TWI829209B - 用於製造成熟樹突細胞的方法 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種用於從周邊血單核球細胞(PBMC)製作成熟樹突細胞之方法。此方法包含以下步驟：將所述PBMC以一培養基處理，該培養基補充有介白素4(IL-4)及顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，以製作未成熟樹突細胞；以及將未成熟樹突細胞以該培養基處理，其補充有IL-4、GM-CSF、腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及前列腺素E ₂(PGE ₂)以製作成熟樹突細胞。根據本揭示內容的實施方式，本發明方法所使用的PBMC是從白血球濃厚液或經凍存的周邊血幹細胞(PBSC)存品分離得來。

Description

用於製造成熟樹突細胞的方法

本揭示內容關於一種用於製造成熟樹突細胞的方法。特別是關於從周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)製造成熟樹突細胞的方法。

樹突細胞(Dendritic cell，DC)可見於各種組織，其中樹突細胞偵測恆定平衡並將抗原呈現給T細胞，從而在先天免疫反應與後天免疫反應之間建立聯結。DC有兩種功能性階段，「成熟」與「未成熟」，分別可由不同特徵區分之；而在次級淋巴器官中活化抗原特異性初始T細胞的能力是成熟DC的標誌。因此，成熟DC透過作為潛在的抗原呈現細胞，在免疫系統的活化過程扮演重要角色，而且此關鍵位置，伴隨其從單核球產生樹突細胞及攝取抗原的能力，使得DC可作為多種適應症的免疫治療載體。

這幾年來已經發展各種用來生產臨床用成熟DC的方法逐漸發展；在這些方法中，從單核球來衍生DC是最常見的方法。為此，從人類供體收集單核球並在有細胞介素(例如，介白素(interleukin (IL)-4)及生長因子(例如，顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的存在下培養該些單核球。然而，臨床上有數個缺點需要改善。

通常，從人類周邊血(外周血)收集的單核球必須在培養前進行富集，這過程不免會損耗淋巴球、紅血球及血小板。從周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear，PBMC)富集單核球的過程通常是透過塑料(培養盤)貼附法來達成；然而，此過程是一個開放的多瓶程序，有汙染的風險，因此，對須符合現今優良製造規範(cGMP)的大規模生產而言不是理想的流程。

替代性方案是可藉由逆流離心淘洗(counterflow centrifugal elutriation，CCE)細胞分離來達成單核球富集，此方法是取決於細胞經過離心機時的離心力與逆流阻力來收集不同批的細胞。與前述塑料貼附法相似，淘洗程序也仍有交叉汙染的風險，導致此製程也不適合大規模生產。

有鑑於此，相關領域亟需一種改良方法，可以有效且量產的方式來製備成熟樹突細胞。

為了給讀者提供基本的理解，以下提供本揭示內容的簡要發明內容。此發明內容不是本揭示內容的廣泛概述，同時非用來識別本發明的關鍵/必需元件或勾勒本發明的範圍。其唯一目的是以簡化的概念形式呈現本揭示內容的一些概念，以作為呈現於後文中更詳細描述的序言。

如本文具體實施及廣泛描述地，本揭示內容的一個態樣是關於一種用於從周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)製作成熟樹突細胞的方法。前述方法包含步驟(a)：將PBMC以補充有介白素4(IL-4)及顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)的培養基處理，以製造未成熟樹突細胞；以及步驟(b)：將未成熟樹突細胞以補充有IL-4、GM-CSF、腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及前列腺素E ₂(PGE ₂)的培養基處理，以製造成熟樹突細胞。在本揭示方法中，所述PBMC是從一白血球濃厚液或一凍存周邊血幹細胞(peripheral blood stem cell，PBSC)存品中分離。

在一些優選實施方式中，該白血球濃厚液可從一個體新鮮收集。

根據本揭示內容某些實施方式，凍存PBSC存品係藉由(i)將新鮮分離的PBSC與抗凍劑混合以製作PBSC存品；以及(ii)將步驟(i)所製作的PBSC存品在一室中接受一冷凍處理，其中該室的環境溫度是在約55至70分鐘之內從約4°C降至約-95°C。

