CN113197132B - 一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法 - Google Patents

一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鱼类遗传育种领域，特别涉及一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。该方法包括如下步骤：将精子和卵子混合，进行人工受精；受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。本发明制备人工诱导三倍体石斑鱼的方法实现了石斑鱼冷休克诱导石斑鱼卵子，可培育出人工三倍体鱼苗，可实现获取多倍体鱼苗，提高了多倍体育苗效率。本技术操作方便、高效实用。

Description

一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法
技术领域
本发明涉及鱼类遗传育种领域，特别涉及一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。
背景技术
通过远缘杂交产生多倍体是生物界普遍存在的现象。杂交产生多倍体不仅可能拥有杂种优势，而且不育的多倍体与它的双亲和普通的杂交子代比较，在体型、抗病、抗逆性、成活力、生存力等方面表现出更大的优势。从细胞遗传学角度来看，三倍体为非偶数染色体组，故阻碍了生殖细胞正常的减数分裂，结果常常导致性腺不能发育。在杂交三倍体中，即杂交受精卵通过三倍体诱导技术处理而培育出的三倍体，其不育性更高于普通三倍体。不育的三倍体经济鱼类因为没有性成熟阶段性腺发育的能量损耗，所以避免了性腺发育阶段的生长停滞和死亡率增加，且能量从配子生产转移到体细胞生长中，使得三倍体个体具有更快的生长速度，在生长能力方面具有潜在益处。目前已知的培育出的技术成熟的有三倍体鲤，它生长速度超过普通二倍体野鲤25％～30％，三倍体鲫鱼比二倍体生长速度快1～1.5倍。
石斑鱼(Epinephelus)具有富含营养、肉质鲜美、低脂肪、高蛋白等特点，具有很高的营养价值和经济价值，是我国沿海地区和东南亚重要的养殖鱼类之一。杂交三倍体具有巨大的市场潜力和商业价值，能够大大加快产品上市时间且得到质量更高的个体。
公开号为CN 103004653 A的中国发明专利公开了一种三倍体石斑鱼的制备方法，挑选遗传距离为0.140-0.145亲缘关系的不同种石斑鱼作为亲鱼，采用干法人工授精进行远缘杂交，卵子受精后转移到海水中进行冷体克处理，育苗经起捕、暂养后，进行三倍体鉴定。其中，卵子受精后转移到海水中进行冷休克处理，冷休克处理时的温度为4℃，冷休克处理时间为20～25min。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。通过该方法实现获得三倍体石斑鱼群体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，包括如下步骤：
将精子和卵子混合，进行人工受精；
受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。
作为优选，精子与卵子的体积比为1：(50～150)。
在本发明提供的具体实施例中，精子与卵子的体积比为1：100。
作为优选，人工授精的方法为干法授精或湿法授精。
作为优选，受精5min后，对受精卵进行冷休克处理。
作为优选，冷休克处理的温度为1～9℃，时间为12.5～20min。
优选地，冷休克处理的温度为1～9℃，时间为17.5～20min。
更优选地，冷休克处理的温度为1～3℃或7～9℃，时间为20min。
更优选地，冷休克处理的温度为4～6℃，时间为17.5min。
在本发明中，精子为鞍带石斑鱼的精子。但本发明并非限定于此，其它种类的石斑鱼同样可实现本发明的技术效果。
在本发明中，卵子为棕点石斑鱼的卵子。但本发明并非限定于此，其它种类的石斑鱼同样可实现本发明的技术效果。
本发明提供了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法。该方法包括如下步骤：将精子和卵子混合，进行人工受精；受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；冷休克处理的温度为0～10℃，时间为10～20min。本发明具有的技术效果为：
本发明制备人工诱导三倍体石斑鱼的方法实现了石斑鱼冷休克诱导石斑鱼卵子，可培育出人工三倍体鱼苗，可实现获取多倍体鱼苗，提高了多倍体育苗效率。本技术操作方便、高效实用。在石斑鱼生产和多倍体选育优良品种上具有重大应用价值和广阔的推广应用前景。
本发明采用的父本鞍带石斑鱼具有产精量大，生长速度快的优势，母本棕点石斑鱼具有繁殖能力强，成活率高，耐高温的优点。
附图说明
图1为流式细胞仪二倍体和三倍体的倍性结果，A为二倍体，B为三倍体；
图2为染色体核型图片。
具体实施方式
本发明公开了一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明获取人工诱导三倍体石斑鱼的方法，包括如下步骤：
1、人工诱导石斑鱼三倍体
(1)、石斑鱼亲本的选择以及精、卵子的采集
a、父本的选择和精子的采集：选择无伤病、体型正常、体格健壮，体重为60～80kg/尾的鞍带石斑鱼雄性成鱼为父本，置于室外土塘或室内水泥池进行培育，投喂冰鲜杂鱼、鱿鱼和螃蟹进行培育；待海水平均温度稳定在28～32℃时，采用麻醉剂将其麻醉后捞出水面置于帆布担架内，用干布将泄殖孔及周围海水擦干，用手按压性腺，看到有精液流出立刻对其进行收集；得到鞍带石斑鱼鲜精后，置于0～4℃冷藏保存，避免接触海水防止精子激活。
