，设定对照样本A的18SrRNA相对拷贝数为1，计算其他雄性中华鳖个体18S rRNA相对拷贝数相比于A的相对值，得到所有雄性中华鳖18S rRNA相对拷贝数的相对值，求所有雄鳖相对值的平均值

和标准差SD，以

作为阈值；

S43、从温室成鳖养殖水池的性成熟的中华鳖中，筛选出表型雌鳖的个体，提取血液DNA，以步骤S41中方式进行荧光定量PCR反应，得到每只表型雌鳖的目的基因18S rRNA相对拷贝数，计算每只表型雌鳖的相对拷贝数相对步骤S2中对照样本A的相对拷贝数的相对值Y；

S44、将步骤S43计算的相对值Y与步骤S42设定的阈值进行比较，如

则为雌鳖，

则为伪雌鳖。

优选的，步骤S41中所述20μL PCR反应液体系为：

优选的，步骤S41中所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：

优选的，步骤S41中所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物对的储存浓度为10μmol/L。

优选的，步骤S41中所述目的基因18S rRNA相对拷贝数的计算方式为：设定Gapdh为内参基因，将目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh扩增的Ct值带入相对定量计算公式2^-ΔΔCt，从而获得每只个体的18S rRNA相对拷贝数。

本发明的有益效果在于：

1.本发明采用中华鳖鳖蛋28±1℃适宜温度孵化和在胚胎期进行药物处理相结合的方法进行中华鳖雌雄孵化比例的调整，28±1℃的温度可以保证中华鳖的正常孵化和维持较好的孵化速度，同时由于中华鳖属于温度依赖型性别决定(TSD)动物，此温度下孵化又不至于使温度过高导致雌性孵化比例降低；使用雌二醇进行药物处理进一步增加中华鳖的原雄性个体性逆转比例，本方法操作简单、成本低，最终可以达到93％以上的雌鳖孵化比率。

2.本发明利用温室养殖稚鳖，大大缩短了稚鳖发育至性成熟的时间，结合亲鳖池繁育手段，将全雄鳖鳖苗的产出时间压缩到了1年半至2年时间，相较于普通全雄鳖培育方法，周期可以缩短4年以上。

3.本发明利用中华伪雌鳖(ZZ)与原系中华鳖雄鳖(ZZ)进行繁殖，能够实现全雄鳖繁殖，本发明培养的全雄中华鳖安全健康，品质优良，商品化程度高。配合全雄中华鳖苗种养殖周期的缩短，可以使中华鳖的规模养殖的经济效益较使用传统养殖方法提高50％以上，经济效果显著。

4.本发明采用荧光定量PCR无创鉴别中华鳖伪雌鳖，采用中华鳖尾部取血方法取微量血液，克服了现有技术存在造成伪雌鳖死亡或创伤的缺点，对中华鳖生长发育无任何不良影响。荧光定量PCR方法具有灵敏度高、稳定性好、特异性强的特点，相较于普通的PCR方法可以清晰准确反映出中华鳖性别与基因拷贝数量间的定量关系，本发明采用的荧光定量PCR技术还可以适用于大批量的中华鳖样品鉴定，为研究中华鳖性别基因调控提供基础。

附图说明

图1是50只雄鳖的荧光定量结果相对值的条形图，其中横坐标为样品编号，纵坐标为目的基因的相对拷贝数。

具体实施方式

为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：

本发明中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

本发明中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明中的比例，如无特别说明，均为体积比例。

实施例1：鳖蛋控温孵化

取120颗已受精的中华鳖鳖蛋，单层放置在孵化箱中，孵化箱中预先铺约5cm厚的蛭石，调整鳖蛋的动物极向上，并继续在鳖蛋上覆盖蛭石，蛭石覆盖厚度约1cm。将孵化箱放置于温度在28±1℃，空气湿度在80-85％的温室中，孵化箱中蛭石湿度保持在8-12％之间，每日观察中华鳖胚胎发育情况。

实施例2：鳖蛋雌激素处理

以实施例1孵化箱中随机60颗鳖蛋作为处理组，在中华鳖鳖蛋内胚胎孵化至15期时，开始进行雌激素处理。雌激素为以95wt％乙醇为溶剂配置的终浓度为50μg/μL的17β-雌二醇溶液，利用照蛋器确定中华鳖胚胎在鳖蛋中的分布位置，在最靠近胚胎位置的蛋壳面滴加5μL的17β-雌二醇溶液，滴加完成后将鳖蛋放回原位置继续孵化并每日观察。对中华鳖胚胎孵化至15-18时期的鳖蛋，每个时期进行一次药物处理，每次滴加的方式位置和用量都不变，共进行四次雌激素处理；