較佳地，在上述步驟(ii)中，該室的環境溫度是逐步地降低，具體是(i)在21至25分鐘之內從約 4°C降至-7°C，(ii)在5至 6分鐘之內從-7°C降至-25°C，(iii)在25至30分鐘之內從-25°C降至-45°C，以及(iv)在4至9分鐘之內從約-45°C降至-95°C。

根據本揭示內容一些實施方式，該凍存PBSC存品可存放於一液態氮中。

在替選或額外實施方式中，在步驟(a)之前，本發明凍存PBSC存品可在第一溫度(約 37°C)，接著伴隨一低速離心於約0至5°C的第二溫度接受一解凍處理，直到該凍存PBSC存品解凍。

根據本揭示內容的一些實施方式，培養基可包含L-麩醯胺(L-glutamine)、硫酸鏈黴素以及硫酸建它黴素(gentamicin)。根據本揭示內容替選實施方式，培養基可包含鹽類、醣類、胺基酸、維生素、運鐵蛋白、白蛋白以及胰島素。

根據本揭示內容一些實施方式，在本發明方法的步驟(a)中，該IL-4及該GM-CSF是以約1:1至2:1的一單位比例存在於所述培養基中。

根據一些優選實施方式，步驟(a)使用的培養基更補充有一血清。在某些具體實驗例中，所述血清為自體血清。

根據本揭示內容部分實施方式，本發明方法的步驟(b)中，所述IL-4、GM-CSF及TNF-α是以1:1:1之單位比例存在於培養基中。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本文另有定義，本文所有的技術及科學術語與本發明所屬技術領域具有通常知識者習知的術語的意思相同。

除非上下文另有明確說明，本文所使用的單數形式「一 (a, an)」以及「該 (the)」均包含複數形式。

本文使用的術語「培養基(cultivating medium)」是指廣泛常用在細胞培養的培養介質。介質的組分可取決於要培養的細胞的種類，而這是本發明所屬技術領域的通常知識。舉例來說，標準化癌症細胞株培養基包含能夠支持及確保癌症細胞在體外( in vitro)持續增殖的蛋白或非蛋白胺基酸、醣類、鹽類及/或微量元素；由培養單核細胞所需之胺基酸、抗生素、細胞介素、醣類及蛋白質所組成之標準化細胞培養基。特定培養基的詳細成分可從供應商提供的公開資訊獲得或是見於公開文獻。根據本揭示內容一些實施方式，用於本揭示內容的培養基包含L-麩醯胺、硫酸鏈黴素及硫酸建它黴素。根據本揭示內容其他實施方式，培養基可包含鹽類、醣類、胺基酸、維生素以及人類蛋白質(例如：運鐵蛋白、白蛋白及胰島素)。

本文使用的「個體」一詞是指可作為本發明方法細胞供體的哺乳動物。所述「哺乳動物」(mammal)一詞是指哺乳綱(class)的所有成員，其包含人類、靈長類、馴養動物及家畜，像是兔、豬、羊、牛；以及動物園圈養動物、用於運動的動物或寵物；以及囓齒類(例如小鼠與大鼠)；優選為人類。再者，除非明確指出性別，否則「個體」一詞一般均包含男性(雄性)及女性(雌性)。

2. 具體實施方式

本揭示內容至少部分基於發現到可源自特定細胞族群並經一系列處理後可從該細胞族群製備富集成熟樹突細胞，從而可增加成熟樹突細胞的產率與品質。據此，本揭示內容的目標在於提供一種新穎的方法，用於從已經自一白血球濃厚液或一凍存周邊血幹細胞(peripheral blood stem cell，PBSC)分離之周邊血單核細胞(PBMC)製造成熟樹突細胞的方法。

據此，本揭示內容發明目的是關於從周邊血單核細胞(PBMC)製備成熟樹突細胞的方法。前述方法包含至少以下步驟：(a) 將PBMC以補充有介白素4(IL-4)及顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)的培養基處理，以製造未成熟樹突細胞；以及(b)將未成熟樹突細胞以補充有IL-4、GM-CSF、腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及前列腺素E ₂(PGE ₂)的培養基處理，以產生成熟樹突細胞。為此目的，本發明方法所使用的PBMC是從白血球濃厚液或凍存周邊血幹細胞存品中分離之。

