CN103493758A - 人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法 - Google Patents

人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法 Download PDF

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骆剑
陈国华
吴廷昌
黄飞
佘长宁
陈猛
樊佳伟
王珺
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Abstract

本发明公开了一种人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法，以遗传灭活的异源精子为刺激源，刺激斜带石斑鱼成熟卵子，激活后使用冷水休克实现二倍化，制备过程中使用倍性分析技术对获得的胚胎或幼苗进行检测，实现质量控制。通过本发明的方法，能够制备得到减数分裂抑制型的雌核发育石斑鱼。

Description

人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法
技术领域
本发明属于鱼类遗传育种领域，是一种海水鱼类的培养方法及其应用，具体涉及使用异源精子诱导石斑鱼产生雌核发育的培育和质量控制方法及应用。
背景技术
人工诱导鱼类雌核发育技术是20世纪50年代在天然雌核发育鱼类发现的基础上发展起来的技术，该技术利用遗传灭活的精子刺激卵子，并依赖雌配子发育成个体。由于雌核发育导致基因纯合，在快速制备鱼类纯系等方面具有良好的应用价值。
淡水鱼类的雌核发育开展的应用工作较多，而海水鱼类国内外学者仅对大菱鲆、真鲷、大黄鱼等十余种鱼类开展了雌核发育的应用，热带海水鱼类在这方面的研究与应用很少。石斑鱼(Epinephalus)，属于世界性名贵暖水性礁栖鱼类，在我国南方形成了大规模的养殖产业。石斑鱼养殖产业面临着育苗成活率低、病害严重、个体大小参差不齐等亟待解决的问题，石斑鱼优良品种的缺乏已经成为制约产业稳定持续发展的瓶颈因素。
选育出优良纯系或品系是石斑鱼良种培育的必由之路。作为一种先雌后雄的性反转大型鱼类，石斑鱼性成熟时间长，个体发育为成熟雌性的时间长达3-5年，家系育种等手段耗时非常长，而1代雌核发育产生相当于7-8代自交选育的纯合效果，能够大大缩短品系选育的周期，因此采用雌核发育技术手段将显著提高石斑鱼良种培育效率。
发明内容
本发明要解决的问题是确定合适精子刺激源，并对人工诱导获得的个体进行鉴定，实现批量高效制备雌核发育石斑鱼纯系群体。
为解决上述技术问题，本发明提出的方案为一种人工培育石斑鱼雌核发育鱼苗的方法，该方法包括如下步骤：
(1)雄鱼的选择和精子的采集：
选择体格健壮体表无伤的鞍带石斑鱼雄性成鱼为亲本(5-7龄)，体重60-80kg／尾，置于海上网箱或陆地池塘进行培育，投喂冰鲜杂鱼和鱿鱼进行培育；待海水平均温度稳定在28-32℃时，根据斜带石斑鱼排卵规律，提前1-2日给鞍带石斑鱼雄鱼注射HCG(200U／kg)，20-28小时后将雄鱼置于封闭网箱中，采用麻醉剂将其麻醉后捞出水面置于帆布担架内挤精，采集的鞍带石斑鱼鲜精，使用精子稀释液按照1：8-10比例稀释，0-4℃冷藏保存；
(2)精子遗传物质灭活
取稀释过的鞍带石斑鱼精液平铺在预冷的培养皿中，精子液面厚度控制在0.1-0.15mm，置于紫外灯箱中照射，照射过程中遮蔽自然光并置于摇床中进行，保持不停的摇动以确保精子照射均匀，紫外光照射剂量为40-60mJ／cm2
(3)人工授精的方法
鞍带石斑鱼紫外照射处理完成后，收集精子置于冰上避光保存；将待产斜带石斑鱼雌鱼捞出，擦干体表水分，将成熟卵子挤入干燥刻度烧杯中；按照毫升处理精子授精40-60毫升卵子的比例进行精卵人工混合，混合45-90秒后加入洁净自然海水完成人工授精；
(4)冷休克诱导石斑鱼卵子
提前准备预冷的海水及冰箱，人工授精后4-8分钟，用小手操网将卵子捞出，按照每50ml卵子使用2000-4000ml预冷的2-6℃海水的比例立即转入预冷的海水中，低温休克处理时间为15-25分钟，经孵化桶孵化得人工培育石斑鱼育苗。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的精子稀释液配方为TS-2：蔗糖110mM，KHCO3100mM，胎牛血清10％，Tris酸10mM。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的麻醉剂是丁香酚。
本发明以遗传灭活的鞍带石斑鱼精子为刺激源，刺激斜带石斑鱼成熟卵子，激活后6min用4-6℃冷水休克处理20min，然后经孵化桶孵化，从而制备得到减数分裂抑制型的雌核发育石斑鱼。
具体实施方式：
一、鞍带石斑鱼精子的遗传失活及刺激斜带石斑鱼卵子雌核发育的方法
1.1雄鱼的选择和精子的采集：