b、母本的选择和卵子的采集：选择腹部膨胀，体表无伤的棕点石斑鱼雌性成鱼为母本，置于室外土塘或室内水泥池培育，投喂冰鲜杂鱼和鱿鱼进行培育；在繁殖期，选择腹部饱满有弹性，两侧有明显的充盈感，生殖孔外凸的雌鱼个体，将其置于帆布担架内，用干布将泄殖孔及周围海水擦干，用手按压腹部，干净干燥的烧杯收集卵子，得到棕点石斑鱼卵子后，避免接触海水，尽快与精子进行人工受精。时间不超过30分钟。
c、人工授精的方法：按照1mL精子授精100mL卵子的比例进行精卵人工混合，可使用干法授精和湿法授精。干法授精为：将精子：TS-19精子稀释液＝1：19的比例稀释精液，将稀释精液与卵子干法混合拌匀后，加入与卵子量等体积新鲜海水以激活精子，搅匀10s后，定为受精零时，混合后加入洁净自然海水搅拌30s，完成人工授精。湿法授精为：按精卵受精比例，将精子用移液枪/吸管/针筒等打进与卵等体积海水中，迅速搅散10s后倒入卵子迅速搅匀，设为受精零时，混合后加入洁净自然海水，温度为26-28℃，搅拌30s，完成人工授精。
(2)授精时间、染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选及批量冷休克诱导石斑鱼卵子：
使用制冷剂或者制冷设备(如冰柜、冻库)提前准备调好盐度的冷冻海水，于人工授精前调配温度备用；人工干法授精，设置的六个时间梯度分别为3min、4min、5min、6min、7min和8min，用海水冲洗受精卵除去多余的精子后立即转入装有预冷海水的冷休克处理箱中，在1-3℃，4-6℃，7-9℃三个温度梯度每个梯度分别低温休克处理10、12.5、15、17.5、20min；最后统计受精率、畸形率、孵化率，用Sysmex/CyFlowPloidy Analyser倍性分析仪检测胚胎和鱼苗的倍性，结果表明在受精后4min、5min、6min、7min，4℃冷休克15min，受精后5min，1-3℃冷休克12.5min、15min、17.5min、20min；4-6℃冷休克15min、17.5min、20min以及7-9℃冷休克12.5min、15min、17.5min、20min均有三倍体幼苗出现。其中在受精后5min，1-3℃冷休克20min，4-6℃冷休克17.5min，7-9℃冷休克20min三倍体率最高。
2、三倍体鱼苗的快速鉴定方法
(1)倍性仪检测方法
在原肠早期，收集各组的受精卵，每次取2枚胚胎或2尾初孵幼鱼，1％的胰酶预处理3min，胶头滴管吸取受精卵，置于载玻片上压碎卵以分散细胞，加入400ul的提取缓冲液裂解1-2min，用50μm的滤膜过滤样品，加入1600μLDAPI染液染色1-2min后使用Sysmex/CyFlowPloidy Analyser倍性分析仪检测，该过程仅需2-3min；以正常杂交组为二倍体对照，各实验组随机检测样品，统计三倍体率及二倍体率(见下表)
流式细胞仪检测型号为Sysmex/CyFlowPloidy Analyser倍性分析仪、条件为Gains：582.0V，Thresholds：0.16542V，Flow：0.4μl/sec，Lights：UV LED，以正常杂交组为二倍体对照，各实验组随机检测样品，统计三倍体率及二倍体率。每次取2枚胚胎或2尾初孵幼鱼进行检测理由，当2枚胚胎或2尾初孵仔鱼为二倍体时，仅出现二倍体峰；当2枚胚胎或2尾初孵仔鱼为三倍体时，仅出现三倍体峰；当1枚胚胎或1尾初孵仔鱼为二倍体时，另1枚胚胎或1尾初孵仔鱼为三倍体时，则出现二倍体峰和三倍体峰。
表1各组三倍体率、二倍体率
Figure BDA0003126577380000051
注：“√”表示一次性检测卵数>3个，峰图显示为二倍体或三倍体，无比例。
正常石斑鱼杂交组和三倍体各组的受精率基本上都在80％以上，但是受到各个时期卵质量的不同，正常杂交组的孵化率有着明显差异。三倍体因为多了一组染色体，受精率虽与对照组无明显差别，但孵化时却有较高的畸形率，所以整体孵化率不足10％。
图1为流式细胞仪二倍体和三倍体的倍性结果，图A为二倍体，图B为三倍体，三倍体和二倍体的峰值比为24223：16063＝1.51，变异系数(CV)均小于5。
(2)染色体分析鉴定多倍体石斑鱼鱼卵
1).收集细胞
15mL管收集原肠胚早期之前的胚胎数十枚，海水15mL+10mL 2ug/mL秋水仙素处理1.5小时；用玻片将卵压碎，换入生理盐水，之后用长嘴玻璃吸管吸打分散细胞，制备成细胞悬液；静止沉淀2-3min后，用过滤柱(流仪)将大的碎片过滤处理。
2).低渗处理
1000rpm收集细胞，弃上层细胞碎片；加入低渗溶液(0.0375M KCl)，重悬细胞，低渗45min；1000rpm重新收集细胞，弃上层溶液和细胞碎片，管底留1mL的低渗液，并用吸管轻轻吸打重悬细胞；加入预冷的固定液5mL(甲醇：乙酸3:1)，室温预固定20min。
3).固定细胞(均用预冷的固定液)
离心去上清，再往细胞沉淀里加5mL固定液，轻轻重悬，室温静置20min，再离心收集细胞，再重复固定20min；然后离心收集细胞，再往里面加5mL预冷的固定液然后再离心收集细胞，最后去上清时根据细胞沉淀量留1mL固定液，重悬细胞，4℃暂存。
4).制片
细胞固定液从冰箱拿出，然后将预冷的玻片(-20℃)从冰箱拿出镊子夹好，点好酒精灯。看准玻片，60cm高度滴2滴细胞固定液到冷冻玻片上。然后立即用酒精灯烤片，火熄灭后玻片置于试验台上吉姆萨染色。染色结束后置于4℃冰箱中暂存(可放48小时)。
5).观察
观察染色体核型图片，10倍显微镜找分裂相视野，40倍找合适分裂相，100倍油镜拍照。
由图2可知，采用常规染色体制片方法，对多倍体石斑鱼鱼卵进行染色体分析，发现多倍体石斑鱼鱼卵的染色体数为72条，与普通杂交石斑鱼的染色体数目比为1.5：1，证明这些鱼卵为三倍体石斑鱼。
对比例1