參閱第1圖，其為繪示著用於製造成熟樹突細胞的本發明方法10步驟的流程圖。具體而言，本發明方法10至少包含三步驟，其分別為：從一給定細胞來源分離出PBMC (步驟S110)；將該PBMC以一培養基處理以產生未成熟樹突細胞，此培養基補充有IL-4及GM-CSF(步驟S120)；以及將未成熟樹突細胞以培養基處理，其補充有IL-4、GM-CSF、TNF-α以及PGE ₂，以產生成熟樹突細胞(步驟S130)。根據本揭示內容，本方法使用的PBMC是從一個體新鮮收集的白血球濃厚液分離之，或是從已經存放於特定環境一段時間的凍存周邊血幹細胞存品中分離之。以下分別描述來自兩種PBMC來源的分離及製造流程。

2.1 自白血球濃厚液分離周邊血單核細胞

根據本揭示內容部分實施方式，可透過本領域通常知識從個體新鮮收集而得白血球濃厚液。舉例來說，可從個體取得新鮮血液，並立即於細胞分離器中透過梯度離心進行細胞分離，以製得PBMC (步驟S110)。可作為白血球濃厚液供體的個體之實例包含但不限於：人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、犬、貓、牛、山羊、綿羊、猴或馬等。優選地，該個體為人類。用於製備白血球濃厚液的普通程序中，將人類全血收集於血袋中，該血袋含有抗凝血劑(例如，檸檬酸葡萄糖(ACD))中，所收集的全血接著經過離心以產生三層，分別為血漿、膚色血球層(buffy-coat)以及紅血球。移除血漿層之後，收集膚色血球層即為白血球濃厚液。根據本揭示內容實施方式，立即使用分離後的白血球濃厚液，或是可將白血球濃厚液存放至少4小時，例如4、8、12、16、20以及 24小時直至後續使用。在一具體實施例中，白血球濃厚液是存放不超過24小時即進行PBMC分離。

2.2 自凍存周邊血幹細胞存品中分離周邊血單核細胞

根據本揭示內容另一替代性實施方式，是從已存放於零下溫度一段時間的周邊血幹細胞(PBSC)存品中，分離出用於產生成熟樹突細胞的PBMC。在一些實施方式中，凍存PBSC存品是存放於液態氮一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個月、或超過一、二、三、四、五、六、七、八、九年或十年。在一優選實施方式中，在用於分離PBMC之前，凍存PBSC存品是存放於液態氮超過三年。在一些具體實施例中，本揭示內容凍存PBSC存品已被分別儲存三年、四年、五年、六年或八年。

在一些實施方式中，凍存PBSC存品實質上以下列步驟製成：(i)將新鮮分離的PBSC與一抗凍劑混合以產生一PBSC存品；以及(ii)使步驟(i)製作的PBSC存品在一室內接受一冷凍處理，在該室中，環境溫度是在約55至70分鐘之內從約4°C降至約 -95°C。在部分具體實施例中，先藉由本領域熟知的方式及/或工具將PBSC從人類供體分離收集，該些方式及/或工具包含但不限於半自動化或自動化細胞分離器，以及細胞離心機。所收集的PBSC接著則與可防止細胞在結冰溫度結冰的抗凍劑混合，從而產生可容忍後續冷凍處理(通常在零下空間，例如生物醫學冷凍櫃內進行)的PBSC存品。

可用於本發明流程的抗凍劑實例包含但不限於，抗凍化學劑(例如：乙二醇、丙二醇、丙二醇甲醚、二甲亞碸 (dimethyl sulfoxide，DMSO)以及2-乙基己酸(2-ethylhexanoic acid，2-EHA))；抗凍醣蛋白(例如：昆蟲抗凍蛋白(AFP)像是TmAFP或CfAFP；魚類抗凍蛋白第一型至第四型；植物抗凍蛋白；海冰生物抗凍蛋白例如EfcIBP)；以及其組合。在一具體實施例中，抗凍劑是DMSO。

