WO2019093619A1 - 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법 - Google Patents

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WO2019093619A1
WO2019093619A1 PCT/KR2018/007998 KR2018007998W WO2019093619A1 WO 2019093619 A1 WO2019093619 A1 WO 2019093619A1 KR 2018007998 W KR2018007998 W KR 2018007998W WO 2019093619 A1 WO2019093619 A1 WO 2019093619A1
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oocyte
vitro
oocytes
maturation
culture medium
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PCT/KR2018/007998
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박세필
이승은
김원재
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제주대학교 산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a culture medium for in vitro maturation of oocytes containing hessperin, and a method for producing an in vitro embryo using the same.
  • In vitro production of embryos is a technique to secure embryos that have undergone a certain level of development by carrying out a series of processes of maturation, fertilization and embryo development in the body in vitro. Since in vitro culture is much less efficient than in vivo culture, studies are under way to improve in vitro maturation conditions. Since the production efficiency of eggs and embryo is similar to that of the environment, it is preferable to apply them in an environment similar to the body environment when applying in vitro production technology.
  • the maturation process of the oocyte is a process in which the oocyte is in a condition suitable for fertilization with the sperm.
  • meiosis progresses to the middle stage of the second meiosis, indicating 2n nucleus.
  • the in vitro maturation (IVM) system is a fundamental and critical step for the next step of the experiment, as the maturation of the oocyte will not adversely affect subsequent embryo development.
  • the object of the present invention is to solve the problems of the prior art described above and to provide a method of reducing the production of active oxygen species during in vitro culture to improve the development rate of oocytes,
  • the present invention also provides a method for producing an in vitro embryo using the same.
  • an oocyte culture medium for in vitro maturation comprising hesperetin as an active ingredient.
  • the concentration of the hesperetin may be from 95 [mu] M to 110 [mu] M.
  • an oocyte cultured in the oocyte culture medium for in vitro maturation there is provided an oocyte cultured in the oocyte culture medium for in vitro maturation.
  • the egg may be an egg of a mammal.
  • the mammal may be a pig.
  • the concentration of the hesperetin may be from 95 ⁇ M to 110 ⁇ M.
  • the in vitro maturation of step 2) above can be performed by culturing the oocyte in normal medium for 44 hours.
  • the aging in step 3) may be performed by culturing the oocytes matured in step 2) in a culture medium for in vitro maturation containing hessperin as an active ingredient for 24 hours.
  • the egg may be an egg of a mammal.
  • the mammal may be a pig.
  • the culture medium for in vitro maturation of oocytes containing the hesspelletin of the present invention and the method of producing the in vitro embryo using the same can reduce the active oxygen species of the oocyte to increase the embryo production rate of the unit cell after the maturation of the oocyte, To improve the efficiency of culture.
  • FIG. 1 is a graph comparing photographs and generation of reactive oxygen species occurrence in the cytoplasm of oocytes in the control group, the aging group, and the hessperin treatment group.
  • Figure 2 is a graph comparing antioxidant gene expression levels in the control, aging, and hesperetin treated groups.
  • Hesperetin is a kind of natural flavonoid compound that is widely found in citrus fruit trees. It protects cells from chemicals and toxins that damage tissues through various oxidants such as hydrogen peroxide and oxidative stress or other mechanisms. And neutralizing many reactive oxygen species.
  • unit generation cell refers to an oocyte that has been independently activated without supplying sperm through drug treatment, unlike a normal modification in which a sperm-driven foreign gene is introduced and activated.
  • activation means a change in the oocyte that occurs after stimulation by normal oocyte and sperm fertilization.
  • Oxidative reactive species refers to oxygen that is more active, unstable, and has higher energy than general oxygen.
  • active oxygen species include superoxide (O 2- ), hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), hydroxy radical, peroxy radical, and the like.
  • Active oxygen species have free radicals and become unstable and have strong activity. When they are overproduced, they cause oxidative stress to the cells and they are called harmful oxygen.
  • polar release refers to a phenomenon in which uneven division occurs from the oocyte in the middle of the second meiotic division of the oocyte cell cycle, and can be used as an index of the degree of maturation of the oocyte.
  • an oocyte culture medium for in vitro maturation comprising hessperin as an active ingredient.
  • the concentration of hesperetin is 90 ⁇ M to 120 ⁇ M, more preferably 95 ⁇ M to 110 ⁇ M, and more preferably about 100 ⁇ M, based on the total culture.
  • concentration of hesperetin was about 100 ⁇ M based on the total culture, it was found that the most effective oocyte maturation and embryo development rate was increased as compared with the case of adding different concentrations (see Table 1).
