KR20110039689A - 수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법 - Google Patents

수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무혈청 한정배지(serum free chemically defined medium)에서의 수정란 배 발달율 향상을 위한 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 체외수정 유래 수정란의 체외배양시, 무혈청 한정 배지에서의 수정란의 체외 발육 효율을 증가시키기 위해, 락트산, 피루브산, 시트르산 및 글루코스를 상기 무혈청 한정 배지에 첨가하고, 발육 단계에 따른 적정 2단계 배양 방법(two step-culture)을 적용함으로써 체외배양 효율을 개선시키는 방법 및 이 방법에 사용되는 배지 조성물에 관한 것이다.
무혈청 한정 배지, 락트산, 피루브산, 시트르산, 글루코스, 수정란 체외배양

Description

수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법{Medium composition for in vitro culture of embryo and culture method using the same medium}
본 발명은 무혈청 한정 배지에 특정 화합물을 첨가한 수정란 배 발달율 향상을 위한 체외배양용 배지 조성물 및 이 배지 조성물을 사용한 수정란 체외배양 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 체외 배양된 수정란의 체외배양시 혈청이나 알부민이 없는 무혈청 한정 배지에 락트산, 피루브산, 시트르산 및 글루코스를 첨가하여 제조한 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법에 관한 것이다.
소 수정란의 체외배양 효율을 향상시키기 위해 체외배양배지에 항산화제, 성장촉진인자, 거대분자물질 등을 첨가하는 체외배양 실험이 전세계에서 행해지고 있다. 특히, 소 혈청(bovine serum)이나 소 혈청 유래 알부민(bovine serum albumin)을 주요 구성물질로 사용하였는데, 소 혈청은 매우 다양한 성분이 포함된 것으로, 성장촉진인자, 펩타이드, 에너지 기질 등이 섞여 있으므로 수정란 발육을 촉진시키고 수정란 독성물질을 무력화시키는 것으로 알려져 있다. 알부민 역시 혈청의 주요 구성물질로서 암컷 생식기도내에서 정상적으로 확인되는 세포외단백질이며, 알부민 제조시 혼입되는 시트르산에 의하여 호기적 에너지 생산에 의한 고에너지 생성이 가능하므로 수정란 발육을 촉진시키는 물질로 보고되었다.
그러나, 이들 혈청 유래 물질들은 그 구성성분을 정확하게 파악할 수 없는 복합 물질이므로 수정란 성장 촉진인자에 대한 규명이 어렵고 생산된 롯트번호에 따라서도 수정란 생산율의 변화가 매우 심하게 되고 있다. 그러므로 이들 혈청이나 알부민이 없는 화학적 한정배지(chemically defined medium)에서 수정란을 생산하고자 시도 되었으며, 구성성분을 정확하게 파악할 수 있는 특정물질(비타민, 성장촉진인자, 에너지 기질 등)을 첨가함으로써 체외배양의 진행실험 및 그 결과를 보다 정확하게 분석할 수 있다.
체외배양체계에서 생산된 수정란의 이식 후 결과는 연구자에 따라 12-50%까지 다양하다. 수태율을 결정하는 요소에는 수정란 판별, 이식 수정란 수, 수란우와의 동기화 여부, 발정으로부터 이식일자, 이식자의 기술, 수정란 동결여부 등으로 다양하지만 체외생산체계에 따른 생산된 수정란의 질(quality)이 무엇보다도 중요하다.
한편, 본 발명자는 체외수정 유래 소 수정란의 체외배양시, 무혈청 한정 배지에서의 수정란의 체외 발육 효율을 증가시키기 위해, 마이오이노시톨(myoinositol)과 상피성장인자(epidermal growth factor)를 상기 무혈청 한정 배지에 첨가하고, 발육 단계에 따른 적정 2단계 배양 방법을 적용함으로써 체외배양 효율을 개선시키는 기술을 개시한 바 있다(대한민국등록특허 10-0715188).
그러나 상기의 방법으로는 보다 적극적으로 에너지대사 과정을 수정란 발육단계에 맞추어서 조절하기는 부족한 면이 있었다.
이에, 본 발명자는 수정란의 체외 발육 효율을 더욱 개선시킬 수 있는 체외배양용 배지를 개발하고자 예의 노력하던 결과, 포유동물 수정란의 발육을 보다 세밀하게 조절하여서 발육초기단계에서는 TCA(tricarboxylic acid cycle) 과정에 의한 고에너지 생산을 유도하고 발육후기단계에서는 해당과정(glycolysis)에 의한 치밀화(compaction) 및 포배형성(blastulation) 과정을 주요 에너지 대사과정으로 조절하는 것이 생존성 높은 수정란을 생산할 수 있을 것이라는 기술적 사상을 도출하게 되었다.
이를 위해, 상기 무혈청 한정배지에 락트산, 피루브산, 시트르산 및 글루코스를 첨가한 배지에서 수정란을 배양초기와 배양후기로 나누어서 배양할 경우 배반포 생산율, 수정란의 생존율 및 수태율이 더욱 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 수정란을 체외배양으로 배양할 때, 무혈청 배지에 락트산, 피루브산, 시트르산 및 글루코스를 포함시킨 체외 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외 배양 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 무혈청 배지에 락트산, 피루브산, 시트르산 및 글루코스가 첨가된 것을 특징으로 하는 수정란의 체외배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 수정란의 체외배양용 배지 조성물은 수정란의 배양 단계에 따라 상기 배지 조성물에 포함되는 구성성분의 농도를 달리하는 것이 바람직하다.
배양(또는 발육) 초기 단계인, 체외수정 이후부터 체외수정 후 3내지 6일까지의 수정란의 체외배양용 배지 조성물은, 무혈청 배지에 락트산(lactate)은 6 내지 12 mM로, 피루브산(pyruvate)은 0.3 내지 1.0 mM로, 시트르산(citrate)은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스(glucose)는 0.1 내지 1.0 mM로 포함되는 것이 바람직하다.