當PBSC存品放置於零下空間內，該空間的環境溫度則在手動控制或自動控制之下於一特定時間內逐步地從4°C降至約 -95°C。具體而言，冷凍程序可藉由生物醫學冷凍櫃內預先建置的電腦程式自動地執行，且該在該冷凍室內的環境溫度逐步地變化：(i)在21至25分鐘之內，例如21、22、23、24或25分鐘之內，從約4°C降至-7°C；(ii) 在5至6分鐘之內(例如5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6分鐘)從約 -7°C降至-25°C;(iii)在25至30分鐘之內，例如25、26、27、28、29或30分鐘，從-25°C降至-45°C；以及最後(iv)在4至9分鐘之內，例如4、5、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、8或9分鐘內，從約 -45°C降至-95°C。在一具體實施例中，該冷凍櫃內的環境溫度是設定成逐步地(i)在22分鐘內從約 4°C降至-7°C，(ii)在5.68分鐘內從約 -7°C降至-25°C；(iii)在28.57分鐘內從-25°C降至-45°C；以及最後(iv)在6.5分鐘內從約 -45°C降至-95°C。

額外地或非必要地，為了增加分離PBMC的效率，在開始進行分離之前，凍存PBSC存品可先接受一解凍處理。在一些實施方式中，解凍處理包含在約 37°C的第一溫度，接著在低速離心伴隨下，在約0至5°C的第二溫度，分別對凍存PBSC存品進行解凍，直至凍存PBSC完全融化。可以以本領域的習知方式來執行解凍處理。舉例來說，可藉由先將存品放置於恆溫37°C的熱水浴中，接著置放於溫度設定為4°C的冷凍離心機中，從而將凍存PBSC存品解凍。同時，對凍存PBSC存品施以低速離心，以沉澱解凍的PBMC。

2.3 從周邊血單核細胞製備樹突細胞

參考第1圖，從前述任一來源收集PBMC之後，接著在一補充有細胞介素以及生長因子的培養基內，於本領域習知且廣泛使用的給定條件下進行培養，從而製備未成熟樹突細胞(步驟S120)。在一些實施方式中，是在補充有介白素(interleukin 4，IL-4)以及顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的培養基中，於37°C，含有5–10%之CO ₂的培養箱中，培養PBMC約一至八日，例如，培養一、二、三、四、五、六、七或八日。在一些具體實施例中，在第0天，先是將PBMC懸浮於基礎培養液內，接著在第3天及第6天，更換成具有額外添加IL-4及GM-CSF的新鮮基礎培養基，培養全程共持續7日。在其他具體實施例中，在第0天先將PBMC懸浮於一基礎培養液中，接著在第3天更換成具有額外添加IL-4及GM-CSF的另一新鮮基礎培養基，且培養全程共持續5日。

接著以另一培養基培養前述方法製備的未成熟樹突細胞，該培養基則補充有IL-4、GM-CSF、腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及前列腺素E ₂(Prostaglandin E ₂，PGE ₂)，從而產生成熟樹突細胞(步驟S130)。與步驟S120相似之處在於，可以在相同的培養基中懸浮所收集的未成熟樹突細胞，並在環境溫度37°C，5–10%之CO ₂的培養箱中培養幾天，直至成熟樹突細胞產生。在部分具體實施例中，在未成熟樹突細胞被培養兩日之後，即可見成熟樹突細胞。

本發明方法10之步驟S120及S130中分別使用培養基可以具有相同或不同的能夠支持細胞生長及增殖的組分及/或成分。在一些實施方式中，前述兩步驟(S120及S130)使用的培養基具有相同的成分；在替選實施方式中，步驟S120與步驟S130使用的培養基之成分相異。本揭示內容培養基可包含的組分及/成分之實例包含，但不限於：蛋白或非蛋白胺基酸、醣類、鹽類、微量元素、抗生素、細胞介素、維生素、人類蛋白質以及前述的組合。在一具體實施例中，本發明培養基的主要成分有L-麩醯胺(L-glutamine)、硫酸鏈黴素以及硫酸建它黴素。在另一具體實施例中，該培養基的主要成分是鹽類、醣類、胺基酸、維生素、運鐵蛋白、白蛋白以及胰島素。

