CN112608887B - 一种精原细胞分离液及其在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用 - Google Patents
一种精原细胞分离液及其在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于鱼类生殖细胞的分离技术领域，具体涉及一种精原细胞分离液及其在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用，为开发一种适用于云斑尖塘鳢精原细胞的分离纯化方法，本发明提供一种精原细胞分离液，该分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液，所述精巢消化液包括L‑15培养基、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I、胰酶、EDTA，所述percoll梯度溶液由perocll稀释液对100％percoll储存液稀释不同倍数后得到，该分离液用于分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞，可以获得高纯度和高活性的云斑尖塘鳢精原细胞，可以在体外增殖和分化。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生殖细胞的分离技术领域，具体涉及一种精原细胞分离液及其在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用。
背景技术
鱼类是重要的生物资源。近年来，因栖息地退化和过度捕捞等原因导致天然水域渔业资源锐减，造成近3000种鱼类处于不同程度的濒危状态。因此，如何对鱼类的种质资源进行长期有效的保护成为了亟待解决的问题。
生殖细胞是唯一能够将遗传物质传递给下一代的细胞，是重要的种质资源，也是种群繁衍的基础。在鱼类胚胎发育早期，生殖细胞特化形成原始生殖细胞(primordialgerm cells，PGCs)。随后，PGCs迁移至生殖嵴，通过增殖、分化形成性原细胞，即精原细胞或卵原细胞，后者通过减数分裂，产生单倍体的配子即精子或卵子。通常，将具有自我更新和分化能力的PGCs、精原细胞和卵原细胞，称之为生殖干细胞。近年来，研究者们通过生殖细胞移植(germcell transplantation)技术，将供体生殖干细胞移植到受体中，待受体成熟后，可产生供体的配子，再经人工授精，获得其后代，俗称“借腹怀胎”技术。因此，收集并保存鱼类生殖干细胞具有重要意义。
PGCs因其数量少，存在的时间较短，难以大批量收集；大多数鱼类维持在卵原细胞阶段的时间很短，会较快进入减数分裂和卵子发生过程；相对而言，许多鱼类在精原细胞阶段维持的时间较长，数量较多。因此，一般通过分离和收集精原细胞的方式进行生殖细胞培养及移植。现阶段，分离纯化鱼类精原细胞的技术，主要有3大类：(1)通过构建生殖细胞转基因鱼品系或者注射荧光标记mRNA瞬时标记生殖细胞，然后酶解消化，通过流式细胞仪分选收集荧光标记的生殖细胞；(2)利用精原细胞特异的表面抗原抗体结合到精原细胞表面，通过磁珠法分离和收集精原细胞；(3)利用精原细胞和体细胞的前散射光与侧散射光的差异，通过流式细胞仪分选精原细胞。这三种技术均有各自的优劣势：方法(1)收集的精原细胞纯度可以超过95％，但是需要以转基因鱼为基础，构建转基因品系的周期非常漫长，而且在经济鱼类中不一定适用，需要依托大型贵重设备-分拣型流式细胞仪(300万元以上)；方法(2)收集的精原细胞纯度也可以超过90％，其分离精原细胞的根本是精原细胞特异表面抗原的抗体，然而大部分鱼类缺乏相关的抗体；方法(3)分离纯化精原细胞的效率不稳定，而且不同物种精原细胞的前散射光与侧散射光特性差异很大，缺乏普遍性，与方法(1)类似，该方法页需要依托大型贵重设备-分拣型流式细胞仪(300万元以上)。因此，开发高效经济的精原细胞分离纯化方法具有重要的经济价值。
云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmorata)，俗称笋壳鱼，其肉质细嫩、味道鲜美且少刺，深受日本、东南亚及港澳台地区消费者的喜爱。近年来，因不同云斑尖塘鳢品种杂交而导致品种混乱以及种质资源的退化。因此，分离和保存云斑尖塘鳢的优良种质资源具有重要意义。然而，采用现有方法分离和纯化云斑尖塘鳢精原细胞，不仅价格昂贵，而且分离纯化的效果不理想。因此，有必要提出一种适用于云斑尖塘鳢精原细胞的分离纯化方法，以获得纯度高、细胞活性强的云斑尖塘鳢精原细胞。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种精原细胞分离液，用于分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞，可以获得高纯度和高活性的云斑尖塘鳢精原细胞，可以在体外增殖和分化。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供一种精原细胞分离液，该分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液；