  • FIG. 1 shows the effect of the hESP on the development of reactive oxygen species in the cytoplasm of the oocyte when the in vitro maturation culture medium is treated with hessperin.
  • the results shown in FIG. 1 indicate that the treatment with 100 ⁇ M of hesperetin (c) in the aging process for 24 hours can effectively inhibit the generation of reactive oxygen species compared with the untreated aging group (b) .
  • FIG. 2 is a graph comparing antioxidant gene expression levels according to the presence or absence of hesperetin contained in the culture medium for in vitro maturation of oocytes. 2
  • the expression of the SOD1 gene was increased by about 56% and the expression of the Prdx5 gene was increased by about 49% compared with the aging group in the hesperetin-treated group. Therefore, in the aging process of 24 hours, The expression of antioxidant genes was much higher in the case of treatment with tin than in the case of no treatment.
  • the in vitro maturation of the step 2) may be to culture the oocyte for 44 hours, and the aging of the step 3) may be such that the oocyte matured in the step 2) is cultured for 24 hours in an in vitro maturation culture medium containing hessperin as an active ingredient . ≪ / RTI >
  • the concentration of hESPERIN in the culture medium for in vitro maturation used in the aging of step 3) is 90 [mu] M to 120 [mu] M, more preferably 95 [mu] M to 110 [mu] M, and more preferably about 100 [
  • concentration of hesperetin is about 100 [mu] M based on the total culture, it is possible to increase the rate of oocyte maturation and embryo development most effectively compared with the case of adding different concentrations.
  • the oocyte cultured or aged in the culture medium for in vitro maturation of the present invention may be an oocyte of a mammal, more preferably a porcine oocyte.
  • Porcine ovaries were recovered from the slaughterhouse and transferred to saline containing 75 ⁇ g / ml penicillin G and 50 ⁇ g / ml streptomycin, and maintained at a temperature of 32 ⁇ 35 °C.
  • the follicles were inhaled by a 10-ml syringe fitted with an 18-gauge needle from follicles of 2 to 8 mm in diameter, and then classified into cumulus-oocyte complexes (COCs) composed of three or more layers of cumulus cells under a stereomicroscope Respectively.
  • COCs cumulus-oocyte complexes
  • the recovered oocytes were washed three times with Hepes-buffered tissue culture medium 199 (TCM-HEPES) supplemented with 0.1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) cysteine, 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF), 0.5 ⁇ g / ml follicle stimulating hormone (FSH), 0.5 ⁇ g / ml luteinizing hormone (LH) (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplemented with (v / v) porcine follicular fluid. Thereafter, the cells were transferred to a 500 ⁇ in vitro maturation medium covered with mineral oil, and cultured in a 5% CO2 incubator at 38.8 ⁇ for 44 hours to induce in vitro maturation.
  • TCM-HEPES Hepes-buffered tissue culture medium 199
  • BSA bovine serum albumin
  • EGF epidermal growth factor
  • FSH 0.5 ⁇ g / ml folli
  • the oocytes induced in vitro maturation by the method described in Example 1 were cultured for 24 hours in a culture medium in which hesperetin was added at concentrations of 0, 1, 10, 100, and 250 ⁇ ⁇ , respectively.
  • the cells were transferred to a culture medium containing a solution of physiologically active substance derived from mesenchymal stem cells in 10% human fat, and cultured for 2 days and 6 days, respectively, and the blastocyst formation rate and blastocyst formation rate were examined.
  • the mRNA of blastocyst embryos was extracted using a magnetic bead (Dynabeads mRNA Purification Kit; Dynal, Oslo, Norway).
  • 20 ⁇ l lysis / binding buffer 100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% LiDS and 5 mM DTT
  • 20 ⁇ l of oligo (dT) 20 primer - magnetic bead and incubate at 65 ° C for 5 minutes.
  • Hybridized mRNA and oligo (dT) 20 primer-bead are washed twice with Washing buffer A and once with Washing buffer B.
  • mRNA was extracted from beads in 15 ⁇ l DEPC treated tertiary distilled water.
  • cDNA was synthesized using oligo (dT) 20 primer and SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, Grand Island, NY, USA).
  • oligo (dT) 20 primer and SuperScript II reverse transcriptase Invitrogen, Grand Island, NY, USA.
  • SuperScript II reverse transcriptase Invitrogen, Grand Island, NY, USA.
  • a PCR instrument Applied biosystems, Warrington WA1 45R, UK
  • the primers used in the reaction are shown in Table 1 below.