根據一些實施方式，當使用本發明方法時，包含IL-4、GM-CSF、TNF-α以及PGE ₂在內的細胞介素及/或生長因子可分別以預先指定的量添加至該培養基中。在一些實施方式中，在步驟S120中，培養基補充有IL-4及GM-CSF，而IL-4及GM-CSF是以約1：1至2：1的單位比例(例如：約1：1、1.1：1、1.2：1、1.3：1、1.4：1、1.5：1、1.6：1、1.7：1、1.8：1、1.9：1或2：1)存在於該培養基中。在一具體實施例，IL-4及GM-CSF是以約1：1的單位比例存在於培養基中；在另一具體實施例，IL-4及GM-CSF是以約1.6：1的單位比例存在於培養基中。另一方面，本發明10的步驟S130中，該培養基補充有IL-4、GM-CSF、TNF-α及/或PGE ₂；在一具體實施例，步驟130的培養基補充有IL-4、GM-CSF及 TNF-α，其中IL-4、GM-CSF及TNF-α是以一1：1：1之單位比例存在於該培養基中。也可替選地或非必要地添加血清至培養基中。在一具體實施例中，步驟S120使用的培養基更補充有濃度為1%的自體血清。

經步驟S120及S130所述的培養基依序培養後，可從PBMC成功地製備出成熟樹突細胞。

藉由前述特徵，本揭示內容方法可以有效率的方式生產製造成熟樹突細胞，進而增加細胞產率並提升品質。

實施例

材料與方法

細胞來源

白血球濃厚液

藉由細胞分離器的幫助(SPECTRA OPTIA, Terumo BCT)，在知情同意下，從三個健康人類供體新鮮收集白血球濃厚液，並存放於15-25°C之溫度下以供後續使用。

周邊血幹細胞 (PBSC) 存品

在知情同意下從健康人類供體收集全血並存放於血袋中，以供後續經離心分離成血漿及一含有周邊血幹細胞(PBSC)的膚色血球層(離心條件：10°C，1500 rpm，10分鐘)。將血漿轉移至新的空血袋中並與二甲亞碸 (DMSO)混合於4°C放置至少20分鐘，接著此混合物再與膚色血球層混合以形成PBSC存品，並暫時存於4°C不超過六小時。

接著將PBSC存品帶到生物醫學冷凍櫃(IceCube 14M-A 自動冷凍櫃，Minitube)內，以預先建置的程式，在65分鐘之內進行凍存，其中該冷凍室內的環境溫度是根據表1列出的預設流程逐步降溫。

表1：用於凍存PBSC的指定溫度與時間

溫度 (°C)	時間 ( 分鐘 )	斜率 (°C/ 分鐘 )
4.00	0.00	--
-7.00	22.00	-0.5
-55.00	1.93	-24.83
-55.00	0.75	0.00
-25.00	3.00	10.00
-45.00	28.57	-0.7
-60.00	3.00	-5.00
-95.00	3.50	-10.00
-95.00	20.00	0.00

凍存之後，凍存PBSC分別於填滿液態氮的低溫槽內存放三年、四年、五年、六年或八年。

血清製品

以2,115 rpm離心上述血漿30分鐘(4°C)。收集上清液並於56°C之水浴槽內加熱30分鐘，接著於室溫冷卻10分鐘，並接著以相同速度及溫度再次離心30分鐘。所產生的上清液含有血清。

從白血球濃厚液製作未成熟樹突細胞 (iDCs)

將新鮮收集的白血球濃厚液分裝於離心管(最大體積：50毫升)中，每管含有約10毫升的白血球濃厚液，接著添加另外10毫升的杜爾貝科磷酸鹽緩衝溶液(Dulbecco's phosphate-buffered saline，DPBS)稀釋。將所形成的白血球溶液緩慢地轉移至另一個塗覆有菲科帕克(Ficoll-Paque，一種密度梯度培養基，供應商Cytiva)的離心管中，並以1,800 rpm，24°C，離心30分鐘。離心之後，將含有周邊血單核細胞(PBMC)的膚色血球層收集並轉移至新離心管，於37°C以DPBS洗滌，接著以基礎培養基(Thermo Fisher-Gibco)重新懸浮，並計算細胞數。

所收集的PBMC先在基礎培養基中培養1至2小時，接著於37°C以DPBS洗滌。細胞則分成兩群，分別按下述的培養條件進一步培養：分群I：以補充有1000 IU/毫升之介白素(IL-4)及1000 IU/毫升之顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)的AIM-V培養基(Gibco)，在37°C之CO ₂培養箱中培養七日；分群II：以補充有800 IU/毫升之IL-4、500 IU/毫升之GM-CSF以及1%血清的DC培養基(CellGenix)，在37 °C之CO ₂培養箱中培養至少五日。在第5日或第7日收取細胞並觀察其表型。

