CN108103012B - 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用 - Google Patents

小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108103012B
CN108103012B CN201711338448.4A CN201711338448A CN108103012B CN 108103012 B CN108103012 B CN 108103012B CN 201711338448 A CN201711338448 A CN 201711338448A CN 108103012 B CN108103012 B CN 108103012B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
sperm
sperms
semen
separation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711338448.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108103012A (zh
Inventor
李云霞
丁瑞
胡树香
高原
李喜和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia saikexing reproductive biotechnology (Group) Limited by Share Ltd
Original Assignee
Inner Mongolia Sk Xing Breeding Biotechnology Group Co ltd
Inner Mongolia Saikexing Livestock Breeding And Seed Industry Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Sk Xing Breeding Biotechnology Group Co ltd, Inner Mongolia Saikexing Livestock Breeding And Seed Industry Biotechnology Research Institute Co ltd filed Critical Inner Mongolia Sk Xing Breeding Biotechnology Group Co ltd
Priority to CN201711338448.4A priority Critical patent/CN108103012B/zh
Publication of CN108103012A publication Critical patent/CN108103012A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108103012B publication Critical patent/CN108103012B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明小鼠X/Y精子分离精液的生产方法及应用，属于生物领域，它是应用小鼠X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制精液，用于小鼠的体外受精、人工受精和胞质内精子注射，按照需要定向繁育雄鼠或雌鼠，或者通过小鼠X/Y精子分离精液生产性控胚胎，再进行胚胎移植，加快特殊品系小鼠的繁育速度。通过添加上机分离液来保护小鼠的鲜精，有效的保护了小鼠精子的活力，提高分离效率。