  • the threshold cycle (Ct) value indicates the number of cycles when the sample fluorescence value statistically exceeds the background fluorescence value.
  • SYBR Green PCR Master Mix Applied biosystems, Warrington WA1 45R, UK was used and the PCR conditions were as follows.
  • PCR products are analyzed by melting curve.
  • the melting point of PCR products is sequence-specific and can be distinguished from nonspecific reactions. This is done to determine the crossing point (CP) of each mRNA, and the fluorescence detection point can be specified.
  • the amount of gene expression associated with GAPDH or -Actin Depending on mRNA expression And then analyzed by leveling.
  • the oocyte maturation rate in the control group of Example 1 and the hessperin treatment group and the aging group of Example 2 were observed and the oocytes were activated through unit generation and finally cultured until the blastocyst stage to determine the blastocyst rate and blastocyst reaching rate (See Table 2).
  • the oocyte maturation rate of the control group was measured 44 hours after in vitro maturation and the oocyte maturation rate of the hessperin treatment group and the aging group was measured after 44 hours of in vitro maturation for 24 hours by the first polarity release rate .
  • the maturation rate of oocytes was 47.2% ⁇ 0.6 in control group, 42.5% ⁇ 1.0 in 1 ⁇ M treated group, 43.2% ⁇ 1.1 in 10 ⁇ M treated group, 44.3% ⁇ 1.4 in treated group treated with 100 ⁇ M hesperine, 44.3% ⁇ 1.1 in the ferretin-treated group, and 44.3% ⁇ 2.0 in the aging group, indicating that the oocyte maturation rate of the treated group and the control group was not significantly different (P ⁇ 0.05).
  • the inconvenience rate was 57.4% ⁇ 1.0% in the control group, 54.5% ⁇ 4.7% in the 1 ⁇ M hesperetin treated group, 43.4% ⁇ 1.6% in the 10 ⁇ M hesperetin treated group, 100 ⁇ M hesperetin treated In the aging group, 56.0% ⁇ 3.1%, in the 250 ⁇ M hesperetin treated group, 42.3% ⁇ 3.0%, and in the aging group, 40.7% ⁇ 6.1%, respectively.
  • the developmental rate of blastocysts in the 6th day of in vitro culture was 61.5% ⁇ 3.2% in the control group, 20.7% ⁇ 6.1% in the 1 ⁇ M treated group, 26.9% ⁇ 2.4% in the treated group in 10 ⁇ M,
  • the results were as follows: 46.2% ⁇ 3.1%, 29.3% ⁇ 3.0% in 250 ⁇ M treated group, 31.8% ⁇ 6.1% in aging group, and the development rate in 100 ⁇ M hesperetin group compared to aging group (P ⁇ 0.05). From the above results, it was confirmed that the treatment with hESPERIN at a concentration of 100 ⁇ M was most effective in preventing adverse effects of active oxygen species of the oocyte.
  • the maturation-induced COCs were recovered from the culture medium for in vitro maturation according to Examples 1 and 2 in order to compare the degree of occurrence of reactive oxygen species present in the cytoplasm of oocyte of the control group, the hesperetin treated group and the aging group, Treatment with mg / mL hyaluronidase and gently pipetting to remove cumulus cells. After removal of cumulus cells, the oocytes were washed three times with phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 0.1% (w / v) BSA and transferred to 10 ⁇ M diachlorohydrofluorescein diacetate (DCFDA) solution.
  • PBS phosphate buffered saline
  • DCFDA diachlorohydrofluorescein diacetate
  • the cells were reacted in a 5% CO 2 incubator at 38.8 ° C. for 20 minutes, washed thoroughly in PBS (0.1% B-PBS) containing 0.1% (w / v) BSA for 5 times or more, 71, Japan), and the fluorescence values were then leveled with the fluorescence values of the control group (see Fig. 1).
  • the ratio of the active oxygen species in the aging group was 1.46 ⁇ 0.03 and in the group treated with 100 ⁇ M hessperine was 1.14 ⁇ 0.03. As a result, it was confirmed that when the aging process was performed for 24 hours, 100 ⁇ M hessperine treatment group could effectively inhibit the generation of reactive oxygen species compared to the aging group (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 ).
  • EXPERIMENTAL EXAMPLE 3 Increase in the expression level of other antioxidant genes in the treatment with hesperetin >
  • Example 4 the expression level of antioxidant genes measured by real-time RT-PCR was compared with the expression level of GAPDH as a housekeeping gene. As a result, expression of SOD1 gene was decreased to about 45% in the aging group and about 70% in the hesperetin treated group compared to the control group. Expression of the Prdx5 gene was reduced to about 55% in the aging group and to 82% in the hesperetin treated group as compared with the control group.