배양(또는 발육) 후기 단계인, 상기 배양 초기 단계 이후부터 확장 배반포 단계까지의 수정란의 체외 배양용 배지 조성물은, 무혈청 배지에 락트산은 2 내지 6 mM로, 피루브산은 0.1 내지 0.3 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 1.0 내지 7.0 mM로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 무혈청 배지로는 변경합성난관액(mSOF, modified synthetic oviduct fluid)이 특히 바람직하다.
본 발명은, 수정란을 상술된 수정란의 체외배양용 배지 조성물에서 배양하는 것을 특징으로 하는 수정란의 체외배양 방법에 관한 것이다. 체외배양용 배지 조성물과 마찬가지로, 수정란의 배양 단계에 따라 상기 배지 조성물에 포함되는 구성성분의 농도를 달리하는 것이 바람직하다.
수정란이 배양(또는 발육) 초기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산(lactate)은 6 내지 12 mM로, 피루브산(pyruvate)은 0.3 내지 1.0 mM로, 시트르산(citrate)은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스(glucose)는 0.1 내지 1.0 mM로 포함된 배지 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
수정란이 배양(또는 발육) 후기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산은 2 내지 6 mM로, 피루브산은 0.1 내지 0.3 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 1.0 내지 7.0 mM로 포함된 배지 조성물을 이용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "수정란"은 돼지, 소 및 말로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수정란을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "소의 체외수정란"은 도축장에서 채취한 난소에서 미성숙 난자를 회수한 후, 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 체외성숙을 유도하고 성숙이 완료된 난자를 동결-융해한 정액으로 체외수정을 실시하여 얻어진 수정란을 말한다. 또한, 수정이 이루어진 접합자(zygote)는 인큐베이터에서 추가로 7 내지 10일간 체외배양을 하여 이식이 가능한 상태의 배반포(blastocyst) 단계인 이식가능 수정란으로 만든다. 이러한 체외성숙, 수정 및 배양의 연속된 과정을 모두 체외수정란 생산 방법으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 용어 "배반포"는 수정란이 난할을 거듭하여 자라는 과정에서 치밀화된 상실배 이후에 배반포강을 형성하여 태아로 분화할 내세포괴(inner cell mass)와 태반으로 분화할 영양막세포(trophectoderm)로 구분이 될 정도로 발육된 상태의 수정란을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "체외배양"이란 수정란이 체내에서 자라는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터에 온도 38-39℃, 5% CO2, 5-10% O2 상태로 체내 자궁의 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "무혈청 한정 배지는"혈청이나 알부민이 첨가되지 않은 배지로서, 배지에 첨가되는 구성성분의 조성 및 함유량이 명확히 밝혀져 있는 배지를 의미한다.
본 발명에 따른 체외 수정란 배양용 배지 및 이를 이용한 배양 방법은 수정란의 배반포 생산율, 생존율 및 수태율을 모두 개선할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것 이다.
1. 소 난자의 체외성숙
도축장에서 소의 난소를 회수하여 25℃ 생리 식염수에 넣고 4시간 이내에 실험실로 운반하여 직경이 2-8mm인 난포로부터 19게이지 주사침이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여, 난자를 포함한 난포액을 플라스틱 배양접시(petridish)에 5분간 정치시킨 후 상층액을 제거하였다. 사용될 미성숙난자는 난구세포가 치밀하며 2층 이상 부착되어 있고 세포질이 균일한 난자를 선별하였다. 미성숙난자의 채취 및 세정은 1 ㎎/㎖의 BSA, 5 mM의 소디움 바이카르보네이트 및 10 mM의 N-[2-하이드록시페라진-N'-[2-에탄술폰산](이하 HEPES)를 첨가한 세척용 Tissue Culture Medium 199(이하 W-TCM199로 명명함)를, 체외성숙배양에는 1 ㎎/㎖의 BSA, 25 mM의 소디움 바이카르보네이트, 2.5 ㎍/㎖ FSH(Antrin, Denka Pharm., 일본국)를 첨가한 TCM199를 이용하였다. 성숙배양에는 60 mm 접시(dish)(Nunclon, Roskide, 덴마크)를 사용하였으며 배양 전 각 50 ㎕ drop에 성숙배양용 TCM199를 넣어 2시간 이상 배양기내에 정치시켰다. 선발한 미성숙난자는 W-TCM199로 3회, 성숙배양용 TCM199로 1회 세정하여 각 drop 당 6-10개를 넣어 39℃, 5% CO2, 95% 공기 및 포화습도 상태의 배양기(이하, 5% CO2 배양기)내에서 23시간 성숙 배양하였다.
2. 소 난자의 체외수정