Description

小鼠X/Y精子分离精液的生产方法及应用
技术领域
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法及应用。
背景技术
小鼠是目前应用最广泛、使用数量最多的实验动物，在正常情况下，小鼠繁育的子代公母各占50％。但是在科学研究、药品检测、抗体制备等生产实际中，需要倾向性的更多繁育母鼠或公鼠。因此，通过分离X/Y精子来控制小鼠的子代性别比例显得非常有价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法及应用，将小鼠X/Y精子分离，并实现在体外受精或人工授精实验中使用，从而控制小鼠的子代性别，为小鼠X/Y精子分离技术在实验动物上的应用，提供了有效的技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，其特征在于：它包括以下步骤：
一、配制X/Y精子上机分离液，pH值7.0-7.4，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷 270～320mM
柠檬酸 70～90mM
果糖 60～80mM；
二、小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，包括以下步骤：
(1)、将输精管和附睾放入预热的1ml上机分离液中，用镊子轻轻将精子挤出来；在37℃的培养箱中将精子及输精管和附睾组织共培养10～15min；
(2)、用针从培养皿中将输精管和附睾组织挑出，使精子与上机分离液混匀，用移液枪把混合液转移到5ml离心管中；
(3)、检测新鲜精液的浓度和活力；
(4)、用10ug/ml Hochest 33342在37℃温水浴中染色45min；
(5)、根据小鼠X/Y精子分离的DNA含量差异设定流式细胞分离机参数，通过流式细胞分离机分离X和Y精子；
(6)、根据分离精子累计显示，取分离的X精子和Y精子40～50万，用小鼠体外受精液回收分离好的精子；
(7)、检测分离后小鼠精液的浓度和活力；
(8)、检测分离后小鼠精液的纯度。
所述小鼠X/Y精子分离的DNA含量差异设定为3.2％，流式细胞分离机参数为：第一相区初取精子喷流总数的40％，第二相区X/Y单性精子分离取率30％。
所述流式细胞分离机分离X和Y精子，X和Y精子分离数度控制在100～300个/秒。
上述小鼠X/Y精子分离精液用于冷冻、体外受精、人工受精和胞质内精子注射。
本发明的优点和有益效果是：
1、应用小鼠X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制精液，以体外受精方式根据实际需要来控制小鼠产子的性别。
2、本发明的方法通过添加上机分离液来保护小鼠的鲜精，有效的保护了小鼠精子的活力，X或Y精子分离纯度达到80～88％，提高分离效率。
3、使用本发明的产品和方法能够适用于小鼠的生产和繁殖，为小鼠模型群体的重建、小鼠育种和小鼠模型的生物净化等研究提供有力保障。
具体实施方式
下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明的一种具体限制。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
一、配制X/Y精子上机分离液，pH值7.0-7.4，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷 270～320mM
柠檬酸 70～90mM
果糖 60～80mM；
Hochest 33342，产地：美国，商标：Sigma，货号：B-2261；
KSOM-AA，产地：美国，商标：Millipore，货号：MR-106-D；
Tris三羟甲基氨基甲烷，产地：美国，商标：ANGUS，货号：D609FA6031；
柠檬酸，产地：美国，商标：Sigma，货号：V900129；
果糖，产地：美国，商标：VWR，货号：1087C100；
BSA，产地：美国，商标：Gibco，货号：15260-037；
M2，产地：美国，商标：Sigma，货号：M7167；
35mm培养皿，产地：美国，商标：Corning，货号：430165；
60mm培养皿，产地：美国，商标：Corning，货号：430196；
60mm套皿，产地：美国，商标：FALCON，货号：353037。
实施例1：
小鼠X精子分离精液的制作和体外受精：
1、小鼠X精子分离精液的制作：
(1)、无菌取出12周龄ICR雄鼠的输精管和附睾，用棉纸除去脂肪和血液，放在显微镜下观察，将输精管和附睾放入预热的1ml上机分离液中，用30号针头的尖在附睾上划3～5次，并向下划开输精管，用镊子轻轻将精子挤出来，在37℃的培养箱中将精子及输精管和附睾组织共培养10～15min；
(2)、用针从培养皿中将输精管和附睾组织挑出，使精子与上机分离液混匀，用移液枪把混合液转移到5ml离心管中；
(3)、使用精子密度仪-活力仪检测新鲜精液的浓度1亿/ml和活力65％；
(4)、用10ug/ml Hochest 33342在37℃温水浴中染色45min；
(5)、小鼠X/Y精子分离的DNA差异设定为3.2％，根据小鼠X/Y精子DNA含量差异设定流式细胞分离机参数：第一相区初取精子喷流总数的40％，第二相区X/Y单性精子分离取率30％；通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离数度控制在100～300个/秒；根据分离精子累计显示，取分离的X精子40～50万，用小鼠体外受精液KSOM-AA(MilliporeMR-106-D)回收分离好的精子；
(6)、使用精子密度仪-活力仪检测分离后小鼠精液的浓度40-50万/ml和活力45％；
(7)、使用精子纯度仪检测分离后小鼠精液的纯度87％；
2、体外受精：
(1)、将回收到的分离好的精液放入60mm中间带孔培养皿(Falcon 353037)内，移入37℃,5％CO2培养箱中,培养20min，准备用于卵子采集的培养皿，60mm培养皿(Corning430165)用KSOM-AA+0.04％BSA(Gibco 15260-037)在每个培养皿里做2个90ul的大滴，6-7个30ul小滴；
(2)、20min后取出精子培养皿，各取10ul加到卵子采集的培养皿中90ul受精滴中，再放到37℃，5％CO2培养箱培养40min，受精时小鼠X或Y精子的终浓度为1～2.5×106个/ml；
(3)、在hCG注射13h后脊椎脱臼处死雌鼠，迅速剥离出输卵管并放入M2培养液(Sigma M7167)中，将壶腹部撕破使卵丘团流出，取2个卵丘团放入90ul受精滴中，将受精培养皿放入37％，5％CO2培养箱中静置4h；
(4)、将受精培养皿从培养箱中取出，在上述步骤(1)的KSOM-AA-0.04％BSA 30ul小滴中连续洗6-7次，去除多余的精子和碎片，与此同时，观察受精的卵子中两个原核存在与否，第二极体是否排出；
(5)、将洗好的受精卵移到20ul KSOM-AA-0.04％BSA培养滴中，10个卵/滴，将培养皿移入37％，5％CO2培养箱中过夜培养；
(6)、早晨检查2-细胞胚胎数量；
(7)、将2-细胞胚胎移入假孕0.5d的小鼠输卵管内，每侧移植10个2-细胞胚胎；
(8)、统计新生小鼠数量，获得7只小鼠，6只雌的，1只雄的，性别控制准确率85.71％。
实施例2
小鼠Y精子分离精液的制作和体外受精：
1、小鼠X性控精液的制作：
(1)、无菌取出12周龄ICR雄鼠的输精管和附睾，用棉纸除去脂肪和血液，放在显微镜下观察，将输精管和附睾放入预热的1ml上机分离液中，用30号针头的尖在附睾上划3～5次，并向下划开输精管，用镊子轻轻将精子挤出来，在37℃的培养箱中将精子及输精管和附睾组织共培养10～15min；
(2)、用针从培养皿中将输精管和附睾组织挑出，使精子与上机分离液混匀，用移液枪把混合液转移到5ml离心管中；
(3)、使用精子密度仪-活力仪检测新鲜精液的浓度1亿/ml和活力65％；
(4)、用10ug/ml Hochest 33342在37℃温水浴中染色45min；
(5)、小鼠X/Y精子分离的DNA差异设定为3.2％，根据小鼠XY精子DNA含量差异设定流式细胞分离机参数：第一相区初取精子喷流总数的40％，第二相区X/Y单性精子分离取率30％；通过流式细胞分离机分离X和Y精子，使X/Y精子分离数度控制在100～300个/秒，X或Y精子分离纯度达到80～88％，根据分离精子累计显示，取分离的Y精子40～50万，用小鼠体外受精液KSOM-AA(Millipore MR-106-D)回收分离好的精子；
(6)、使用精子密度仪-活力仪检测分离后小鼠精液的浓度40-50万/ml和活力45％；
(7)、使用精子纯度仪检测分离后小鼠精液的纯度85％；
2、体外受精：
(1)、将回收到的分离好的精液放入60mm中间带孔培养皿(Falcon 353037)内，移入37℃,5％CO2培养箱中,培养20min，准备用于卵子采集的培养皿，60mm培养皿(Corning430166)用KSOM-AA+0.04％BSA(Gibco 15260-037)在每个培养皿里做2个90ul的大滴，6-7个30ul小滴；
(2)、20min后取出精子培养皿，各取10ul加到卵子采集的培养皿中90ul受精滴中，再放到37℃，5％CO2培养箱培养40min，受精时小鼠X或Y精子的终浓度为1～2.5×106个/ml；
(3)、在hCG注射13h后脊椎脱臼处死雌鼠，迅速剥离出输卵管并放入M2培养液(Sigma M7167)中，将壶腹部撕破使卵丘团流出，取2个卵丘团放入90ul受精滴中，将受精培养皿放入37％，5％CO2培养箱中静置4h；
(4)、将受精培养皿从培养箱中取出，在KSOM-AA-0.04％BSA中连续洗6-7次，去除多余的精子和碎片，与此同时，观察受精的卵子中两个原核存在与否，第二极体是否排出；
(5)、将洗好的受精卵移到20ul KSOM-AA-0.04％BSA培养滴中，10个卵/滴，将培养皿移入37％，5％CO2培养箱中过夜培养；
(6)、早晨检查2-细胞胚胎数量；
(7)、将2-细胞胚胎移入假孕0.5d的小鼠输卵管内，每侧移植10个2-细胞胚胎；
(8)、统计新生小鼠数量，获得6只小鼠，1只雌的，5只雄的，性别控制准确率为83.33％。
本发明应用小鼠X、Y精子DNA含量的差异，通过流式细胞方式分离X和Y精子，然后制成性别控制精液，用于小鼠的体外受精、人工受精和胞质内精子注射，按照需要定向繁育雄鼠或雌鼠，或者通过小鼠X/Y精子分离精液生产性控胚胎，再进行胚胎移植，加快特殊品系小鼠的繁育速度。