所述精巢消化液包括L-15培养基、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I、胰酶、EDTA(乙二胺四乙酸)，pH 7.0-7.5；所述精巢消化液是根据云斑尖塘鳢精巢组织的特性配制的，适合云斑尖塘鳢的组织的消化，能够确保取得较好的消化效果的同时，保护精原细胞。
所述percoll梯度溶液由percoll稀释液对100％percoll储存液稀释不同倍数后得到；所述percoll梯度溶液包括8-18％percoll溶液、20-30％percoll溶液和35-45％percoll溶液。所述8-18％percoll溶液、20-30％percoll溶液和35-45％percoll溶液之间的体积比为1:1:1。
所述percoll梯度溶液可以高效分离、纯化以及保护云斑尖塘鳢精原细胞，获得的云斑尖塘鳢精原细胞纯度高、活性好，可以在体外增殖和分化。
本发明针对云斑尖塘鳢精原细胞的特性，优化了酶解消化液的配方与条件以及percoll梯度溶液的配方与离心的条件，配制得到一种适用于云斑尖塘鳢的精原细胞分离液，应用于分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞，可以获得高纯度和具有高活性的云斑尖塘鳢精原细胞，可用于生殖细胞移植和体外培养诱导分化。
优选地，所述精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加1-3mg/mLⅣ型胶原酶，1-3μg/mL DNA酶I，0.20％-0.30％胰酶，0.01-0.03g/L EDTA，pH7.0-7.5。进一步地，精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加2mg/mLⅣ型胶原酶，2μg/mL DNA酶I，0.25％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.2，0.22μm滤膜过滤除菌。
优选地，所述percoll梯度溶液包括15％percoll溶液、25％percoll溶液和40％percoll溶液。
优选地，所述percoll稀释液由PBS溶液(磷酸盐缓冲液)和Cortland溶液按1:1的体积比混合而成。
优选地，所述PBS溶液包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾。进一步地，所述PBS溶液的配制方法为：0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾，溶于1L纯水，调pH至7.4，0.22μm滤器过滤除菌。
优选地，所述Cortland溶液包括氯化钠、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、氯化钾、二水氯化钙、D-葡萄糖、七水硫酸镁。进一步地，所述Cortland溶液的配制方法为：900mL去离子水中加入7.66g氯化钠、0.51g磷酸二氢钠、1.16g碳酸氢钠、0.38g氯化钾、0.31g二水氯化钙、1.00g D-葡萄糖、0.26g七水硫酸镁，调pH至7.4，溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。
优选地，所述100％percoll储存液的配置方法为：将9体积percoll原液与1体积10×PBS充分混匀，即制成100％percoll储存液。
本发明还提供了上述的精原细胞分离液在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用。
本发明还提供了一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，包括以下步骤：
S1、取云斑尖塘鳢雄鱼，将精巢取出，经消毒、清洗和剪碎后置于上述的精原细胞分离液的精巢消化液中进行消化，消化后获得精巢单细胞悬液；
S2、将步骤S1的精巢单细胞悬液置于上述的精原细胞分离液的percoll梯度溶液中，经低速离心分离后收集得到云斑尖塘鳢精原细胞。
优选地，所述云斑尖塘鳢雄鱼为2-3月龄的云斑尖塘鳢。
优选地，步骤S1的消化为36℃-38℃下以100-300转/分钟的转速消化50-70分钟。
优选地，在消化过程中，每间隔10分钟吹打重悬一次。
优选地，步骤S2的低速离心为以1000-2000转/分钟的转速(加速度1-9，减速度1-9)室温离心10-20分钟。该低速离心可以高效分离、纯化以及保护云斑尖塘鳢精原细胞。
优选地，步骤S1所述精巢剪碎至1mm3左右，精巢消化液的用量为1mL精巢消化液/精巢碎块。