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Abstract

본 발명은 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체왜 배아 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액은 난자의 노화에 동반되는 활성산소종을 억제하여 체외 성숙 난자를 질적으로 향상시킬 수 있으며, 결과적으로 체외 배아 생산 효율이 증대된다.

Description

헤스페레틴을 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법
본 발명은 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산방법에 관한 것이다.
생명공학 기술이 발전함에 따라 배아를 이용한 신약 개발 또는 이종장기이식 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 연구들에는 공통적으로 다량의 난자들이 이용되며, 난자를 체외에서 성숙시켜 생산된 배아를 이용하기도 한다. 배아의 체외 생산은 체내에서 일어나는 난자의 성숙, 수정 및 배아 발달의 일련의 과정을 체외에서 실시하여 일정 수준 이상 발달이 진행된 배아를 확보하는 기술이다. 체외배양( In vitro culture)은 체내배양( In vivo culture)에 비해 효율이 현저히 낮기 때문에 체외성숙 조건을 개선하고자 하는 연구가 계속 진행되고 있다. 난자 및 배아의 배양 환경이 체내 환경과 유사한 정도에 따라 생산 효율의 차이가 나타나게 되므로, 체외 생산 기술 적용 시 체내 환경과 최대한 유사한 환경에서 실시하는 것이 바람직하다.
난자의 성숙 과정은 난자가 정자와 수정이 되기에 알맞은 상태로 되는 과정으로, 핵에서는 제 2차 감수분열 중기까지 감수분열이 진행되어 2n의 핵상을 나타내며 세포질에서는 세포소기관의 재배치, 세포골격의 운동, 기타 분자들의 성숙이 진행된다. 난자의 성숙이 제대로 진행되지 않으면 이후의 배아발달에도 부정적인 영향을 미치므로, 적절한 체외성숙(In vitro maturation, IVM) 시스템은 다음 단계의 실험을 위한 기초적이고 핵심적인 단계라고 할 수 있다.
배아를 체외에서 생산하는 방법의 효율은 체내 생산 방법에 비해 현저히 낮기 때문에 많은 연구자들에 의해 체외성숙 조건을 개선하고 배아의 체외생산 효율을 높이기 위한 연구가 진행되고 있다. 온도, 대기 및 배지의 조성 등 외부 조건들은 난자와 배아의 미토콘드리아 기능, 세포골격 발달 및 기타 소기관의 기능에 영향을 미치고, 이후 성숙 및 발달 단계에서 현저한 차이가 나타난다는 것이 밝혀졌다. 이러한 다양한 요인들 중 활성산소가 세포, 난자 및 배아 등의 발달에 관련이 있음을 밝히기 위한 실험들이 진행되고 있다.
세포 내에서 증가된 농도의 활성산소종은 세포 내의 여러 분자들과 반응하여 분자의 손상을 유발하고 궁극적으로 저조한 발달 효율을 나타내게 된다. 난자의 성숙이 진행되는 동안 일어나는 다양한 물질대사는 난자의 세포질 내의 활성산소종 농도를 증가시키게 된다. 활성산소농도의 증가는 ATP 농도를 감소시키고, 세포 내 칼슘이온을 증가시킨다. 이러한 특성에 의해 난자의 상태는 물론이고 배아 발달에도 해로운 영향을 미칠 수 있다. 이에, 활성산소종에 의한 손상을 방지하기 위하여 난자 내부 및 주변 생식기관에서는 항산화 시스템을 구축하고 활성산소종을 제거함으로써 세포의 손상을 최소화시킨다. 그러나, 체외에서 성숙되는 난자의 경우 외부 유래 산소에 의해 활성산소종의 발생이 더욱 증가하게 되고, 불완전한 항산화 시스템으로 인하여 체내에서 생산되는 난자에 비해서 활성산소종 농도가 높아진다. 결과적으로, 난자의 손상도 함께 증가하여 난자 및 배아 발달의 저해가 발생한다. 따라서, 체외에서 난자를 배양하는 경우에 활성산소종의 발생을 억제하여 난자의 성숙 및 발달 효율을 높이고, 결과적으로 배반포기 배아의 수득률을 높일 수 있는 기술 개발이 요구된다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 체외 배양 시 활성산소종의 발생을 감소시켜 난자의 발달률을 향상시키고, 체외 성숙란의 생산을 증가시킬 수 있는 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 헤스페레틴(Hesperetin)을 유효성분으로 포함하는, 난자 체외성숙용 배양액을 제공한다.