以实施例1孵化箱中剩余60枚鳖蛋作为对照组，在每只鳖蛋胚胎孵化的15-18期，在最靠近胚胎位置的蛋壳面滴加5μL 95wt％乙醇，其他孵化条件与处理组完全相同并每日观察。

上述胚胎孵化时期均采用胚胎发育形态特征进行判断，15-18时期的胚胎发育形态变化特征如下：

实施例3：稚鳖温室养殖

鳖蛋孵化至稚鳖出壳后约1周时间，将稚鳖转移到温室成鳖养殖水池，控制水池温度为32℃并每日投喂二次饲料，饲料投喂时间在早9点和晚5点，每次饲料投喂量约为当前稚鳖体重的5-7％，养殖约1龄时，稚鳖发育性成熟。

实施例4:伪雌鳖的鉴定

1.统计对照组和处理组中华鳖的表型雌雄数量

稚鳖在温室成鳖养殖水池培育至性成熟后，观察中华鳖性腺的发育状况，记录处理组和对照组中华鳖的表型雌雄数量并进行统计分析，结果如下表1所示：

表1对照组和处理组中中华鳖的表型雌雄数量

由表1可知，处理组的表型雌鳖比例显著高于对照组，说明处理组中有一部分染色体为ZZ的中华鳖雄鳖发育成表观为雌性的伪雌鳖；在中华鳖胚胎孵化至15-18时期即中华鳖性腺分化的关键时期进行雌激素处理能够达到较好的性别逆转效果，且这种处理方式操作简便、成本低，适合于生产。

2.荧光定量PCR测试

对中华鳖进行荧光定量PCR测试，具体步骤如下：

2.1中华鳖抽血

1)将上述处理组筛选出的中华鳖表型雌鳖置于干净台面上，控制鳖并将尾部拉直。

2)针头刺入尾部两侧的位置，略微搅动针头，有血渗出后，缓缓拉动注射器取出血液。

2.2中华鳖血液中DNA的提取

对每组中华鳖血液进行总DNA的提取，提取后的DNA以ddH₂O进行50倍稀释。用18SrRNA作为目的基因引物，Gapdh为内参，稀释的DNA作为模板进行荧光定量PCR。基因组DNA提取过程如下：

1)取5～10μL新鲜或冷冻的中华鳖血液样品，加入Buffer GTL补足至200μL；

2)加入20μL Proteinase K；

3)加入200μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴10分钟；

4)短暂离心以去除管盖内壁的水珠，加入200μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心；

5)上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中，若一次不能加完溶液，可分多次转入，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6)向吸附柱中加入500μL Buffer GW1，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

7)向吸附柱中加入500μL Buffer GW2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8)重复步骤7。

9)12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

10)将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μLBuffer GE或灭菌水，室温放置2～5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA，以便进行后续荧光定量PCR实验。

2.3中华鳖血液DNA荧光定量荧光定量PCR

根据美国国立生物信息中心(NCBI)Gen-Bank已收录的目的基因序列，使用Oligo6.0进行引物分析，分别设计引物F和R。

引物设计序列如下：

表一.引物序列

Table1.Perimer sequences

按照以下参数配置20μL PCR反应液体系优化方案如下：

按照以下参数采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR(相对定量)进行基因拷贝数分析，反应条件优化方案如下：

2.4统计目的基因的相对拷贝数

PCR扩增结束后，设定Gapdh为内参基因，将18S rRNA和Gapdh扩增的Ct值带入相对定量计算公式2^-ΔΔCt，从而获得各例个体18S rRNA相对拷贝数。

3.确定阈值

取50只性别确定为雄性的中华鳖的血液，参照上述步骤2的步骤做荧光定量PCR，测定基因拷贝数，以样品编号1雄鳖的基因拷贝数为参照，设定为1，计算其他49只雄鳖基因拷贝数值与这只雄鳖基因拷贝数值的相对值Y，50只雄鳖荧光定量结果的相对值如图1所示，利用50只雄鳖荧光定量结果相对值求平均值

和标准差SD，以

作为阈值，得阈值为2.57。

4.筛选伪雌鳖

观察上述步骤1中处理组的中华鳖，根据外观性别的差异将雄鳖和表型雌鳖分辨开，雄鳖筛选出来进行继续养殖，表型雌鳖进行上述步骤2中荧光定量PCR，测定基因拷贝数，将表型雌鳖的基因拷贝数值与上述步骤3中样品编号1雄鳖的基因拷贝数值对比，计算得到基因的相对拷贝数值Y；

