CN117362461A - 一种山荆子果实多糖及其在延缓卵母细胞老化中的应用 - Google Patents
一种山荆子果实多糖及其在延缓卵母细胞老化中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种山荆子果实多糖及其在延缓卵母细胞老化中的应用，属于生物学技术领域。本发明通过水浸提法提取山荆子果实粉末中的多糖，并通过超滤膜获得10‑50kDa的山荆子果实多糖。实验研究表明，本发明所制备的山荆子果实多糖可以降低哺乳动物卵母细胞的破裂率，提高囊胚形成率，抑制活性氧生成，延缓卵母细胞衰老，同时可促进卵巢颗粒细胞增殖。因此，其可以通过双重作用机制实现延缓卵母细胞老化的功能，具有优异的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种山荆子果实多糖及其在延缓卵母细胞老化中的应用。
背景技术
哺乳动物卵母细胞体外成熟技术是当今动物生殖科技领域的研究热点。自20世纪60年代起，随着细胞生物学和培养技术的进步，研究者开始探索在体外环境中实现卵母细胞的成熟培养。经过长期的试验和优化，目前已初步建立了哺乳动物卵母细胞的体外培养体系。
然而，哺乳动物卵母细胞体外成熟技术仍有很大改进空间。哺乳动物的卵母细胞在体外培养环境下会出现老化现象，这限制了当前卵母细胞体外成熟技术的应用和发展。因此，优化培养体系、提高成熟率、改善卵子质量、减缓衰老过程是哺乳动物卵子体外成熟技术亟待解决的关键科学问题，需要进一步研究来克服目前的瓶颈。
同时，随着哺乳动物年龄的增加，其体内的卵母细胞会出现数量减少和质量下降的衰老变化，这严重影响了其体外培养成熟的能力。在卵母细胞的体内老化过程中，卵巢颗粒细胞的数量及活性与卵母细胞的老化密切相关，卵巢颗粒细胞可以分泌细胞因子、促黄体生成素等物质，参与调控卵母细胞的生长发育，减缓卵母细胞的衰老。因此，有效的增加卵巢颗粒细胞的数量，可以有效的减缓哺乳动物体内衰老，提高其体外培养成熟的能力。
发明内容
本发明的目的在于一种可以有效的延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖。
为实现该目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖，所述山荆子果实多糖由如下的制备方法制备得到：
（1）将干燥后的山荆子果实研磨成粉末，得到山荆子果实粉末；
（2）按照无菌水：粉末=20ml：1g的比例添加无菌水，搅拌均匀后，加热至90℃浸泡提取3h；
（3）离心去除剩余的沉淀，得到山荆子果实浸提液；
（4）通过旋转蒸发的方式将所述山荆子果实浸提液浓缩为原体积的20%，之后加入4倍量的无水乙醇，在4℃下醇沉24h，得到山荆子果实粗多糖；
（5）将所述山荆子果实粗多糖使用蒸馏水溶解为1mg/ml的粗多糖溶液，使用sevage法重复8次，去除所述粗多糖溶液中的蛋白质，得到山荆子果实多糖溶液；
（6）使用10kDa的超滤膜对所述山荆子果实多糖溶液过滤后，将截留液使用50kDa的超滤膜进行过滤，将得到的过滤液进行冷冻干燥，得到山荆子果实多糖。
优选地，所述哺乳动物为猪。
其次，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备延缓哺乳动物卵母细胞老化的药物中的应用。
其次，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备延缓哺乳动物卵母细胞体外培养老化的培养基中的应用。
其次，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备提高哺乳动物卵母细胞胚胎发育能力的培养基中的应用。
其次，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备减少哺乳动物卵母细胞氧化损伤的培养基中的应用。
除此之外，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备提高哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖能力的药物中应用。
优选地，所述哺乳动物为猪。
优选地，所述药物为液体药物，所述药物中山荆子果实多糖的浓度为0.1mg/ml-2mg/ml。
优选地，所述药物中山荆子果实多糖的浓度为1mg/ml。