일 측에 따르면, 상기 헤스페레틴의 농도는 95μM 내지 110 μM 일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 난자 체외성숙용 배양액에서 배양된 난자를 제공한다.
일 측에 따르면, 상기 난자는 포유동물의 난자일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 포유동물은 돼지일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 1) 난자를 준비하는 단계; 2) 일반 배지에서 상기 난자를 체외 성숙 시키는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자를 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 노화시키는 단계; 4) 상기 배양액에서 노화시킨 난자의 단위발생을 유도시켜 난자를 활성화하는 단계; 및 5) 상기 활성화된 난자를 배양하는 단계; 를 포함하는 체외 배아 생산방법을 제공한다.
일 측에 따르면, 상기 헤스페레틴의 농도는 95μM 내지 110 μM 인 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 단계 2)의 체외 성숙은, 일반 배지에서 상기 난자를 44시간 동안 배양 하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 단계 3)의 노화는, 상기 단계 2)에서 성숙된 난자를 24시간 동안 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 배양 하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 난자는 포유동물의 난자일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 포유동물은 돼지일 수 있다.
본 발명의 헤스페레틴을 포함하는 난자 체외성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산방법은 난자의 활성산소종을 감소시켜 난자의 성숙 후 단위발생란의 배아 생산율을 높일 수 있으며, 결과적으로 체외수정란의 발달율을 향상시켜 배양의 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 대조군, aging군 및 헤스페레틴 처리군에서 난자의 세포질 내의 활성산소종 발생을 확인하는 사진 및 발생량을 비교하는 그래프이다.
도 2는 대조군, aging군 및 헤스페레틴 처리군에서 항산화 유전자 발현량을 비교하는 그래프이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
헤스페레틴(Hesperetin)은 감귤류의 귤 나무 열매에 널리 존재하는 천연 플라보노이드 화합물의 일종으로, 과산화수소와 같은 다양한 산화제 및 산화 스트레스 또는 기타 메커니즘을 통해 조직에 손상을 주는 화학 물질들 및 독소로부터 세포를 보호하고, 많은 반응성 산소종을 중화시키는 효과가 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 중 "단위발생란"은 정자에 의한 외래 유전자가 유입되어 활성화되는 정상적인 수정과는 달리, 약물처리를 통해 정자의 공급 없이 단독으로 활성화한 난자를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 중 "활성화"는 정상적인 난자와 정자의 수정에 의한 자극 후 생기는 난자 내의 변화를 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 중 "활성산소종(Oxidative reactive species, ROS)"은 일반적인 산소보다 활성이 크고 불안정하며 높은 에너지를 갖는 산소를 말한다. 활성산소종의 예로는, 수퍼옥사이드(O 2-), 과산화수소(H 2O 2), 하이드록시라디칼, 퍼옥시라디칼 등이 있다. 활성산소종은 자유 라디칼을 가져 불안정한 상태로 강한 활성을 가지게 되고, 생산이 과잉되면 세포에 산화적 손상(oxidative stress)를 가져오게 되어 유해산소라고 명명되기도 한다.
본 명세서 사용되는 용어 "극체 방출"은 난자 세포 주기 중 제2 감수분열 중기에 난자로부터 불균등 분열이 일어나며 할구가 생기는 현상을 의미하는 것으로, 난자의 성숙 정도에 대한 지표로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는, 난자 체외성숙용 배양액이 제공된다. 헤스페레틴의 농도는 전체 배양액을 기준으로 90 μM 내지 120 μM, 보다 바람직하게는 95 μM 내지 110 μM, 더욱 바람직하게는 약 100 μM 이다. 헤스페레틴의 농도가 전체 배양액을 기준으로 약 100 μM 인 경우, 다른 농도로 첨가하는 경우와 비교하여 가장 효과적으로 난자 성숙 및 배아 발달률을 높이는 것으로 나타났다(표 1 참조).