Claims (3)

1.一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)、配制X/Y精子上机分离液，pH值7 .0-7 .4，由以下组分组成：
Tris三羟甲基氨基甲烷 270～320mM
柠檬酸 70～90mM
果糖 60～80mM；
(2)、小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，包括以下步骤：
(a)、将输精管和附睾放入预热的1mL 上机分离液中，用镊子轻轻将精子挤出来；在37℃的培养箱中将精子及输精管和附睾组织共培养10～15min；
(b)、用针从培养皿中将输精管和附睾组织挑出，使精子与上机分离液混匀，用移液枪把混合液转移到5ml离心管中；
(c)、检测新鲜精液的浓度和活力；
(d)、用10 μ g /mL Hochest 33342在37℃温水浴中染色45min；
(e)、根据小鼠X/Y精子分离的DNA含量差异设定流式细胞分离机参数，通过流式细胞分离机分离X和Y精子；
(f)、根据分离精子累计显示，取分离的X精子和Y精子各40～50万，用小鼠体外受精液回收分离好的精子；
(g)、检测分离后小鼠精液的浓度和活力；
(h)、检测分离后小鼠精液的纯度。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，其特征在于：所述小鼠X/Y精子分离的DNA含量差异设定为3 .2％，流式细胞分离机参数为：第一相区初取精子喷流总数的40％，第二相区X/Y单性精子分离取率30％。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠X/Y精子分离精液的生产方法，其特征在于：所述流式细胞分离机分离X和Y精子，X和Y精子分离数度控制在100～300个/秒。
CN201711338448.4A 2017-12-14 2017-12-14 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用 Active CN108103012B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711338448.4A CN108103012B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711338448.4A CN108103012B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108103012A CN108103012A (zh) 2018-06-01
CN108103012B true CN108103012B (zh) 2021-04-02