优选地，步骤S2所述精巢单细胞悬液与精巢单细胞悬液的体积比为1：(2-4)。进一步地，精巢单细胞悬液与精巢单细胞悬液的体积比为1：3。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种精原细胞分离液，该分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液，所述精巢消化液包括L-15培养基、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I、胰酶、EDTA，所述percoll梯度溶液由percoll稀释液对100％percoll储存液稀释不同倍数后得到。该分离液用于分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞，可以获得高纯度和高活性的云斑尖塘鳢精原细胞，可以在体外增殖和分化。与现有技术相比，本发明的精原细胞分离液用于分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞具简捷性和高效性的优势：(1)无需大型贵重设备，如分拣型流式细胞仪等；(2)无需构建转基因标记品系；(3)无需生殖细胞特异表面抗原的抗体；(4)所用试剂(包括胶原酶、DNA酶I、胰酶、percoll溶液等)和设备均为常见试剂和设备。此外，采用本发明的精原细胞分离液分离纯化得到的云斑尖塘鳢精原细胞的鉴定结果表明，分离纯化得到的精原细胞的比例高达81.5％。进一步的体外培养实验证明，分离纯化得到的精原细胞活力良好，具有较好的增殖和分化能力。
附图说明
图1为3月龄云斑尖塘鳢幼鱼的精巢结构；
图1中，A，E为幼鱼精巢组织的伊红-苏木精染色(HE染色)，E为A中方框的放大图片；F,G,H分别为B,C,D中方框的放大图片；B，D，F，H为Vasa和PCNA双色免疫荧光图片，其中B,F的绿色为Vasa抗体信号，D,H为叠加图片，其中蓝色为DAPI染色信号；C,G的红色为PCNA信号；标尺：A,20μm；B,C,D，50μm；E,F,G,H，10μm。
图2为3月龄云斑尖塘鳢幼鱼精巢酶解消化后的细胞图片；
图2中，A为精巢消化液消化后的云斑尖塘鳢精巢单细胞；B为A放大后的图片；C,D,E为云斑尖塘鳢精巢单细胞的Vasa抗体免疫荧光检测结构，其中C中的绿色圆形信号为精原细胞(即germ cell，GC)，绿色椭圆形为非特异的血细胞信号(即blood cell，BC)，D为明场图片，E为叠加图片，其中红色为DAPI染色细胞核；F为流式细胞仪统计精原细胞的比例，方框区域为Vasa抗体阳性细胞(即精原细胞)。标尺：A，50μm；B,C,D,E，10μm。
图3为percoll梯度溶液分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的图片：
图3中，A为云斑尖塘鳢精巢细胞在percoll梯度溶液中离心后的图片；B,C,D为percoll溶液中细胞的图片；其中B为15％和25％percoll溶液交界处的细胞，C为25％percoll和40％percoll交界处的细胞，D为40％percoll溶液底部的细胞。箭头所指为交界处的细胞，标尺，B,C,D，10μm。
图4为percoll梯度溶液分离纯化的云斑尖塘鳢精巢细胞的Vasa抗体免疫荧光检测结果；
图4中，A中的绿色为Vasa抗体信号；B为明场图片；C为叠加的图片，其中红色为DAPI染色细胞核；D,E为流式细胞仪统计精原细胞的比例，D中的方框区域为Vasa抗体阳性细胞的比例，E为对应细胞分布的峰图。标尺：A,B,C，10μm。
图5为percoll分离纯化后的云斑尖塘鳢精原细胞在3D培养系统中的诱导情况。
图5中，A,B,C,D,E,F为3D培养系统中诱导不同时间的云斑尖塘鳢精原细胞的典型图片，D1指3D培养诱导1天，D5-D40依此类推，F为体外诱导培养40天后得到的精子。标尺：A，200μm；B,C,D,E，100μm；F，5μm。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加2mg/mLⅣ型胶原酶，2μg/mL DNA酶I，0.25％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.2，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll储存液按比例混合得到；percoll梯度溶液包括15％percoll溶液、25％percoll溶液和40％percoll溶液。
上述方案中涉及的percoll稀释液的配置方法如下：
1)磷酸盐缓冲液(PBS)：0.24g磷酸二氢钾、1.44g磷酸氢二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾，溶于1L纯水，调pH至7.4，0.22μm滤器过滤除菌。