도 1은 난자 체외 성숙 배양액을 헤스페레틴으로 처리하는 경우 난자의 세포질 내 활성산소종 발생에 미치는 영향을 나타내는 것이다. 도 1의 결과를 통해 24시간 동안의 노화과정에서 100 μM 농도의 헤스페레틴을 처리한 경우(c), 처리하지 않은 aging군(b)에 비해 효과적으로 활성산소종 발생을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
도 2는 난자 체외 성숙용 배양액에 포함된 헤스페레틴의 유무에 따른 항산화 유전자 발현량을 비교하는 그래프이다. 도 2의 결과를 통해, 헤스페레틴 처리군이 aging군에 비해 SOD1 유전자의 발현은 약 56% 증가, Prdx5 유전자의 발현은 약 49% 증가하였으므로, 24시간 동안의 노화과정에서 100 μM 도의 헤스페레틴을 처리한 경우 그렇지 않은 경우에 비해 항산화 유전자의 발현이 훨씬 증가한 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 1) 난자를 준비하는 단계; 2) 일반 배지에서 상기 난자를 체외성숙 시키는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자를 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 노화시키는 단계; 4) 상기 노화된 난자의 단위발생을 유도시켜 난자를 활성화하는 단계; 및 5) 상기 활성화된 난자를 배양하는 단계; 를 포함하는 체외 배아 생산방법이 제공된다.
단계 2)의 체외 성숙은, 상기 난자를 44시간 동안 배양 하는 것일 수 있으며, 단계 3)의 노화는 단계 2)에서 성숙된 난자를 24시간 동안 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에 배양 하는 것일 수 있다.
단계 3)의 노화에 사용되는 체외 성숙용 배양액의 헤스페레틴 농도는 전체 배양액을 기준으로 90 μM 내지 120 μM, 보다 바람직하게는 95 μM 내지 110 μM, 더욱 바람직하게는 약 100 μM 이다. 헤스페레틴의 농도가 전체 배양액을 기준으로 약 100 μM 인 경우, 다른 농도로 첨가하는 경우와 비교하여 가장 효과적으로 난자 성숙 및 배아 발달률을 높일 수 있다.
본 발명의 난자 체외 성숙용 배양액에서 배양되거나, 노화되는 난자는 포유동물의 난자일 수 있으며, 보다 바람직하게는 돼지의 난자이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 실시예의 실험 결과는 Statistical Analysis System 소프트웨어 내의 일반 선형 모델 절차를 사용하여 분석된 것이다. Student의 T-검정과 Tukey-다중범위테스트를 이용하여 상대적인 유전자 발현을 비교하였다. P값은 실험에 따라 0.05 보다 작을 때 유의차가 있는 것으로 하였다.
< 실시예 1: 난자의 채취 및 체외 성숙>
도축장에서 돼지난소를 회수하여 75 ㎍/ml 페니실린 G(penicillin G)와 50 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가된 식염수에 옮겨 32~35℃의 온도를 유지하여 실험실로 운반하였다. 난포란은 직경 2~8 mm의 난포로부터 18게이지 주사바늘이 부착된 10 ml 주사기로 흡입한 후, 실체 현미경 하에서 난구 세포가 3층 이상으로 치밀하게 구성된 난자(Cumulus-oocyte complexes, COCs)를 선별하여 회수하였다. 회수한 난포란은 0.1% (w/v) 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 Hepes-buffered tissue culture medium 199(TCM-HEPES)로 3번 세척한 뒤, Earle's salts, 0.57 mM 시스테인(cysteine), 10 ng/ml상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF), 0.5 ㎍/ml 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH), 0.5 ㎍/ml 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH) 및 10% (v/v) 돼지 난포액이 첨가된 TCM-199 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 체외 성숙 배양액에서 3회 세척한다. 이후, 미네랄오일(mineral oil)로 덮인 500 ㎕의 체외 성숙 배양액으로 이동한 후, 38.8℃, 5% CO2 배양기에서 44시간 동안 배양하여 체외성숙을 유도하였다.
< 실시예 2: 헤스페레틴의 처리 - 노화단계>
실시예 1에 기재된 방법으로 체외성숙을 유도한 난자를 헤스페레틴이 각각 0, 1㎛, 10㎛, 100㎛, 250㎛ 농도로 첨가된 배양액에서 24시간 동안 배양하였다.
< 실시예 3: 단위발생 및 배아 배양단계>
단위발생란을 준비하기 위해 실시예 1 및 실시예 2에 따라 체외성숙 시킨 후, 난구세포들을 1mg/mL 의hyaluronidase로 처리하고, 부드럽게 피펫팅하여 제거한다. 난자들을 5 μM Ca2+ionomycin (Sigma)으로 5분 동안 처리하여 단위발생을 유도하였다. 단위발생이 유도된 배아를 7.5 ㎍/ml Cytochalasin B를 3시간 동안 처리한 다음 0.4% FAF-BSA가 첨가된 PZM-5 배양액에 옮겨 배양하였다. 배양 4일째에 10% 인간지방중간엽줄기세포 유래 생리활성물질용액이 들어있는 배양액으로 옮겨 추가로 배양을 실시하고, 배양 2일과 6일, 각각 난할율과 배반포 형성율을 조사하였다.