其次，本发明提供了一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的成熟培养基，所述成熟培养基包括山荆子果实多糖和基础成熟培养基；所述山荆子果实多糖由上述的制备方法制备得到。
优选地，所述培养基中山荆子果实多糖的浓度为不少于0.1mg/ml。
优选地，所述培养基中山荆子果实多糖的浓度为0.1mg/ml-2mg/ml。
优选地，所述培养基中山荆子果实多糖的浓度为1mg/ml。
优选地，每10ml所述基础成熟培养基的组成成分为M-199培养基 8.7ml，L-半胱氨酸 0.57mM，丙酮酸钠 0.91mM，卡那霉素 75μg/ml，胰岛素 1 μg/ml； 表皮生长因子 20ng/ml，猪卵泡液 1ml，促卵泡生成素 0.5μg/ml，黄体生成素0.5μg/ml。
本发明的有益效果在于：
本发明发现，本发明所制备的山荆子果实多糖可以显著降低衰老卵母细胞的胞质破裂率，具有抑制卵母细胞老化的效果。
其次，本发明所制备的山荆子果实多糖可以提高衰老卵母细胞的囊胚形成率，改善其胚胎发育能力，并且其可以抑制衰老卵母细胞中的活性氧(ROS)生成，起到抗氧化作用。
除此之外，本发明发现山荆子果实多糖可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。
整体来看，山荆子果实多糖可以通过直接作用于卵母细胞抑制其衰老，和促进卵巢颗粒细胞增殖两方面来发挥延缓哺乳动物卵母细胞衰老的作用。因此，其具有一定的应用前景和研究价值，可开发为延缓生殖细胞衰老的药物。
附图说明
图1为本发明所制备的山荆子果实多糖处理后卵母细胞破碎率的变化；
图2为本发明所制备的山荆子果实多糖处理后卵母细胞的孤雌囊胚率的变化；
图3为本发明所制备的山荆子果实多糖处理后卵母细胞中的ROS的变化；
图4为本发明所制备的山荆子果实多糖处理后卵巢颗粒细胞的增殖变化；
在图1-图4中，*表示P＜0.05，差异具有统计学意义；**表示P＜0.01，差异显著；***表示P＜0.001，差异极显著。
具体实施方式
实施例1
1.将干燥后的山荆子果实研磨成粉末，得到山荆子果实粉末；
2.按照无菌水：粉末=2000ml：100g的比例添加无菌水，搅拌均匀后，加热至90℃浸泡提取3h；
3.离心去除剩余的沉淀， 得到山荆子果实浸提液；
4.通过旋转蒸发的方式将山荆子果实浸提液浓缩为400ml，之后加入1600ml无水乙醇，在4℃下醇沉24h，得到山荆子果实粗多糖；
5.将山荆子果实粗多糖使用蒸馏水溶解为1mg/ml的粗多糖溶液，使用sevage法重复8次，去除多糖溶液中的蛋白质，得到山荆子果实多糖溶液；
6.使用10kDa的超滤膜对山荆子果实多糖溶液过滤后，将截留液使用50kDa的超滤膜进行过滤，将得到的过滤液进行冷冻干燥，得到山荆子果实多糖。
实施例2卵母细胞的获取和成熟
1.将收集的猪卵巢放置于35℃的卵巢保存液中转送到实验室中，使用39.5℃的含有青霉素和链霉素的卵巢保存液清洗3次；
2. 使用0.8mm细针头的10ml无菌注射器轻柔抽吸卵巢表面直径1-2mm和3-6mm的健康非闭锁卵泡。
3.抽取的卵泡液放置在预先标记好的15ml离心管中， 37℃水浴静置 15 分钟后去除上清液，留下沉淀，用预温的PBS缓冲液轻柔重悬沉淀，再次离心，重复该步骤2次，以除去卵泡液中的杂质；
3. 在无菌条件下，将洗涤后的沉淀小心移入预先放有适量PBS缓冲液的90mm细胞培养皿中，在显微镜下，收集胞质均匀、包裹有3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）；
4.按照如下成分配置成熟培养基（10ml）：M-199培养基 8.7ml，L-半胱氨酸0.57mM，丙酮酸钠 0.91mM，卡那霉素 75μg/ml，胰岛素 1μg/ml； 表皮生长因子 20ng/ml，猪卵泡液 1ml，促卵泡生成素 0.5μg/ml，黄体生成素0.5μg/ml。
5.将卵丘-卵母细胞复合体置于成熟培养基中（每孔约30个），覆盖矿物油，在5%CO2，38℃饱和湿度培养箱中培养44h进行卵母细胞成熟培养，得到成熟的卵母细胞。
实施例3山荆子果实多糖降低老化卵母细胞的破碎率
1.将成熟的卵母细胞使用1mg/ml透明质酸酶的TL-HEPES（HEPES缓冲Tris溶液）对卵丘细胞进行吹打，去除卵丘细胞的卵母细胞，得到具有第一极体的卵母细胞；
2.对照组为步骤1中获得的具有第一极体的卵母细胞置于96孔板中，每孔约30个并设置3个重复孔，观察卵母细胞的细胞胞质破裂情况，计算胞质破裂率；