2)Cortland溶液的配制：900mL去离子水中加入7.66g氯化钠、0.51g磷酸二氢钠、1.16g碳酸氢钠、0.38g氯化钾、0.31g二水氯化钙、1.00g D-葡萄糖、0.26g七水硫酸镁，调pH至7.4，溶解后定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。
3)将PBS溶液和Cortland溶液按照1:1的体积比混合，制成percoll稀释液。
上述方案中涉及的100％percoll储存液的配置方法如下：
将9体积percoll原液(GE公司)与1体积10×PBS充分混匀，即制成100％percoll储存液。
实施例2一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加1mg/mLⅣ型胶原酶，1μg/mL DNA酶I，0.20％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.0，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll溶液按比例混合得到；
percoll梯度溶液包括8％percoll溶液，20％percoll溶液，35％percoll溶液。
实施例3一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加3mg/mLⅣ型胶原酶，3μg/mL DNA酶I，0.30％胰酶，0.03g/L EDTA，pH 7.5，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll溶液按比例混合得到：
percoll梯度溶液包括18％percoll溶液，30％percoll溶液，45％percoll溶液。
对比例1一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加2mg/mLⅣ型胶原酶，0.25％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.2，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll溶液按比例混合得到；percoll梯度溶液包括15％percoll溶液、25％percoll溶液和40％percoll溶液。
对比例2一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加2mg/mLⅣ型胶原酶，2μg/mL DNA酶I，0.25％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.2，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll溶液按比例混合得到；percoll梯度溶液包括15％percoll溶液、25％percoll溶液和50％percoll溶液。对比例3一种精原细胞分离液
该精原细胞分离液包括精巢消化液和percoll梯度溶液。
精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加2mg/mLⅣ型胶原酶，2μg/mL DNA酶I，0.25％胰酶，0.02g/L EDTA，pH 7.2，0.22μm滤膜过滤除菌。
percoll梯度溶液由percoll稀释液与100％percoll溶液按比例混合得到；percoll梯度溶液包括5％percoll溶液、18％percoll溶液和40％percoll溶液。
实施例4精原细胞分离液在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用
本实施例中，泰国云斑尖塘鳢来自广东省珠海市香柏农场；消毒液为75％乙醇；精原细胞诱导培养基见表1；署红Y(往曙红Y母液中加水配制成0.4mg/mL浓度的溶液，0.22μm滤器过滤除菌)，台盼蓝(配制质量体积分数为0.4％的台盼蓝溶液，0.22μm滤器过滤除菌)；Vasa和PCNA抗体购自于Abcam公司；细胞培养所需的培养基，非必需氨基酸等，均来自于Invitrogen。
表1精原细胞诱导培养基配方
| 成分 | 终浓度 |
| DMEM基础培养基 | 13.37g/L |
| HEPES | 4.76g/L |
| 非必需氨基酸 | 1× |
| 青霉素和链霉素 | 1× |
| 亚硒酸钠 | 2nm |
| β巯基乙醇 | 100μm |
| FBS | 15％(v/v) |
| 人bFGF | 0.1μg/mL |
| 丙酮酸纳 | 1mM |
| L-谷氨酰胺 | 2mM |
| 鲈鱼血清 | 0.2％(v/v) |
| 睾酮 | 100ng/mL |
| DHP | 50ng/mL |
1、云斑尖塘鳢幼鱼精巢结构的分析：