從凍存周邊血幹細胞存品製備未成熟樹突細胞

將凍存周邊血幹細胞(PBSC)存品放置37°C的水浴直至解凍。收取解凍的PBSC並轉移至離心管中，該離心管含有DPBS (體積為PBSC體積的9倍)，並於4°C以1,300 rpm離心10分鐘。接著以DPBS重新懸浮PBSC沉澱物，用於總共有核細胞數(total nucleated cell count，TNC)。

基於細胞計數(或TNC數目)，將收集的PBSC以每管5×10 ⁷至2×10 ⁸個細胞/20 ml的濃度分裝至各離心管中。所形成的溶液則轉移至塗覆有菲科帕克(Ficoll-Paque)的新離心管中，接著離心30分鐘(1800 rpm/24°C)。離心後，收集含有PBMC的膚色血球層並將其轉移至新離心管中以待後續處理。

先將所收集的PBMC在基礎培養基中培養1至2小時，以DPBS於37 °C洗滌，接著以AIM-V培養基(補充有1000 IU/毫升的IL-4以及1000 IU/毫升的GM-CSF)於37 °C的CO ₂培養箱培養七日。第7日收取細胞以進行表型評估。

從未成熟樹突細胞 (iDC) 製備成熟樹突細胞

收取如前述方法(從白血球濃縮液或凍存PBSC存品)製備的iDC，並收集並以每分群5×10 ⁶個細胞之密度進行分群。透過離心移除每分群的上清液，接著以AIM-V培養基重新懸浮剩餘的iDC沉澱物。接著，經懸浮的iDCs在補充有1000 IU/毫升之IL-4、1000 IU/毫升之GM-CSF、1000 IU/毫升之腫瘤壞死因子α (TNF-α)以及1 μM之前列腺素E ₂(PGE ₂)的AIM-V培養基內，並於37°C下培養兩日。在第3日收取細胞進行細胞表型及效價檢測。

PBSC 生存力

收集解凍PBSC並以抗-CD34及抗-CD45抗體分選，以從非幹細胞(即，已經分化的白血球)區分出幹細胞(即，PBSC)，再藉由以下公式來測定本發明PBSC的生存力：(活幹細胞之數量/活白血球之數量)×100 %。

表型評定

收取細胞，並以DPBS重新懸浮，與人類FcR阻斷試劑反應10分鐘，接著在黑暗中與抗-人源CD14-FITC、抗-人源CD34-PE、抗-人源CD40-PE、抗-人源CD45-FITC、抗-人源CD80-PE、抗-人源CD83-FITC、抗-人源CD86-PE及/或抗-人源HLA-DR-FITC (BD Biosciences)抗體反應10分鐘。以細胞染色緩沖液(DPBS含5%的FBS)洗滌並阻斷經染色的細胞三至五次，並添加 5 μL之7-胺基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)與細胞反應10分鐘。最後，以流式細胞儀(FACSCanto II, BD Biosciences)分選細胞。

胞吞活性

IDCs及/或DCs (每圓底離心管2×10 ⁵個細胞)添加1 μL的FITC標記聚葡糖(dextran)，於37°C水浴反應20分鐘，接著與4°C阻斷反應，接著於黑暗中反應20分鐘。以細胞染色緩溶液(DPBS含5%的PBS)%F沖洗五至七次阻斷被染色的細胞。依序添加抗-CD11抗體(5 μL)及7-胺基放線菌素D (7-AAD, 5 μL)至細胞中，並以流式細胞儀分選。

流式細胞儀分析

使用螢光染料共軛的抗體以流式細胞儀達成細胞分選。分選之前的最後一次沖洗之後，以40微米尼龍細胞篩網(Becton Dickinson, USA)過濾細胞以移除細胞團塊，接著以流式細胞儀(FACSCanto II, BD Bioscience)分選。所分選的細胞族群分別收集於完整培養基(DPBS含5% FBS)中以待後續使用。