2.老化组为将具有第一极体的卵母细胞置于96孔板中，每孔约30个并设置3个重复孔，在成熟培养液中培养48h后，观察卵母细胞的细胞胞质破裂情况，计算胞质破裂率；
3.处理组为将具有第一极体的卵母细胞置于96孔板中，每孔约30个并设置3个重复孔，在含有不同浓度的（0.1mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml）成熟培养液中培养48h后，观察卵母细胞的细胞胞质破裂情况，计算胞质破裂率；
4.将步骤1-3所得到的结果绘制成如图1所示的柱状图。
在图1中，对照组的卵母细胞的破碎率为1.40±0.41，老化组的卵母细胞的破碎率为26.06±1.88，0.1mg/ml处理组的卵母细胞的破碎率为21.83±1.57；0.25mg/ml处理组的卵母细胞的破碎率为18.48±0.80；0.5 mg/ml处理组的卵母细胞的破碎率为14.56±1.17；1 mg/ml处理组的卵母细胞的破碎率为8.78±0.72；2mg/ml处理组的卵母细胞的破碎率为10.63±0.84；
可以看出，老化组的卵母细胞的破碎率显著高于对照组，而相较于老化组，不同浓度的处理组均能够有效的减少卵母细胞的破裂，且具有一定的浓度依赖性，说明使用本发明所制备的山荆子果实多糖处理卵母细胞可以有效的抑制卵母细胞的老化。
同时，可以看出1mg/ml的山荆子果实多糖处理组的卵母细胞破碎率最低，因此本发明选择其为最佳浓度进行后续研究。
实施例4 山荆子果实多糖提高老化卵母细胞的孤雌胚胎发育能力
1.将实施例3中对照组，老化组和1mg/ml山荆子果实多糖处理组的卵母细胞在孤雌激活液中清洗3次；
2.使用1.2kV电脉冲处理3组细胞60us进行细胞激活；
3.将激活后的卵母细胞在含有4mg/ml牛血清白蛋白和7.5g/ml细胞松弛素B的碳酸氢盐缓冲的早期胚胎培养基（IVC）中孵育3h，从而抑制第二极体的排出，设定为第0天；
4.将细胞转移至含有150ul覆盖有石蜡油的IVC培养液的96孔板中培养6天，计算各组细胞的囊胚率并绘制得到图3的柱状图。
在图2中，对照组的囊胚率为42.18±1.79，老化组的囊胚率为13.80±1.44，处理组的囊胚率为31.20±1.32；
可以看出老化组的卵母细胞的囊胚率显著降低，而处理组的囊胚率则相较于老化组明显升高，说明使用山荆子果实多糖处理后，能够有效的抑制卵母细胞的老化来提高卵母细胞的囊胚率，从而提高卵母细胞的胚胎发育能力。
实施例5 山荆子果实多糖抑制老化卵母细胞中的ROS
1.按照活性氧检测试剂盒将DCFH-DA（2',7'-二氯荧光素二乙酰）工作液配置成10μ mol/L，加入少量矿物油覆盖，置于38.5℃平衡30min；
2.将实施例中对照组，老化组和1mg/ml山荆子果实多糖处理组的卵母细胞置于DCFH-DA工作液中，培养箱中避光孵育30min；
3.孵育结束后，在避光环境下使用PBS（磷酸盐缓冲液）+PVA（聚乙烯醇）清洗卵母细胞3次，放置于新的PBS+PVA清洗各组的卵母细胞3次，放置于新的PBS中；
4.置于荧光显微镜下观察并拍照。
从图3中可以看出，与对照组相比，老化模型组的卵母细胞中活性氧(ROS)的水平显著升高，这表明卵母细胞在衰老过程中ROS的生成增加。而在使用山荆子果实多糖进行干预培养后，老化模型组卵母细胞的ROS水平较单独老化模型组明显下降，这说明山荆子果实多糖能够有效抑制衰老卵母细胞中ROS的产生。从而有效的延缓卵母细胞的衰老。
实施例6 获取猪卵巢颗粒细胞
1.将收集的猪卵巢放置于35℃的卵巢保存液中转送到实验室中，使用39.5℃的含有青霉素和链霉素的卵巢保存液清洗3次；
2.在超净工作台中使用1ml无菌注射器吸取卵泡液置于离心管中，1000rpm离心5min；
3.弃去上清，加入预热的PBS轻柔的吹打沉淀，清洗细胞2次；
4.再次离心后，加入完全培养基重悬细胞接种于75ml培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养，得到猪卵巢颗粒细胞。
实施例7山荆子果实多糖促进猪卵巢颗粒细胞的增殖
1.使用胰酶消化猪卵巢颗粒细胞后，加入培养基将细胞制备成细胞悬液；
2.按照每孔2×104个细胞的量，将100ul细胞悬液接种到96孔，十字交叉法混匀细胞后，置于细胞培养箱中培养过夜；