选取3月龄的云斑尖塘鳢，解剖取出精巢，在4％多聚甲醛中4℃固定过夜。然后对固定后的精巢组织进行石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色(HE染色)，镜检观察组织结构。同时对其进行冰冻切片免疫荧光检测，免疫荧光的包括以下步骤：
(1)将云斑尖塘鳢幼鱼精巢在冰冻组织切片包埋剂(Tissue-Tek，SAKURA)中平衡10分钟，然后在液氮中速冻包埋；
(2)包埋后进行冰冻组织切片，切片厚度为10μm；
(3)将切片置于37℃下烤片30分钟；
(4)烤片的切片用PBS复水一次，4％多聚甲醛室温固定10分钟，再用PBS清洗3次去掉残余的多聚甲醛，最后将切片置于5％脱脂牛奶中室温封闭1小时；
(5)将Vasa和PCNA(增殖细胞核抗原)抗体按1:400的比例稀释到1％脱脂牛奶溶液中，4℃一抗结合过夜；
(6)第二天，用含0.1％Tween-20的PBS溶液10分钟清洗3次，再用PBS溶液10分钟清洗3次；
(7)清洗后，用含2％羊血清的PBS溶液室温封闭40分钟；
(8)封闭后进行荧光二抗显色和细胞核复染显色：首先将荧光二抗[羊抗兔IgG(H+L)Alex488，羊抗鼠IgG(H+L)Alex 555]按照1:400的比例稀释，DAPI按照1:1000的比例稀释至含2％羊血清的PBS溶液中，然后避光室温显色60分钟；
(9)显色后用PBS溶液10分钟清洗4次；
(10)清洗后用抗荧光淬灭机封片，镜检和拍照。
苏木精-伊红染色结果显示，3月龄云斑尖塘鳢精巢呈现棒状结构，没有典型的精小管结构(图1A,E)。其中有一些苏木精染核着色较浅的细胞具备典型的精原细胞特征：核质界限清晰、细胞核大而圆、有1-2个核仁(图1A,E)。同时，3月龄云斑尖塘鳢精巢中生殖细胞的特异标记Vasa和增殖特异标记PCNA的表达检测显示，3月龄云斑尖塘鳢幼鱼精巢有Vasa强阳性的生殖细胞也表达PCNA(19.18％，2174/11336，N＝10)，证明这些生殖细胞具有增殖能力，为精原细胞(图1B,C,D,F,G,H)。因此，3月龄云斑尖塘鳢幼鱼精巢可作为较好的精原细胞分离对象。
2、云斑尖塘鳢幼鱼精巢单细胞悬液制备：
(1)取3月龄的云斑尖塘鳢雄鱼，解剖、分离精巢置于无菌PBS中；
(2)用无菌PBS清洗以去除粘附在精巢上的血块和脂肪等杂质；
(3)将清洗后的精巢在消毒液(75％乙醇)中浸泡消毒30秒，然后用无菌PBS清洗2次去除残留的消毒液；
(4)利用眼科剪刀将精巢剪碎成约1mm3大小的碎块，然后加入实施例1中配制好的精巢消化液(1mL/块)，轻轻吹打重悬，在37℃摇床中(200转/分钟)消化60分钟，在消化过程中，每间隔10分钟吹打重悬一次；
(5)将消化后的精巢细胞室温静置2分钟，经70μm滤膜过滤后获得单细胞悬液；
(6)将收集到的精巢单细胞悬液进行镜检、拍照，Vasa抗体免疫荧光染色和流式细胞仪分析。
本实施例一共解剖20尾3月龄云斑尖塘鳢雄鱼收集精巢组织，然后通过上述酶解消化方法获得单细胞悬液。镜检结果表明，3月龄云斑尖塘鳢精巢单细胞悬液中包括各种形态的细胞(图2A)，这些细胞包括血细胞、各种形态的体细胞和精原细胞(图2B)；通过免疫荧光检测Vasa的表达，证明获得的单细胞悬液中确实存在精原细胞(图2C-E)，流式细胞仪分析精原细胞占总细胞的16.97％(图2F)。
3、percoll梯度溶液分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞：
(1)在实施例1中配制好的15％和40％percoll溶液中分别滴入台盼蓝(终浓度0.01％)和署红Y(终浓度0.01mg/mL)作为指示剂，依次将2mL 15％、25％、40％percoll溶液从底部加入到15mL管中，制备成percoll梯度离心工作液(图2A所示)；
(2)将2mL步骤2制备的云斑尖塘鳢精巢单细胞悬液小心加入到6mL percoll梯度离心工作液的最上层，然后置于水平离心机(eppendorf，5910R)中以1500转/分钟的转速(加速度2，减速度4)室温离心15分钟；
(3)收集和检测不同浓度percoll溶液中的细胞，结果显示，25％和40％percoll溶液交界处有大量精原细胞；
(4)用10倍体积的PBS溶液将收集到的25％percoll细胞稀释，以1500转/分钟的转速(加速度2，减速度4)室温离心15分钟，弃上清，用无菌PBS溶液重悬精原细胞；
(5)镜检、拍照，免疫荧光检测分离细胞中的Vasa表达，流式细胞仪分析。
将上述制备的精巢单细胞悬液添加到制备好的percoll梯度溶液中，按照上述方法进行低速离心，离心后，在不同浓度的percoll交界处有模糊的细胞层(图3A)，将不同浓度percoll溶液中的细胞进行收集和观察，结果如图3所示，在15％和25％percoll交界处中，以血细胞、体细胞和少量细胞碎片为主(图3B)；在最下层的40％percoll溶液中，存在一些未完全消化的细胞团和细胞碎片(图3C)；在25％percoll和40％percoll溶液交界处，有较多的精原细胞(图3D)。