동결 정액을 37℃의 온수에 30초간 융해한 후 15㎖ 원심분리용 튜브에 퍼콜(percoll) 90%와 45% 각 2㎖씩 분주한 상층에 첨가하여 1,800rpm에서 15분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고 TALP 정자처리용 액을 첨가하여 1,500rpm에서 5분간 2회 세정한 후 혈구계(血球計, hemocytometer)를 사용하여 50 x 106개/㎖의 농도로 희석하고 동량의 200 ㎍/㎖ 헤파린 용액(Sigma 사, 미국)을 첨가하였다. 정자와 헤파린을 혼합한 후 5% CO2 배양기내에 10분간 정치함으로써 수정능 획득을 유도하였다. 정자 희석액은 헤파린 처리를 완료한 후 2.0 x 106개/㎖가 되도록 수정배양액에 첨가하였으며, 5%의 CO2 배양기 내에서 18시간 체외수정하였다.
3. 소 수정란의 체외배양
소 수정란의 체외배양은 실험설계에 따라 변경합성난관액(mSOF, modified synthetic oviduct fluid)의 미소적내에서 배양을 실시하였다. 배양액은 플라스틱 배양접시에 25㎕의 미소적을 작성하고 광유(mineral oil)를 도포하여 4시간 이상, 39℃, 5% CO2, 7% O2 및 88% N2의 가스조건과 포화습도 상태의 배양기내에서 가스 평형한 후 실험에 사용하였다. 체외수정 후 4일 동안은 수정란 초기 배양액에서 배양을 실시하였으며, 그 이후에는 후기 배양액으로 교환하여 수정 후 9일째까지 배양을 하고 생산된 배반포 및 탈출배반포의 성적을 기록하였다.
다음의 표 1에 소 수정란 2단계 체외배양용 변경합성난관액(mSOF) 기본배지의 성분을 나타내었다.
Figure 112009062263080-PAT00001
다음의 표 2에 돼지 및 말 수정란 2단계 체외배양용 변경합성난관액(mSOF) 기본배지의 성분을 나타내었다.
Figure 112009062263080-PAT00002
돼지의 경우 체외성숙 과정에서 배양시간이 48시간으로 변경되는 것과 체외수정이후 모든 과정을 표 2의 배양액으로 이식가능 수정란을 만드는 것 이외에는 소에서의 체외성숙, 체외수정 및 체외배양의 경우와 동일하다.
다음의 표 3에 사람 수정란 2단계 체외배양용 변경합성난관액(mSOF) 기본배지의 성분을 나타내었다.
Figure 112009062263080-PAT00003
사람의 경우 체외수정이후 모든 과정을 표 3의 배양액으로 이식가능 수정란을 만드는 것 이외에는 소에서의 체외성숙, 체외수정 및 체외배양의 경우와 동일하다.
4. 수정란 이식
수정란은 체외수정후 7-8일째 배양액에서 회수하여 준비된 수란우에 황체가 존재하는 측 자궁각으로 비외과적 방법으로 이식을 하였다. 임신의 확인을 위하여는 발정으로부터 60일에 직장검사를 통하여 임신여부를 확인하였다.
5. 통계적 분석
각각의 실험데이터에 대한 통계학적 검증을 위하여, SAS 6.12 프로그램에 포함되어 있는 일반 선형 모형(general linear model)으로 각 처리의 모델 효과를 검증하였다. 모델효과가 통계적 유의차를 나타낼 경우 각 처리군은 LSD로 유의적 차이를 검정하였으며 유의적 수준은 P값으로 0.05 미만으로 하였다. 이하, 본 실시예의 실험 데이터의 통계적 분석은 동일한 방법으로 수행하였다.
다음의 표 4에 배양체계에 따른 수정란의 배양효과를 나타내었다.
배지 수정란의 개수 배반포의 개수(%)
SOF-BSA 351 113(32.2)a
mSOF-PVA(myo+EGF)* 368 173(47.0)b
mSOF-citrate(표1방법) 360 185(51.4)b
a,b와 같이 각기 다른 위첨자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 표시한다 (P<0.05).
*대한민국등록특허 제10-0715188호의 배양체계
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 일반적인 SOF-BSA 군에 비해서는 한정배지 PVA-myo+EGF에서 47.0%와 mSOF-citrate(표 1 배지)에서 51.4%로 유의적으로 높은 배반포 생산률을 나타내었다.
다음의 표 5에 배양체계에 따른 수정란 동결-융해 후 생존율을 나타내었다.
배지 해동된 수정란의 개수 48시간째에 생존한 수정란의 개수(%)
SOF-BSA 242 141(58.3)c
mSOF-PVA(myo+EGF)* 260 157(60.4)c
mSOF-citrate(표1방법) 255 216(84.7)d
c,d와 같이 각기 다른 위첨자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 표시한다 (P<0.05).
*대한민국등록특허 제10-0715188호의 배양체계
상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 일반적인 SOF-BSA 군과 한정배지 PVA-myo+EGF 군이 각각 58.3%와 60.4% 생존율을 나타낸 것에 비해서 mSOF-citrate(표 1 배지)에서 84.7%로 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다.
다음의 표 6에서 배양체계에 따라 생산된 수정란의 이식 후 수태율을 비교하였다.
배지 이식된 배아의 개수 60일째 수태율(%)
SOF-BSA 211 73(34.6)e
mSOF-PVA(myo+EGF)* 208 78(37.5)e
mSOF-citrate(표1방법) 289 155(53.6)f
e, f와 같이 각기 다른 위첨자는 통계적으로 유의적인 차이가 있음을 표시한다 (P<0.05).
*대한민국등록특허 제10-0715188호의 배양체계
상기 표 6에서는 일반적인 SOF-BSA 군이 34.6%, 한정배지 PVA-myo+EGF 군이 37.5% 수태율을 나타낸 것에 비하여 mSOF-citrate (표 1방법)에서 53.6%로 유의적으로 높은 수정란이식 수태율을 나타내었다.
도 1은 소 수정란을 혈청 및 알부민이 없는 한정 기본 배양배지에 락트산, 피루부산, 시트르산, 글루코스 농도를 초기 발육단계와 후기 치밀화 및 배반포 형성단계에 맞도록 조정하여서 제조한 배지에서 체외수정 후 7.5일간 배양하여 배반포기로 발달한 상태를 실체 현미경으로 관찰한 상태의 촬영사진. 구획이 명확하고 치밀한 내세포괴(ICM : inner cell mass)와 세포수가 많고 투명한 영양막세포(TE : trophectoderm)를 특징으로 하는 중기, 후기 배반포의 사진.