< 실시예 4: 헤스페레틴 처리에 따른 항산화 유전자 발현량 측정>
실시간 역전사 PCR 분석을 위해서 배반포 배아의 mRNA는 magnetic bead (Dynabeads mRNA Purification Kit; Dynal, Oslo, Norway) 를 이용해 추출하였다. 배반포 배아에 20 ㎕ lysis/binding buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, 1% LiDS and 5 mM DTT)를 넣고 상온에서 5분간 vortexing으로 완전히 용해시킨다. oligo (dT)20 primer - magnetic bead 20 ㎕를 첨가하고, 65℃에서 5분 동안 반응시킨다. 혼성화된 mRNA와 oligo (dT)20 primer-bead를 Washing buffer A로 2번, Washing buffer B로 1번 세척한다. mRNA는 15 ㎕ DEPC 처리된 3차 증류수 안에 있는 bead로부터 추출하였다.
cDNA는 oligo (dT)20 primer 와 SuperScript Ⅱ reverse transcriptase (Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 합성하였다. 실시간 역전사 PCR을 위하여 Step One Plus Real-time PCR system (Applied biosystems, Warrington WA1 45R, UK) 기기를 사용하였으며 반응에 사용된 Primer는 하기의 표 1에 나타내었다. Threshold cycle (Ct) 값은 표본 형광값이 통계학적으로 배경 형광값을 초과하였을 때의 cycle 수를 나타낸다. 반응을 감지하기 위해서 SYBR Green PCR Master Mix (Applied biosystems, Warrington WA1 45R, UK)를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10분 반응시킨 뒤, 95℃에서 15초, 54℃에서 1분의 과정을 39회 반복하고 12℃로 냉각시킨다. SYBR Green 형광값은 신장반응단계 후에 측정된다. PCR 산물은 melting curve에 의해 분석된다. PCR 산물의 녹는점은 서열 특이적이기 때문에 비특이적 반응과 구별할 수 있다. 각 mRNA의 Crossing point (CP)를 결정하기 위해서 실시하며, 형광값 검출 지점을 지정할 수 있다. 연관된 유전자 발현량은 GAPDH 또는
Figure PCTKR2018007998-appb-img-000001
-Actin mRNA 발현에 따라
Figure PCTKR2018007998-appb-img-000002
방법으로 평준화하여 분석하였다.
Figure PCTKR2018007998-appb-img-000003
< 실험예 1: 헤스페레틴 처리에 따른 난자의 성숙 및 배아 발달률>
실시예 1의 대조군과, 실시예 2의 헤스페레틴 처리군 및 aging군에서의 난자 성숙률을 관찰하고 단위발생을 통하여 난자를 활성화 시킨 뒤 최종적으로 배반포 시기까지 배양하여 배아의 난할률과 배반포 도달률을 측정하였다(표2 참조). 대조군의 난자 성숙률은 체외성숙 44시간 후 제1극체 방출률로 측정하였고, 헤스페레틴 처리군 및 aging군의 난자 성숙률은 체외성숙 44시간 후 24시간 동안 노화과정을 거친 난자의 제1 극체 방출률로 측정하였다. 난자의 성숙률은 대조군에서 47.2% ± 0.6, 1μM 헤스페레틴 처리군에서 42.5% ± 1.0, 10μM 헤스페레틴 처리군에서 43.2% ± 1.1, 100μM 헤스페레틴 처리군에서 44.3% ± 1.4, 250μM 헤스페레틴 처리군에서 44.3% ± 1.1, aging군에서 44.3% ± 2.0으로 측정되었으며, 헤스페레틴 처리군과 대조군의 난자 성숙률이 유의적으로 차이나지 않음을 확인할 수 있었다(P < 0.05). 단위발생 후 체외배양 2일차의 난할률은 대조군에서 57.4% ± 1.0%, 1μM 헤스페레틴 처리군에서 54.5% ± 4.7%, 10μM 헤스페레틴 처리군에서 43.4% ± 1.6%, 100μM 헤스페레틴 처리군에서 56.0% ± 3.1%, 250μM 헤스페레틴 처리군에서 42.3% ± 3.0%, aging군에서 40.7% ± 6.1%로 측정되었으며, aging군에서 난할률이 가장 낮은 것을 확인할 수 있다. 체외배양 6일차의 배반포 발달률은 대조군에서 61.5% ± 3.2%, 1μM 헤스페레틴 처리군에서 20.7% ± 6.1%, 10μM 헤스페레틴 처리군에서 26.9% ± 2.4%, 100μM 헤스페레틴 처리군에서 46.2% ± 3.1%, 250μM 헤스페레틴 처리군에서 29.3% ± 3.0%, aging군에서 31.8% ± 6.1%로 측정되었으며, 헤스페레틴 처리군 중에서 100μM 헤스페레틴에서 발달률이 aging군에 비해 유의적으로 증가하였다(P < 0.05). 상기의 결과를 통해 100μM 농도의 헤스페레틴 처리가 난자의 활성산소종의 악영향을 방지하는 데 가장 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2018007998-appb-img-000004
< 실험예 2: 헤스페레틴 처리에 따른 난자의 활성산소종 발생 감소>
대조군과 헤스페레틴 처리군 및 aging군의 난자의 세포질에 존재하는 활성산소종의 발생 정도를 비교하기 위하여 실시예 1 및 2에 따라 체외성숙용 배양액에서 성숙이 유도된 COCs를 회수한 후, 1 mg/mL hyaluronidase를 처리하고 부드럽게 피펫팅하여 난구세포들을 제거한다. 난구세포가 제거된 난자를 0.1% (w/v) BSA가 첨가된 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 3회 세척한 후, 10 μM diachlorohydrofluorescein diacetate(DCFDA) 용액으로 이동하였다. 이 후, 38.8℃, 5% CO 2 배양기에서 20분 동안 반응시키고 0.1% (w/v) BSA가 첨가된 PBS(0.1% B-PBS)에서 5회 이상 충분히 세척한 후 도립현미경 (Olympus IX-71, Japan)으로 각각의 형광값을 측정한 후, 대조군의 형광값으로 평준화하여 조사하였다(도 1 참조).
aging군의 활성산소종 발생 비율은 1.46 ± 0.03, 100μM 헤스페레틴 처리군은 1.14 ± 0.03으로 확인되었다. 결과적으로, 24시간 동안의 노화과정을 거쳤을 때, 100μM 헤스페레틴 처리군에서 aging군에 비해 효과적으로 활성산소종 발생을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다(*P<0.05, **P<0.01).
< 실험예 3: 헤스페레틴 처리에 다른 항산화 유전자 발현량 증가>
실시예 4에서 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응을 통하여 측정된 항산화 유전자의 발현량은 항존유전자(housekeeping gene)인 GAPDH의 발현량으로 평준화하여 비교되었다. 그 결과, SOD1 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 aging군에서는 약 45%로 감소하고, 헤스페레틴 처리군에서는 약 70%로 감소하였다. Prdx5 유전자의 발현은 대조군과 비교하여 aging군에서는 약 55%로 감소하고, 헤스페레틴 처리군에서 약 82%로 감소하였다. 결과적으로, aging군과 헤스페레틴 처리군을 비교하면, 헤스페레틴 처리군이 aging군에 비해 SOD1 유전자의 발현은 약 56% 증가, Prdx5 유전자의 발현은 약 49% 증가하였으므로, 24시간 동안의 노화과정에서 100 μM 농도의 헤스페레틴을 처리한 경우 그렇지 않은 경우에 비해 항산화 유전자의 발현이 훨씬 증가한 것을 알 수 있다(*P<0.05, **P<0.01).
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (11)

  1. 헤스페레틴(Hesperetin)을 유효성분으로 포함하는, 난자 체외성숙용 배양액.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 헤스페레틴의 농도는 95μM 내지 110 μM 인 것인, 난자 체외성숙용 배양액.
  3. 제1항 또는 제2항의 난자 체외성숙용 배양액에서 배양된, 난자.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 난자는 포유동물의 난자인, 난자.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 포유동물은 돼지인, 난자.
  6. 1) 난자를 준비하는 단계;
    2) 일반 배지에서 상기 난자를 체외 성숙 시키는 단계;
    3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자를 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 노화시키는 단계;
    4) 상기 배양액에서 노화시킨 난자의 단위발생을 유도시켜 난자를 활성화하는 단계; 및
    5) 상기 활성화된 난자를 배양하는 단계; 를 포함하는 체외 배아 생산방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 헤스페레틴의 농도는 95μM 내지 110 μM 인 것인, 체외 배아 생산방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단계 2)의 체외 성숙은, 일반 배지에서 상기 난자를 44시간 동안 배양 하는 것인, 체외 배아 생산방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 단계 3)의 노화는, 상기 단계 2)에서 성숙된 난자를 24시간 동안 헤스페레틴을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 배양 하는 것인, 체외 배아 생산방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 난자는 포유동물의 난자인, 체외 배아 생산방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 포유동물은 돼지인, 체외 배아 생산방법.
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