将表型雌鳖基因相对拷贝数值Y与上述步骤3得到的阈值相对比，如

则为雌鳖，

则为伪雌鳖，从而将伪雌鳖筛选出来。

实施例5：亲鳖塘繁育

将实施例4鉴定出的伪雌鳖转移到繁殖池与正常雄鳖进行繁殖，子代即为全雄中华鳖。

实施例6:雌激素处理的伪雌转化率

采用本发明等同实施例1-实施例4的方法对一组200枚已受精鳖蛋进行性激素处理与伪雌鳖鉴定，得到有效样本数200，其中表现型为雌性的个体数量为191只，雌性比例95.5％；经伪雌鳖鉴定，伪雌鳖数量为96只，即200只中华鳖中原有雄性个体达到105只，伪雌转化率达到91.43％。

以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.鳖蛋控温孵化：控制鳖蛋孵化温室温度为28±1℃；

S2.鳖蛋雌激素处理：对中华鳖胚胎孵化至15-18时期的鳖蛋，每个时期进行一次药物处理，所述药物处理位置为最靠近胚胎的蛋壳面滴加雌二醇溶液；

S3.稚鳖温室养殖：稚鳖出壳后约1周时间，将稚鳖转移到温室成鳖养殖水池，控制水池温度32摄氏度并每日定时喂食至中华鳖性成熟。

S4.伪雌鳖筛选：设定一组中华鳖伪雌鳖性别鉴定引物对，包括一对目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh，采用荧光定量PCR反应，利用性成熟的中华鳖表型雌鳖个体的目的基因18S rRNA在W和Z染色体上DNA拷贝数的不同将伪雌鳖筛选出来，所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物均包括F和R两条引物，所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh的引物序列如下所示：

表一.引物序列

Table1.Perimer sequences

S5.亲鳖塘繁育：将步骤S4鉴定出的伪雌鳖与雄鳖在亲鳖塘繁殖得到子代全雄鳖。

2.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S1鳖蛋控温孵化中鳖蛋放置在控温房的孵化箱孵化，所述孵化箱底部预先铺厚度为5cm的蛭石，调整鳖蛋的动物极向上放置，并在鳖蛋上覆盖约1cm厚的蛭石，所述蛭石湿度在8-12％RH。

3.如权利要求1所述的一种快速全雄中华鳖苗种的繁殖方法，其特征在于：所述步骤S2中雌二醇溶液滴加剂量为5μL/次，滴加浓度为50μg/μL，所述雌二醇溶液采用95wt％乙醇为溶剂进行配置。

4.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于：所述步骤S2中中华鳖胚胎孵化时期采用胚胎发育形态特征判断，所述15-18时期的胚胎发育形态变化特征如下：

5.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S4中每日定时喂食的时间为早9点和晚5点，每次饲料投喂量为当前鳖体重的5-7％。

6.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述S4伪雌鳖筛选的具体步骤为：

S41、取50只以上确定性别为雄性的中华鳖血液DNA，每只个体采用20μL PCR反应液体系设置一组反应管，每组反应管中分别加入目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物对，每个目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh做3个平行重复孔，进行荧光定量PCR扩增，计算目的基因18S rRNA相对拷贝数；

S42、从步骤S41的雄性中华鳖中选取一只作为对照样本A，设定对照样本A的18S rRNA相对拷贝数为1，计算其他雄性中华鳖个体18S rRNA相对拷贝数相比于A的相对值，得到所有雄性中华鳖18S rRNA相对拷贝数的相对值，求所有雄鳖相对值的平均值

和标准差SD，以

作为阈值；

S43、挑选温室成鳖养殖池中性成熟中华鳖的雌鳖个体，提取血液DNA，以步骤S41中方式进行荧光定量PCR反应，得到每只表型雌鳖的目的基因18S rRNA相对拷贝数，计算每只表型雌鳖的相对拷贝数相对步骤S2中对照样本A的相对拷贝数的相对值Y；

S44、将步骤S43计算的相对值Y与步骤S42设定的阈值进行比较，如

则为雌鳖，

则为伪雌鳖。

7.如权利要求6所述的一种快速全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述20μL PCR反应液体系为：

8.如权利要求6或7所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：

9.如权利要求6或7所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物对的储存浓度为10μmol/L。

10.如权利要求6所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述目的基因18S rRNA相对拷贝数的计算方式为：设定Gapdh为内参基因，将目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh扩增的Ct值带入相对定量计算公式2^-ΔΔCt，从而获得每只个体的18S rRNA相对拷贝数。

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