3.去除培养基，对照组添加DMEM完全培养基，处理组添加含有不同浓度的（0.1mg/ml，0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml）山荆子果实多糖的完全DMEM培养基，置于细胞培养箱中继续培养48h，每个处理组设置3个重复孔。
4.每孔中加入10ul CCK-8试剂，孵育3h后，置于酶标仪中，检测450nm吸光度。
在图4中，对照组的吸光度为0.772±0.063，0.1 mg/ml处理组的吸光度为0.874±0.079，0.25 mg/ml处理组的吸光度为0.975±0.091，0.5 mg/ml处理组的吸光度为1.164±0.072，1 mg/ml处理组的吸光度为1.222±0.101，2 mg/ml处理组的吸光度为1.240±0.071。
从图4可以看出，相较于对照组，使用山荆子果实多糖处理后，猪卵巢颗粒细胞的吸光度除0.1mg/ml无统计学意义外，其余处理浓度均显著升高，说明山荆子果实多糖可以有效的促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，因此可以将山荆子果实多糖制备成促进猪卵巢颗粒细胞增殖的药物，从而通过卵巢颗粒细胞有效的减缓体内卵巢细胞的老化。
Claims (9)
1.一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖，其特征在于，所述山荆子果实多糖由如下的制备方法制备得到：
（1）将干燥后的山荆子果实研磨成粉末，得到山荆子果实粉末；
（2）按照无菌水：粉末=20ml：1g的比例添加无菌水，搅拌均匀后，加热至90℃浸泡提取3h；
（3）离心去除剩余的沉淀，得到山荆子果实浸提液；
（4）通过旋转蒸发的方式将所述山荆子果实浸提液浓缩为原体积的20%，之后加入4倍量的无水乙醇，在4℃下醇沉24h，得到山荆子果实粗多糖；
（5）将所述山荆子果实粗多糖使用蒸馏水溶解为1mg/ml的粗多糖溶液，使用sevage法重复8次，去除所述粗多糖溶液中的蛋白质，得到山荆子果实多糖溶液；
（6）使用10kDa的超滤膜对所述山荆子果实多糖溶液过滤后，将截留液使用50kDa的超滤膜进行过滤，将得到的过滤液进行冷冻干燥，得到山荆子果实多糖。
2.如权利要求1所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备延缓哺乳动物卵母细胞老化的药物中的应用。
3.如权利要求1所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备延缓哺乳动物卵母细胞体外培养老化的培养基中的应用。
4.如权利要求1所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备提高哺乳动物卵母细胞胚胎发育能力的培养基中的应用。
5.如权利要求1所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的山荆子果实多糖在制备减少哺乳动物卵母细胞氧化损伤的培养基中的应用。
6.如权利要求1所述的山荆子果实多糖在制备提高哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖能力的药物中应用。
7.一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的成熟培养基，其特征在于，所述成熟培养基包括山荆子果实多糖和基础成熟培养基；所述山荆子果实多糖由权利要求1所述的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的成熟培养基，其特征在于，所述成熟培养基中山荆子果实多糖的浓度为不少于0.1mg/ml。
9.根据权利要求8所述的一种延缓哺乳动物卵母细胞老化的成熟培养基，其特征在于，每10ml所述基础成熟培养基的组成成分为M-199培养基 8.7ml，L-半胱氨酸 0.57mM，丙酮酸钠 0.91mM，卡那霉素 75μg/ml，胰岛素 1 μg/ml； 表皮生长因子 20ng/ml，猪卵泡液1ml，促卵泡生成素 0.5μg/ml，黄体生成素0.5μg/ml。
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| GR01 | Patent grant | ||
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