細菌內毒素偵測

根據供應商的使用操作說明及美國藥典提供的指導，以內毒素偵測系統(BioTek)測定內毒素。

生物安全評定

萃取全細胞DNA，並根據供應商的使用操作說明，使用黴漿菌偵測套組(Sartorius)偵測黴漿菌。

方法適用性及無菌性檢測

收集並過濾本發明細胞產物，並根據美國藥典提供的指導進行標準細菌與真菌物種(即： Aspergillus brasiliensisATCC 16404、 Bacillus subtilissubsp . spizizeniiATCC 6633、 Candida albicansATCC 10231、 Clostridium sporogenesATCC 19404、 Pseudomonas aeruginosaATCC 9027及 Staphylococcus aureussubsp . aureusATCC 6538)的培養。

未成熟樹突細胞產量

分別收集並計數第0天的PBMC及第5天或第7天的未成熟樹突細胞(iDCs)，並以以下算式測定由本發明方法製備的未成熟樹突細胞的產量： [細胞數量 (第5日或第7日) × iDC%] / [細胞數量 (第0日) × PBMC%] × 100% = iDCs的產率 (%)。

實施例 1 ：凍存周邊血幹細胞 (PBSC) 存品的穩定性

本實施例評估本發明PBSC在經過長期凍存之後是否仍保有其分化成周邊血單核細胞(PBMC)的能力。

為此，根據「材料及方法」一節描述的流程，先將PBSC凍存至少三年，爾後在37°C之溫度解凍，從而得到解凍後(退冰)的PBSC。四組解凍後PBSC分別各自與抗-CD34-PE及抗-CD45-FITC抗體共培養，並以流式細胞儀測定其細胞表型。

從凍存PBSC存品衍生的培養細胞富含CD34 ⁺細胞(即：凍存超過三年的解凍PBSC，特別是凍存三年、四年、五年、六年或八年)，且平均生存力均大於90%，表示本發明凍存方法可保存PBSC至少三年也不會不利地改變其富潛能(pluripotent)天性。

實施例 2 ：以本發明方法收集與培養產自 PBSC 的未成熟樹突細胞 (iDC) 的產率

本實驗調查從三個不同組別(第1組至第3組)的PBMC衍生之iDC的產率，其中每一組的PBMC是根據本揭示內容「材料與方法」一節所描述的條件來收集並培養。具體，第1組的PBMC組是衍生自白血球濃厚液並培養於補充有IL-4及GM-CSF的培養基；第2組的PBMC是衍生自白血球濃厚液並培養於補充有IL-4、GM-CSF及血清(1%)的培養基；以及第3組的PBMC是衍生自凍存PBSC存品並培養於補充有IL-4及GM-CSF。接著分別測定各PBMC組的iDC之產量或產率。

結果發現第2組與第3組分別具有顯著較高的iDC產率。具體而言，第1組(即：培養於無血清培養基的PBMC)以及第2組(即，培養於血清添加培養基的PBMC)之iDC的產率分別為約4.43%與10%。此外，第2組的iDC產率是第1組的兩倍多，這表示血清的添加顯著地增加iDC的產率。此外，從第3組PBMC(即，從PBSC存品衍生的PBMC)得來的iDC的產率是約20.5%，明顯高於第1組及第2組衍生之iDC的產率，這表示本發明凍存程序可保留PBSC的富潛能天性及分化能力。前述結果整體呈現本發明方法可達成iDC的高產率。

實施例 3 ：本方法所生產之樹突細胞 (DC) 的特性分析

3.1表型

此實驗透過檢查細胞表型進而評估本發明方法之細胞產物確實為未成熟及/或成熟樹突細胞。為此，本發明未成熟DC及成熟DC產物(即，根據本揭示內容「材料與方法」一節所述流程生產的本發明未成熟與成熟DC)與抗人源CD14、抗人源CD40、抗人源CD80、抗人源CD83、抗人源CD86以及抗人源HLA-DR抗體在黑暗中混合，並以流式細胞儀分選被各上述抗體辨識的細胞。表2提供表型譜的定量結果。

表2，表型譜的定量結果

生物標記	本發明 iDC 產物	iDC 的允收基準	本發明 mDC 產物	mDC 的允收基準
CD14	3.1%	＜60%	3.6%	＜60%
CD40	60.7%	-	82.5%	升量
CD86	74.9%	＞60%	99.6%	＞60%
CD80	46.0%	-	87.3%	升量
CD83	4.8%	-	84.2%	升量
HLA-DR	93.1%	＞60%	99.5%	＞60%