Family

ID=62216837

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711338448.4A Active CN108103012B (zh) 2017-12-14 2017-12-14 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108103012B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015705A (zh) * 2021-11-28 2022-02-08 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种小鼠体外受精繁育性别选择方法
CN118165920B (zh) * 2024-05-14 2024-08-06 内蒙古大学 一种Tlr7&8双激动剂小鼠性控分选液和使用方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101322489A (zh) * 2008-08-01 2008-12-17 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种鹿x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
CN101347458A (zh) * 2008-08-01 2009-01-21 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种羊x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
CN101411722A (zh) * 2008-10-22 2009-04-22 李喜和 奶牛x/y性别控制冷冻混合精液及其制备方法
CN105638643A (zh) * 2016-02-16 2016-06-08 云南省畜牧兽医科学院 一种家畜精液冷冻稀释液
CN106135196A (zh) * 2016-06-29 2016-11-23 许红喜 动物精子稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101322489A (zh) * 2008-08-01 2008-12-17 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种鹿x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
CN101347458A (zh) * 2008-08-01 2009-01-21 内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司 一种羊x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
CN101411722A (zh) * 2008-10-22 2009-04-22 李喜和 奶牛x/y性别控制冷冻混合精液及其制备方法
CN105638643A (zh) * 2016-02-16 2016-06-08 云南省畜牧兽医科学院 一种家畜精液冷冻稀释液
CN106135196A (zh) * 2016-06-29 2016-11-23 许红喜 动物精子稀释液及其配制方法和利用该稀释液冷冻、冷藏保存精子的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"藏獒细管冷冻精液生产技术规程";青海省质量技术监督局;《青海省地方标准DB63/T 1435-2015》;20151221;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108103012A (zh) 2018-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104130973B (zh) 用于绵羊卵母细胞体外成熟的方法及预处理液和试剂盒
CN100334205C (zh) 一种生产水牛可控性别体外胚胎的方法
CN106520838A (zh) 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法
CN108103012B (zh) 小鼠x/y精子分离精液的生产方法及应用
Saha et al. Effect of fresh and frozen semen on in vitro fertilization and subsequent development of goat embryos.
CN110628709A (zh) 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量的培养液及培养方法
CN108707578B (zh) 一种猪单胚胎体外培养方法
US4987080A (en) Method for in vitro maturation of oocytes
CN100523174C (zh) 来自猿猴的胚胎干细胞的生产方法
CN101182489B (zh) 一种动物体细胞克隆方法
CN101886059A (zh) 用于胚胎体外生产的培养液以及牛胚胎体外生产的方法
CN1226378A (zh) 羊“试管内”杂交育种技术
CN110684720B (zh) 一种以异种动物间的卵母细胞为介质获得雄原核的方法
KR101032335B1 (ko) 포유동물 정소로부터 생식선 줄기세포를 수득하는 방법
KR20080077738A (ko) 돼지 미성숙란의 체외배양 방법
CN100526456C (zh) 一种同体细胞核移植方法
KR101107329B1 (ko) 타우로우루소데옥시콜산을 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 포유동물 수정란 대량 생산 방법
Hua et al. A new tool for in vitro culture of porcine eggs
Barkova et al. Features of the preparation of biological material for genome editing in cattle
CN113801840A (zh) 一种提高小鼠体外受精效率的操作液及其使用方法
Khattab et al. In Vivo and In Vitro Dromedary Camel Embryos’ Production under Egyptian Conditions
CN102533856A (zh) 一种受精卵胞质内注射dna生产转基因水牛的方法
Bekseitov et al. Quality of biological material in embryo transplantation
Mukherjee In vitro embryogenesis: an experimental model for the understanding of reproductive physiology and development in mammals
KR20110039689A (ko) 수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180712

Address after: 011517 Sheng Le economic Park, Helingeer, Hohhot, the Inner Mongolia Autonomous Region, Sheng Le modern service industry gathering area Jinsheng road and Yun Valley Road intersection.

Applicant after: INNER MONGOLIA SAIKEXING LIVESTOCK BREEDING AND SEED INDUSTRY BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE CO., LTD.

Applicant after: Inner Mongolia saikexing reproductive biotechnology (Group) Limited by Share Ltd

Address before: 011517 Sheng Le economic Park, Helingeer, Hohhot, the Inner Mongolia Autonomous Region, Sheng Le modern service industry gathering area Jinsheng road and Yun Valley Road intersection.

Applicant before: INNER MONGOLIA SAIKEXING LIVESTOCK BREEDING AND SEED INDUSTRY BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE CO., LTD.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant