KR102624886B1 - 광어 알 추출물을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법 - Google Patents
광어 알 추출물을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액은 활성 산소종 억제를 통해 난자를 질적으로 향상시킬 수 있으며, 본 발명의 배양액에서 성숙된 체외 성숙 난자를 이용하면 체외 배아 생산 효율을 증가시킬 수 있다.
Description
본 발명은 광어의 알에서 추출한 엽산을 포함하는 난자 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산방법에 관한 것이다.
생명공학 기술이 발전함에 따라 배아를 이용한 신약 개발 또는 이종장기이식 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 연구들에는 공통적으로 다량의 난자들이 이용되며, 난자를 체외에서 성숙시켜 생산된 배아를 이용하기도 한다. 배아의 체외 생산은 체내에서 일어나는 난자의 성숙, 수정 및 배아 발달의 일련의 과정을 체외에서 실시하여 일정 수준 이상 발달이 진행된 배아를 확보하는 기술이다. 난자의 성숙 과정은 난자가 정자와 수정이 되기에 알맞은 상태로 되는 과정으로, 핵에서는 제2차 감수분열 중기까지 감수분열이 진행되어 2n의 핵상을 나타내며 세포질에서는 세포소기관의 재배치, 세포골격의 운동, 기타 분자들의 성숙이 진행된다. 난자의 성숙이 제대로 진행되지 않으면 이후의 배아발달에도 부정적인 영향을 미치므로, 적절한 체외 성숙(In vitro maturation, IVM) 시스템은 다음 단계의 실험을 위한 기초적이고 핵심적인 단계라고 할 수 있다.
체외배양 (In vitro culture)은 체내배양 (In vivo culture)에 비해 효율이 현저히 낮기 때문에 많은 연구자들에 의해 체외배양 조건을 개선하고 배아의 체외생산 효율을 높이기 위한 연구가 진행되고 있다. 난자 및 배아의 배양 환경이 체내 환경과 유사한 정도에 따라 생산 효율의 차이가 나타나게 되므로, 체외 생산 기술 적용 시 체내 환경과 최대한 유사한 환경에서 실시하는 것이 바람직하다.
한편, 온도, 대기 및 배지의 조성 등 외부 조건들은 난자와 배아의 미토콘드리아 기능, 세포골격 발달 및 기타 소기관의 기능에 영향을 미치고, 이후 성숙 및 발달 단계에서 현저한 차이가 나타난다는 것이 밝혀졌다. 이러한 다양한 요인들 중 활성산소가 세포, 난자 및 배아 등의 발달에 관련이 있음을 밝히기 위한 실험들이 진행되고 있다.
세포 내에서 증가된 농도의 활성산소종은 세포 내의 여러 분자들과 반응하여 분자의 손상을 유발하고 궁극적으로 난자의 저조한 발달 효율을 초래한다. 난자의 성숙이 진행되는 동안 일어나는 다양한 물질대사는 난자의 세포질 내의 활성산소종 농도를 증가시키고, 활성산소농도의 증가는 ATP 농도를 감소시키며, 세포 내 칼슘이온을 증가시킨다. 이러한 특성에 의해 난자의 상태는 물론이고 배아 발달에도 해로운 영향을 미칠 수 있다. 이에, 활성산소종에 의한 손상을 방지하기 위하여 난자 내부 및 주변 생식기관에서는 항산화 시스템을 구축하고 활성산소종을 제거함으로써 세포의 손상을 최소화한다. 그러나, 체외에서 성숙되는 난자의 경우 외부 유래 산소에 의해 활성산소종의 발생이 더욱 증가하게 되고, 불완전한 항산화 시스템으로 인하여 체내에서 생산되는 난자에 비해서 활성산소종 농도가 높아진다. 결과적으로, 난자의 손상도 함께 증가하여 난자 및 배아 발달의 저해가 발생한다. 따라서, 체외에서 난자를 배양하는 경우에는 활성산소종의 발생을 억제하여 난자의 성숙 및 발달 효율을 높이고, 결과적으로 배반포기 배아의 수득률을 높일 수 있는 기술 개발이 요구된다.
제주의 광어 생산량은 대한민국 전체 60% 이상, 광어 수출량의 95% 이상을 차지하며, 광어 알 처리량은 연간 약 9,000 톤이다. 따라서, 본 발명자들은 저 부가가치 폐기물로 간주되어 버려지는 광어 알을 산업적으로 활용할 수 있는 방법에 대한 연구를 진행하였다.
이러한 배경 하에, 본 발명자 들은 체외 성숙 (In vitro maturation, IVM) 기간 동안 광어 알 추출물의 처리가 난자의 체외 배양 시 활성 산소종의 발생을 감소시켜 난자의 발달률을 향상시키고, 체외 성숙란의 생산을 증가시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 광어 알 추출물을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액 및 이를 이용한 체외 배아 생산방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액을 제공한다.
일 측에 따르면, 상기 광어 알 추출물은 물, 주정, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출 용매로 추출된 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 추출 용매는 30 내지 70%(v/v) 에탄올일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 난자는 인간을 제외한 포유동물의 난자일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 포유동물은 돼지일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 광어 알 추출물은 상기 배양액 기준 650 내지 700 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 1) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계; 2) 일반 배지에서 상기 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자의 단위발생을 유도하여 난자를 활성화하는 단계; 및4) 상기 활성화된 난자를 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 배양하는 단계; 를 포함하는 체외 배아 생산방법이 제공된다.
본 발명의 광어 알 추출물을 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액은 난자의 활성 산소종 발생을 억제하고, 환원형 글루타티온을 증가시켜 난자 성숙율을 증가시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 배양액은 체외 성숙된 난자의 배아 생산율을 높일 수 있으며, 결과적으로 본 발명의 배양액을 이용하면 체외 수정란의 발달율을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 70%(v/v), 30%(v/v)의 EtOH 및 증류수를 추출 용매로 하여 얻은 광어 알 추출물을 이용하여 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 70%(v/v), 30%(v/v)의 EtOH 및 증류수를 추출 용매로 하여 얻은 광어 알 추출물을 이용하여 FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power) 분석을 수행한 결과이다.
도 3의 (a)는 광어알 추출물을 첨가에 따른 환원성 글루타티온 측정결과의 형광 이미지이고, 도3의 (b)는 광어알 추출물 첨가에 따른 글루타티온 발생 비율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 70%(v/v), 30%(v/v)의 EtOH 및 증류수를 추출 용매로 하여 얻은 광어 알 추출물을 이용하여 FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power) 분석을 수행한 결과이다.
도 3의 (a)는 광어알 추출물을 첨가에 따른 환원성 글루타티온 측정결과의 형광 이미지이고, 도3의 (b)는 광어알 추출물 첨가에 따른 글루타티온 발생 비율을 나타낸 그래프이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "단위발생란"은 정자에 의한 외래 유전자가 유입되어 활성화되는 정상적인 수정과는 달리, 약물처리를 통해 정자의 공급 없이 단독으로 활성화한 난자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "활성화"는 정상적인 난자와 정자의 수정에 의한 자극 후 생기는 난자 내의 변화를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "글루타티온(Glutathione, GSH)"은 주요한 비 단백 sulfhydryl 화합물로 세포를 활성산소의 영향으로부터 보호하는 역할을 수행하는 것으로 알려진 물질로, 난자 성숙기간 동안 GSH의 합성은 정자 침입 후 웅성 전핵의 형성을 위해 필요하다고 보고된 바 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성산소종(ROS)"은 세포에 손상을 입히는 모든 종류의 변형된 산소를 뜻하며, O2-, -OH, RO2, HO2-, H2O2등이 ROS에 포함된다. 활성 산소종은 자유 라디칼을 가지고 있으므로 불안정한 상태로 강한 활성을 나타내며, 세포사멸(apoptosis), 산화적 손상(oxidative stress), 지질 과산화, 효소의 불활성화 등 세포에 부정적 영향을 미치고, 정자의 운동성 감소, 수정억제 및 배아 발달의 저하 등 체외배양 효율을 감소시킨다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는, 난자의 체외 성숙용 배양액이 제공된다. 바람직하게는, 상기 광어 알 추출물은 상기 배양액 기준 650 내지 700ppm의 농도로 포함될 수 있다.
상기 광어 알 추출물은 물, 주정, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출 용매로 추출된 것일 수 있고, 30 내지 70%(v/v) 에탄올을 추출 용매로 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 난자의 체외 성숙용 배양액은 인간을 제외한 포유동물의 난자, 예를 들어 개, 고양이, 양, 소, 마우스, 래트, 토끼, 가장 바람직하게는 돼지 난자의 체외 성숙에 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 1) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계; 2) 일반 배지에서 상기 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계; 3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자의 단위발생을 유도하여 난자를 활성화하는 단계; 및4) 상기 활성화된 난자를 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 배양하는 단계; 를 포함하는, 체외 배아 생산방법이 제공된다.
본 발명의 체외 배아 생산방법에서 이용되는 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에 관한 설명은 상술한 바와 같으며, 중복 기재를 피하기 위해 상세한 설명은 생략한다.
한편, 미성숙 난자의 체외 성숙에 사용되는 일반 배지는 상피세포성장인자(EGF), 여포 자극 호르몬(FSH), 황제형성호르몬(LH), 난포액 등이 포함된 배지를 이용할 수 있으며, 난자의 종류에 따라 적절하게 공지된 배지를 일반 배지로 사용할 수 있다.
결론적으로, 본 발명의 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 난자의 체외 성숙용 배양액을 이용하여 난자를 체외 성숙시키는 경우, 난자의 성숙률 및 배아 발달률을 증가시키는 효과를 가진다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 광어 알 추출물의 제조 및 항산화 효과 분석
광어 알을 EtOH 100 %, 70%, 30% EtOH 및 3 차 증류수 100ml에 첨가 후 진탕 배양기에 25℃에서 30분간 반응시켰다. 회전식 감압농축기로 EtOH을 증발시키고, 0.45um 시린지 필터(syringe filter)로 필터링한 후 동결건조 하였다.
이하의 실험에서 DPPH와 FRAP의 화학적 분석의 작업 농도는 8, 16, 31, 125, 250, 500 및 1000㎍/mL이다.
DPPH는 자체적으로 보유하고 있는 홀수 개의 안정한 라디칼 전자로 인해 517 nm에서 강한 흡수를 나타내는 한편, 폴리페놀과 같은 수소에 전자를 제공하는 전자 공여체와 반응할 경우 전자가 수소 라디칼을 받아 페녹시(phenoxy) 라디칼을 형성하여 안정한 형태의 분자로 변하고, 따라서 상기 파장에서의 흡광도가 감소한다. 이 때, 공여된 전자는 비가역적으로 결합하며 그 수에 비례하여 DPPH의 진보라색이 옅어지며 흡광도가 감소한다. 12웰 플레이트에 광어 알 70%(v/v), 30%(v/v) EtOH 추출물 및 3차 증류수 추출물 1 ml와 0.15 mM DPPH(Sigma Co., USA) 1 ml를 첨가한 후 진탕 배양기에 30℃에서 5분간 반응시킨 후 실온에서 30분 동안 추가적으로 반응시킨 후 분광 광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 광어 알 추출물의 항산화 활성인 환원력은 50% 저해활성 농도(inhibition concentration at 50% of activity, IC50)로 나타냈다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 광어 알의 30%(v/v) EtOH 추출물은 1000ppm에서 74.5 %의 라디칼 소거율을 보였고, 광어 알의 70%(v/v) EtOH 추출물은 약 70%의 라디칼 소거율을 보여 광어 알 추출물의 항산화 능력이 우수함을 확인할 수 있었다.
FRAP 방법은 유색 페러스 트리피리딜 트리아진 복합체(colored ferrous tripyridyl triazine complex)에 의해 철(III)이온(ferric ion)이 철(II)이온(ferrous)으로 전환되는 과정을 분석함으로써 시료 내의 총 항산화력을 측정하는 방법으로, 낮은 pH에서 환원제에 의해 3가 철이 2가 철로 환원되는 원리를 기초로 하는 방법이다. 원액 (stock solution)으로 300 mM 아세테이트 완충액 (acetate buffer, pH3.6), 40 mM 염산 (HCl)로 용해시킨 10 mM TPTZ(2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액, 그리고 증류수에 용해시킨 20 mM FeCl·6H2O를 제조하고, 사용 직전에 이들을 10:1:1의 비율로 혼합하여 37℃ 10 내지 15분 동안 가온 (warming)해준 뒤 FRAP 시약 (working solution)으로 사용하였다. 광어 알 70%(v/v), 30%(v/v) EtOH 추출물 및 3차 증류수 추출물을 희석한 추출물 15㎕에 285㎕의 FRAP시약을 혼합하여 암소에서 10분간 반응시킨 다음, 593㎚에서 흡광도를 측정하고, 다음의 식으로 광어 알 추출물의 환원력을 계산하였다:
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 광어 알의 30%(v/v) EtOH 추출물 1000ppm에서의 환원력은 약 0.122로 나타났고, 광어 알의 70%(v/v) EtOH 추출물의 경우 환원력은 약 0.13으로 나타났다.
실시예 2. 난자의 채취 및 체외성숙
돼지로부터 난소를 회수하여 75 ㎍/ml 페니실린 G(penicillin G)와 50 ㎍/ml 스트렙토마이신 (streptomycin)이 첨가된 식염수에 옮겨 32~35℃의 온도를 유지한 상태로 실험실로 운반하였다. 난포란은 직경 2~8 mm의 난포로부터 18게이지 주사바늘이 부착된 10 ml 주사기로 흡입한 후, 실체 현미경 하에서 난구 세포가 3층 이상으로 치밀하게 구성된 난자(Cumulus-oocyte complexes, COCs)를 선별하여 회수하였다. 회수한 난포란은 0.1% (w/v) 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 첨가된 Hepes-buffered tissue culture medium 199(TCM-HEPES)로 3번 세척한 뒤, 얼의 염(Earle's salts), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 10 ng/ml상피세포성장인자 (epidermal growth factor, EGF), 0.5 ㎍/ml 여포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH), 0.5 ㎍/ml 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH) 및 10% (v/v) 돼지 난포액이 첨가된 TCM-199 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 체외 성숙 배양액에서 3회 세척한다. 이후, 미네랄오일(mineral oil)로 덮인 500 ㎕의 체외성숙 배양액으로 이동한 후, 38.8℃, 5% CO2 배양기에서 44시간 동안 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 체외성숙 배양액은, POEE를 처리하지 않은 군(표1의 normal)과, H2O2를 처리하여 과산화된 환경을 만들고 광어알을 첨가하지 않은 0 POEE군 (Paralichthys olivaceus eggs extract; 광어알 추출물)(표1의 control), 및 POEE를 각각 600, 650, 700, 750 ppm 농도로 첨가한 군으로 나누어 실험하였다.
실시예 3. 광어 알 추출물의 처리에 따른 난자의 성숙 및 배아 발달율 비교
단위발생란을 준비하기 위해, 난자는 체외 성숙용 배양액에 POEE를 처리하지 않은 군(표 1의 normal)과, H2O2를 처리하여 과산화된 환경을 만든 0 POEE군(표 1의 control), 및 POEE를 각각 650, 700, 750 ppm농도로 첨가한 군으로 나누어 44시간 동안 체외성숙 시킨 후, 난구세포들을 1mg/mL 히알루로니다아제(hyaluronidase)을 처리하여 부드럽게 피펫팅하여 제거한다. 난자들은 5μM Ca2+아이오노마이신(시그마)(ionomycin (Sigma))에서 5분 처리하여 난자를 활성화시켜 단위발생을 유도하였다. 단위발생이 유도된 배아는 7.5 ㎍/ml 사이토칼라신 B(Cytochalasin B)에 3시간 동안 공배양시킨 다음, 0.4% FAF-BSA가 첨가된 PZM-5 배양액에 옮겨 배양하였다. 배양 5일에 10% FBS가 들어있는 배양액으로 옮겨 추가로 배양을 실시하였고, 배양 2일과 6일, 각각 난할율과 배반포 형성율을 조사하였다. POEE를 처리하지 않은 군과 POEE 처리군의 난할률과 배반포 도달률은 아래의 표에 나타내었다.
난자의 성숙률은 체외성숙 44시간 후 생존률 확인으로 측정하였다. 난자의 성숙률은 과산화 처리군인 0 POEE 군(표 1의 control)에서 91.2%±1.7%, 650 POEE 군에서 95.3%±1.4%로 나타났다. 즉, 650 POEE 처리군의 난자의 성숙률이 0 POEE군 대비 4.5% 로 유의적으로 증가하였다 (P < 0.05). 단위발생 후 체외배양 2일차의 난할률은 0 POEE 군이 66.0% ± 2.3%, 650, 700, 750 POEE군에서 각각 72.9% ± 2.3%, 74.8% ± 2.3%, 72.6% ± 0.9% 로 나타났다. 즉, 650, 700, 750 POEE군의 난할률이 0 POEE군 대비 각각 10.5%, 13.3%, 10%로 유의적으로 증가하였다 (P < 0.05). 체외배양 7일차의 배반포 발달율은 0 POEE군에서 21.0% ± 4.1%, 650 POEE군에서 유의적인 차이는 없었으나, 700 POEE군에서 29.2% ± 1.4%로 유의적으로 배반포 생성율이 0 POEE군 대비 39.5% 증가하는 것을 볼 수 있었다 (P < 0.05).
[표 1]
실시예 4. POEE 처리에 따른 난자의 환원형 글루타티온 발생 증가
난자의 체외성숙을 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 환원형 글루타티온 측정을 진행하였다.
POEE를 처리하지 않은 군과, 과산화 처리한 0 POEE군, 및 POEE 처리군의 난자의 세포질에 존재하는 활성산소종의 발생 정도를 비교하기 위하여, 실시예 2에 따라 체외성숙용 배양액에서 성숙이 유도된 COCs를 회수한 후, 1mg/mL히알루로니다아제(hyaluronidase)를 처리하고 부드럽게 피펫팅하여 난구세포들을 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자를 0.1% (w/v) BSA가 첨가된 인산 완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 3회 세척한 후, 10 μM CMF2HC로 용액으로 이동하였다. 이후, 38.8℃, 5% CO2 배양기에서 20분 동안 반응시키고 0.1% (w/v) BSA가 첨가된 PBS(0.1% B-PBS)에서 5회 이상 충분히 세척한 후 도립현미경 (Olympus IX-71, Japan)으로 각각의 형광값을 측정한 결과, CMF2HC의 여기 및 방출 파장은 각각 371 및 464nm이었다. 그레이 스케일 이미지는 현미경에 부착된 디지털 카메라 (Nikon, Tokyo, Japan)로 획득하였고, 평균 그레이 스케일 값은 Image J 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD)를 사용하여 계산하였다. 배경 형광 값은 통계 분석 전에 최종 값에서 제외되었다(도3(a) 참조).
과산화군인 0 POEE의 글루타티온 발생 비율은 45 ± 4.1이고, 600, 650 POEE 처리군은 각각 55 ± 0.9, 55 ± 1.0으로 확인되었다. 결과적으로, 600, 650 POEE 실험군에서는 과산화된 환경을 만들어 H2O2를 처리한 0 POEE의 대조군에 비해 약22.2 % 정도로 환원형 글루타티온 발생이 효과적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (P<0.05). 이와 같은 난자의 성숙률 및 항산화 효과 결과를 통해, 특히 650 POEE 처리한 실험군에서 난자의 성숙과 배아의 발달율 증가에 효과가 있음을 확인하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (11)
- 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는, 난자의 체외 성숙용 배양액으로서, 상기 광어 알 추출물은 주정 및 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 중 어느 하나의 추출 용매로 추출된 것인, 난자의 체외 성숙용 배양액.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 추출 용매는 30 내지 70%(v/v) 에탄올인, 난자의 체외 성숙용 배양액.
- 제1항에 있어서,
상기 난자는 인간을 제외한 포유동물의 난자인, 난자의 체외 성숙용 배양액.
- 제4항에 있어서,
상기 포유동물은 돼지인, 난자의 체외 성숙용 배양액.
- 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광어 알 추출물은 상기 배양액 기준 650 내지 700 ppm의 농도로 포함되는, 난자의 체외 성숙용 배양액.
- 1) 인간을 제외한 포유동물의 미성숙 난자를 준비하는 단계;
2) 일반 배지에서 상기 미성숙 난자를 체외 성숙시키는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 성숙된 난자의 단위발생을 유도하여 난자를 활성화하는 단계; 및
4) 상기 활성화된 난자를 광어 알 추출물을 유효성분으로 포함하는 체외 성숙용 배양액에서 배양하는 단계;
를 포함하는, 체외 배아 생산방법으로서,
상기 광어 알 추출물은 주정 또는 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 중 어느 하나의 추출 용매로 추출된 것인, 체외 배아 생산방법.
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 추출 용매는 30 내지 70%(v/v) 에탄올인, 체외 배아 생산방법.
- 제7항에 있어서,
상기 포유동물은 돼지인, 체외 배아 생산방법.
- 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 광어 알 추출물은 상기 배양액 기준 650 내지 700 ppm의 농도로 포함되는, 체외 배아 생산방법.
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