同时，通过免疫荧光检测Vasa的表达，对percoll梯度溶液分离的云斑尖塘鳢精原细胞进行鉴定。结果表明，percoll梯度溶液分离的细胞中确实有许多Vasa阳性的精原细胞(图4A-C)；流式分析结果表明，percoll梯度溶液分离的云斑尖塘鳢细胞中精原细胞的比例高达81.50％，这与精巢组织中精原细胞的比例(18.97％)以及percoll梯度溶液分离前的单细胞悬液中精原细胞的比例(16.97％)相比，精原细胞的比例有显著的提升。
4、percoll梯度溶液分离纯化的精原细胞体外培养和诱导
为检测分离纯化得到的云斑尖塘鳢精原细胞是否能够在体外增殖和分化产生精子，进行了精原细胞体外培养和诱导：
(1)将分离的精原细胞在添加了精原细胞诱导培养基的3D嵌入式培养皿(Costar3496)进行3D进行连续培养；
(2)观察云斑尖塘鳢精原细胞在培养和诱导不同时间后的变化。
将上述分离得到的云斑尖塘鳢精原细胞置于3D培养系统的精原细胞诱导培养基中培养(图5A)。结果显示，在诱导培养5天后，一些精原细胞聚集形成100μm左右的细胞团(图5B)，随着诱导培养时间的延长，精原细胞团逐渐变大，其直径由100μm增长到500μm(图5C-F)，并且细胞团也变得更加致密。这是生殖细胞体外增殖的显著特征。在体外诱导培养40天后，在培养基的上清中，检测到成熟的精子。可见，采用本发明的精原细胞分离液分离纯化得到的精原细胞具有较好的体外增殖和分化能力。
此外，采用实施例2-3和对比例1-3的精原细胞分离液按照实施例4的方法从3月龄的云斑尖塘鳢雄鱼中分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞，流式分析结果显示，采用实施例2-3和对比例1-3的精原细胞分离液分离纯化得到的云斑尖塘鳢细胞中精原细胞的比例分别为：65.75％、74.67％、59.32％、47.34％和47.73％。同时，体外诱导培养发现，采用实施例2-3和对比例1-3的精原细胞分离液分离纯化得到的云斑尖塘鳢精原细胞的体外增殖和分化能力均要弱于实施例1的精原细胞分离液分离纯化得到的云斑尖塘鳢精原细胞，其体外增殖和分化能力从大到小依次为：实施例1＞实施例3＞实施例2＞对比例3＞对比例1＞对比例2。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种精原细胞分离液，其特征在于，包括精巢消化液和percoll梯度溶液；
所述精巢消化液包括以下质量浓度的成分：以L-15培养基作为基础溶液，添加1-3mg/mLⅣ型胶原酶，1-3μg/mL DNA酶I，0.20％-0.30％胰酶，0.01-0.03g/L EDTA，pH 7.0-7.5；
所述percoll梯度溶液由percoll稀释液对100％percoll储存液稀释不同倍数后得到；
所述percoll梯度溶液包括8-18％percoll溶液、20-30％percoll溶液和35-45％percoll溶液。
2.根据权利要求1所述的一种精原细胞分离液，其特征在于，所述percoll梯度溶液包括15％percoll溶液、25％percoll溶液和40％percoll溶液。
3.根据权利要求1所述的一种精原细胞分离液，其特征在于，所述percoll稀释液由PBS溶液和Cortland溶液按1:1的体积比混合而成。
4.权利要求1-3任一项所述的一种精原细胞分离液在分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞中的应用。
5.一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取云斑尖塘鳢雄鱼，将精巢取出，经消毒、清洗和剪碎后置于权利要求1-3任一项所述的精原细胞分离液的精巢消化液中进行消化，消化后获得精巢单细胞悬液；
S2、将步骤S1的精巢单细胞悬液置于权利要求1-3任一项所述的精原细胞分离液的percoll梯度溶液中，经低速离心分离后收集得到云斑尖塘鳢精原细胞。
6.根据权利要求5所述的一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，其特征在于，所述云斑尖塘鳢雄鱼为2-3月龄的云斑尖塘鳢。
7.根据权利要求5所述的一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，其特征在于，步骤S1的消化为36℃-38℃下以100-300转/分钟的转速消化50-70分钟。
8.根据权利要求7所述的一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，其特征在于，在消化过程中，每间隔10分钟吹打重悬一次。
9.根据权利要求5所述的一种分离纯化云斑尖塘鳢精原细胞的方法，其特征在于，步骤S2的低速离心为以1000-2000转/分钟的转速室温离心10-20分钟。
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