表2的結果證實本發明細胞產物實質上經確認是未成熟樹突細胞及成熟樹突細胞。

3.2胞吞能力

本實驗評估本發明所產之DC的胞吞能力。為此，根據「材料與方法」一節所述之程序製備的本發明未成熟DC及成熟DC分別與螢光聚葡糖共培養20分鐘。借助於流式細胞儀，藉由測量在iDC及/或DC中，被胞吞的聚葡糖及未被胞吞的聚葡糖之比例來評估細胞的胞吞能力。

結果發現，iDC的胞吞能力為61.5% (大於20%)，然而DC的胞吞能力則低於20%，此結果與業界對樹突細胞產物的允收基準(AC)要求相符。前述數據呈現本揭示內容方法可成功地生產所需、期望的樹突細胞產物。

3.3安全性

本研究主要調查本發明所製備的DC是否符合臨床所需安全性需求。為此，透過前述「材料與方法」一節所述的流程測定DC內的內毒素與黴漿菌量。

結果發現，本發明DC產物的內毒素含量低於0.25 EU/毫升，遠低於cGMP標準(＜ 2 EU/毫升)；而本發明DC對黴漿菌的存在呈現陰性。前述結果整體證實本發明的DC產物無論在臨床醫學或對人體都是安全無虞的。

3.4 方法適用性及無菌性

本研究主要調查本發明所製備的DC是否符合cGMP規範所需的無菌需求。為此，透過前述「材料與方法」一節所述的流程，收集並過濾本發明所產生的DC，接著進行微生物培養。

結果發現本發明DC對任何微生物的存在都呈現陰性，這證實本發明DC產物是符合cGMP規範的。

綜上，實施例1至3的結果整體證實本發明可縮短DC生產時間並增加其產率，從而有突出的優點。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

10                      方法 S110-S130        步驟

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖是根據本揭示內容一實施方式繪示的本發明方法10之流程圖。

10                      方法 S110-S130        步驟

Claims (11)

1. 一種從周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)製造成熟樹突細胞的方法，包含：(a)將該周邊血單核細胞以補充有介白素4(IL-4)及顆粒性白血球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)的一培養基處理，以製造未成熟樹突細胞；以及(b)將步驟(a)該未成熟樹突細胞以補充有IL-4、GM-CSF、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及前列腺素E₂(PGE₂)的該培養基處理，以製造該成熟樹突細胞，其中，該周邊血單核細胞係從經凍存至少三年之一凍存周邊血幹細胞(peripheral blood stem cell，PBSC)存品分離。
2. 如請求項1所述之方法，其中該凍存周邊血幹細胞存品係透過(i)將新鮮分離的該周邊血幹細胞以及一抗凍劑混合以製作一周邊血幹細胞存品；以及(ii)使步驟(i)製作好的該周邊血幹細胞存品在一室中接受一冷凍處理，在該冷凍處理中，該室的環境溫度係在55至70分鐘之內從4℃降至-95℃。
3. 如請求項2所述之方法，其中該室的環境溫度是逐步地(i)在21至25分鐘之內從4℃降至-7℃，(ii)在5至6分鐘之內從-7℃降至-25℃，(iii)在25至30分鐘之內從-25℃降至-45℃，以及(iv)在4至9分鐘之內從-45℃降至-95℃。
4. 如請求項1所述之方法，其中該凍存周邊血幹細胞存品係存放於一液態氮中。
5. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(a)之前，該凍存周邊血幹細胞存品分別在37℃的一第一溫度，接著伴隨一低速離心在0至5℃的一第二溫度解凍，直至該凍存周邊血幹細胞完全解凍。
6. 如請求項1所述之方法，其中該培養基包含L-麩醯胺(L-glutamine)、硫酸鏈黴素以及硫酸建它黴素(gentamicin)。
7. 如請求項1所述之方法，其中該培養基包含鹽類、醣類、胺基酸、維生素、運鐵蛋白、白蛋白以及胰島素。
8. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(a)中，該IL-4及該GM-CSF是以1：1至2：1之一單位比例存在於該培養基中。
9. 如請求項8所述之方法，其中在步驟(a)中，該培養基更補充有一血清。
10. 如請求項9所述之方法，其中該血清為一自體血清。
11. 如請求項1所述之方法，其中在步驟(b)中，該IL-4、該GM-CSF以及該TNF-α是以1：1：1之一單位比例存在於該培養基中。

Images