Claims (10)

  1. 무혈청 배지에 락트산(lactate), 피루브산(pyruvate), 시트르산(citrate) 및 글루코스(glucose)가 첨가된 것을 특징으로 하는 수정란의 체외 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    수정란이 배양 초기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산은 6 내지 12 mM로, 피루브산은 0.3 내지 1.0 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 0.1 내지 1.0 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    수정란이 배양 후기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산은 2 내지 6 mM로, 피루브산은 0.1 내지 0.3 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 1.0 내지 7.0 mM로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 무혈청 한정 배지는 변경합성난관액(mSOF, modified synthetic oviduct fluid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 수정란은 돼지, 소, 말 및 사람으로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수정란인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 수정란을 제 1항에 따른 수정란의 체외 배양용 배지 조성물에서 배양하는 것을 특징으로 하는 수정란의 체외 배양 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    수정란이 배양 초기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산은 6 내지 12 mM로, 피루브산은 0.3 내지 1.0 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 0.1 내지 1.0 mM로 포함된 배지 조성물에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    수정란이 배양 후기 단계인 경우, 무혈청 배지에 락트산은 2 내지 6 mM로, 피루브산은 0.1 내지 0.3 mM로, 시트르산은 0.2 내지 1.0 mM로, 글루코스는 1.0 내지 7.0 mM로 포함된 배지 조성물에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 무혈청 한정 배지는 변경합성난관액(mSOF, modified synthetic oviduct fluid)인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 수정란은 돼지, 소, 말 및 사람으로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 수정란인 것을 특징으로 하는 조성물.
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KR1020090096644A KR20110039689A (ko) 2009-10-12 2009-10-12 수정란의 체외배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 체외배양 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019093619A1 (ko) * 2017-11-08 2019-05-16 제주대학교 산학협력단 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법

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WO2019093619A1 (ko) * 2017-11-08 2019-05-16 제주대학교 산학협력단 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법

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