选择体格健壮体表无伤的鞍带石斑鱼雄性成鱼为亲本(5-7龄)，体重60-80kg／尾，置于海上网箱或陆地池塘进行培育，投喂冰鲜杂鱼和鱿鱼进行培育。待海水温度稳定在30℃时(海南省6-10月)，根据斜带石斑鱼排卵规律，提前1-2日给鞍带石斑鱼雄鱼注射HCG(200U／kg)，24小时后将雄鱼置于封闭网箱中，丁香酚麻醉剂将其麻醉后捞出水面置于帆布担架内挤精。采集的鞍带石斑鱼鲜精，使用Ts-2精子稀释液按照1：9比例稀释，置于50mL管中4℃冷藏保存。
精子稀释液Ts-2的配方为：蔗糖110mM，KHCO3 100mM，胎牛血清10％，Tris酸10mM。
1.2精子遗传物质灭活
取稀释过的鞍带石斑鱼精液平铺在预冷的培养皿中，精子液面厚度控制在0.1-0.15mm，置于紫外灯箱中照射，照射过程中遮蔽自然光并置于摇床中进行，保持不停的摇动以确保精子照射均匀，紫外光照射剂量为52mJ／cm2。
1.3人工授精的方法
鞍带石斑鱼紫外照射处理完成后，收集精子置于冰上避光保存。将待产斜带石斑鱼雌鱼捞出，擦干体表水分，将成熟卵子挤入干燥刻度烧杯中。按照2ml处理精子授精100ml卵子的比例进行精卵人工混合，混合1分钟后加入洁净自然海水完成人工授精，同时记录授精时间。
二、减数分裂抑制型雌核发育卵子二倍化的诱导方法
包括：冷休克诱导石斑鱼卵子二倍化起始时间的确定；冷休克温度及持续处理时间的确定。
2.1冷休克诱导石斑鱼卵子二倍化起始时间
提前准备预冷(4℃±0.5℃)的海水及冰箱，采用紫外线处理的精子与卵子授精后即刻开始计时，人工授精后6分钟，用小手操网将卵子从大桶中捞出，立即转入预冷的海水中。
2.2冷休克温度及持续处理时间
卵子的数量及冷休克所用的水体，按照每50ml卵子使用3000ml预冷的4℃海水的比例，冰箱中保持水体4℃进行低温休克，低温休克处理时间为20分钟。
冷休克处理完成后将盛有卵子的烧杯从控温冰箱中取出，置于25℃控温水浴桶中水浴10分钟，温度平衡后转入大孵化桶孵化。
三、对于所诱导胚胎及鱼苗进行倍性鉴定
3.1三组数据对照实现质量控制
采用正常杂交组、精子照射未休克组及雌核发育组(即本发明实施例1)，来实现制备雌育幼苗的质量控制。使用倍性分析仪检测三组样本的倍性，三组数据对照即可判断该批次诱导雌核发育幼苗的好坏，实现质量控制。
3.2倍性仪检测方法
收集三个组发育超过16小时的胚胎，胶头滴管吸取单个胚胎，置于玻片上分散细胞，DAPI染液染色，Partac倍性分析仪检测，以正常杂交组为二倍体对照，各实验组随机检测样品20个，统计单倍体率及二倍体率(见表1)。
表1各组受精率、孵化率与倍性数据
实验组 正常杂交组 精子照射未休克组 雌核发育组
胚胎受精率 89％ 82％ 79％
胚胎二倍体率 100％ 5％ 90％
孵化率(成活率) 95％ 2％ 55％
注：表1为该方法实施的具体实例之一。胚胎受精率以实际授精卵子数量为基准计算；而胚胎二倍体率及孵化率均以发生卵裂的受精卵为基准计算，每组样品检测50个胚胎的倍性。
正常石斑鱼杂交组反映出雌雄配子的质量，其受精率与孵化率在80％以上；精子照射未休克组则反映精子的照射剂量是否合适，成功灭活精子遗传物质的同时保留一定的刺激卵子的能力，因此该组受精率在60％以上，但二倍体率和孵化率在10％以下；雌核发育组增加了冷休克加倍，其二倍体率在60％以上，孵化率在30％以上。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种人工诱导石斑鱼雌核发育鱼苗的方法，该方法包括如下步骤：
(1)雄鱼的选择和精子的采集：
选择体格健壮体表无伤的鞍带石斑鱼雄性成鱼为亲本(5-7龄)，体重60-80kg／尾，置于海上网箱或陆地池塘进行培育，投喂冰鲜杂鱼和鱿鱼进行培育；待海水温度稳定在28-32℃时，根据斜带石斑鱼排卵规律，提前1-2日给鞍带石斑鱼雄鱼注射HCG(200U／kg)，20-28小时后将雄鱼置于封闭网箱中，采用麻醉剂将其麻醉后捞出水面置于帆布担架内挤精，采集的鞍带石斑鱼鲜精，使用精子稀释液按照1：8-10比例稀释，0-4℃冷藏保存；
(2)精子遗传物质灭活
取稀释过的鞍带石斑鱼精液平铺在预冷的培养皿中，精子液面厚度控制在0.1-0.15mm，置于紫外灯箱中照射，照射过程中遮蔽自然光并置于摇床中进行，保持不停的摇动以确保精子照射均匀，紫外光照射剂量为40-60mJ／cm2；
(3)人工授精的方法
鞍带石斑鱼紫外照射处理完成后，收集精子置于冰上避光保存；将待产斜带石斑鱼雌鱼捞出，擦干体表水分，将成熟卵子挤入干燥刻度烧杯中；按照毫升处理精子授精40-60毫升卵子的比例进行精卵人工混合，混合45-90秒后加入洁净自然海水完成人工授精；
(4)冷休克诱导石斑鱼卵子
提前准备预冷的海水及冰箱，人工授精后4-8分钟，用小手操网将卵子捞出，按照每50ml卵子使用2000-4000ml预冷的2-6℃海水的比例立即转入预冷的海水中，低温休克处理时间为15-25分钟，经孵化桶孵化得人工培育石斑鱼育苗。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的精子稀释液配方为：蔗糖110mM，KHCO3 100mM，胎牛血清10％，Tris酸10mM。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的麻醉剂是丁香酚。
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