在实施例1基础上，参照CN 103004653 A发明中冷休克处理方法诱导三倍体：受精后3min，4-6℃，冷休克处理20min。
该对照组受精率为98.12％，孵化率为15.17％，经流式细胞仪检测，初孵仔鱼的三倍体率为0，二倍体率为100％。该对照组无法诱导出多倍体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种人工诱导石斑鱼三倍体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将鞍带石斑鱼精子和棕点石斑鱼卵子混合，进行人工受精；
受精4.5～5.5min后，将受精卵置于预冷的海水中进行冷休克处理；所述冷休克处理的温度为1～3℃、4～6℃或7～9℃，时间为17.5～20min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精子与所述卵子的体积比为1：(50～150)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工授精的方法为干法授精或湿法授精。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，受精5min后，对受精卵进行冷休克处理。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷休克处理的温度为1～3℃或7～9℃，时间为20min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷休克处理的温度为4～6℃，时间为17.5min。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102257972A (zh) * 2010-05-29 2011-11-30 海南大学 鞍带石斑鱼工厂化育苗方法
CN103589801A (zh) * 2013-11-20 2014-02-19 湖南师范大学 可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的dna分子标记方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7194978B2 (en) * 2003-08-22 2007-03-27 University Of Maryland Biotechnology Institute Inducing sterility in fish by disrupting the development of the GnRH system
CN1763180A (zh) * 2004-10-22 2006-04-26 中国科学院海洋研究所 不同种类对虾三倍体的制备方法
US20100037330A1 (en) * 2008-06-11 2010-02-11 Kannika Siripattarapravat Efficient Somatic Cell Nuclear Transfer In Fish
WO2010059598A1 (en) * 2008-11-18 2010-05-27 LiveFuels, Inc. Methods for producing fish with high lipid content
CN101926300A (zh) * 2010-08-27 2010-12-29 中山大学 一种石斑鱼雌核发育二倍体的诱导方法
CN102106292B (zh) * 2011-02-10 2012-02-29 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法
CN103004653B (zh) * 2012-11-22 2015-04-08 中山大学 一种三倍体石斑鱼的制备方法
CN103493758A (zh) * 2013-09-11 2014-01-08 海南大学 人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102257972A (zh) * 2010-05-29 2011-11-30 海南大学 鞍带石斑鱼工厂化育苗方法
CN103589801A (zh) * 2013-11-20 2014-02-19 湖南师范大学 可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的dna分子标记方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of triploid hybrid groupers from interspecies hybridization (Epinephelus coioides ♀ × Epinephelus lanceolatus;Huang Wen等;《Aquaculture Research》;20161231;第47卷(第7期);第2195-2204页 *
点带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究;王小刚等;《海洋科学》;20140930;第38卷(第9期);第13-19页 *
鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)♂×斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)♀杂交子一代青龙斑血液学及血液生理生化特性的比较研究;舒琥等;《海洋与湖沼》;20150430;第46卷(第2期);第396-402页 *

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