CN102282251A - 用于长期造血种群恢复的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了分离脐带血细胞的CD133⁺/CD45^-/GlyA^-亚群的方法。在一个实施方案中，该方法包括提供脐带血细胞的初始群；使该初始细胞群与对CD133特异的第一抗体、对CD45特异的第二抗体以及对血型糖蛋白A(GlyA)特异的第三抗体，在足以允许每一抗体与初始细胞群每一细胞上的其靶标(如果存在的话)结合的条件下接触；以及分离CD133⁺、CD45^-且GlyA^-的细胞亚群。还提供了从脐带血分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞分离群，在受试者中种群恢复细胞类型的方法，骨髓移植的方法，在CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞中诱导造血能力的方法，以及包括CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的细胞培养系统。

Description

用于长期造血种群恢复的方法和组合物

与相关申请的交叉引用

现在公开的主题要求2008年11月14日提交的美国临时专利申请系列号61/199,356的优先权权益；其公开内容在此通过引用全文并入本文。

资助声明

该成果得到了美利坚合众国国立卫生研究所资助R01 CA106281-01和R01 DK074720的支持；因此，美国政府对本文公开的主题拥有某些权利。

发明领域

当前公开的主题在一些实施方案中涉及用于在受试者中种群恢复细胞类型的方法。在一些实施方案中，当前公开的主题涉及给有需要的受试者以一定的量及通过一定的途径施与包含多个分离的脐带血衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 干细胞的组合物，所述量和途径足以允许用于在受试者中种群恢复细胞类型的脐带血衍生的至少一部分移入受试者的靶部位并在其中分化，由此在受试者中种群恢复细胞类型。

背景

血液移植术的发展增加了对分离自组织可相容供体的造血干细胞(HSC)的需求。公知合适的骨髓(BM)供体通常是短缺的。不幸的是，脐带血(CB)含有的HSC绝对数量比BM低得多，使得CB在成人患者的治疗用途中不那么优选。此外，当前极难以可靠地扩增分离自BM和CB-HSC的长期种群恢复(LT)的HSC，使得加重了对新的LT-HSC供应的需求。

因此，假设胚胎干细胞衍生的HSC可能比分离自诸如BM和CB的常规来源的HSC具有许多优势。然而，这已被证明难以应用，因为难以应用和优化使胚胎干细胞(ESC)沿着造血谱系分化的策略。此外，人类ESC是各种限制的对象，这限制了它们的可利用性和有用性，即使对于实验研究也如此。

发明概述

本概述列出了当前公开的主题的数个实施方案，以及在许多情况下列出了这些实施方案的变形和互换。这一概述仅是许多且不同的实施方案的示例。给定实施方案的一个或更多个代表性特征的提及同样是示例性的。此类实施方案可在有或无该提及的特征的情况下一般地存在；同样地，这些特征可应用于当前公开的主题的其他实施方案，而无论在这一概述中列出与否。为避免过多的重复，这一概述没有列出或提示此类特征的所有可能组合。

当前公开的主题提供了分离脐带血细胞的CD133⁺/CD45^-/GlyA^- 亚群的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供脐带血细胞的初始群；(b)使该初始细胞群与对CD133特异的第一抗体、对CD45特异的第二抗体以及对血型糖蛋白A(GlyA)特异的第三抗体，在足以允许每一抗体与初始细胞群每一细胞上的其靶标(如果存在的话)结合的条件下接触；以及(c)分离CD133⁺、CD45^-且GlyA^-的细胞亚群。在一些实施方案中，该接触步骤包括使脐带血细胞与特异性结合CD133、GlyA和CD45的多个抗体同时地或反复地接触。在一些实施方案中，该方法还包括从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^高细胞，从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^低细胞，或分别从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^高细胞和ALDH^低细胞。

当前公开的主题还提供了包含基本上纯化的分离自脐带血(CB)的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞的分离的干细胞群。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞是ALDH^高细胞。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞是ALDH^低细胞。

当前公开的主题还提供了包含当前公开的分离的干细胞群的组合物。在一些实施方案中，该组合物还包含一种或更多种可药用载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，该可药用载体和/或赋形剂对于在人类中的应用是可药用的。

当前公开的主题还提供了用于在受试者中种群恢复细胞类型的方法。在一些实施方案中，该方法包括以一定的量和通过一定的途径给受试者施与在可药用载体中包含多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的组合物，所述量和途径足以允许CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受试者中种群恢复细胞类型。在一些实施方案中，该细胞类型是造血细胞。在一些实施方案中，该靶部位包括骨髓。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，该多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞包含分离自脐带血的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞。在一些实施方案中，该可药用载体对于对于在人类中的应用是可药用的。

当前公开的主题还提供了用于骨髓移植的方法。在一些实施方案中，该方法包括给至少部分地缺乏骨髓的受试者施与包含有效量的分离自脐带血的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的药物制备物，其中该有效量包含分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以移入受试者骨髓的量。在一些实施方案中，该至少部分地缺乏骨髓的受试者经历了至少部分地减少该受试者骨髓的预治疗。在一些实施方案中，该预治疗包括脊髓减少或脊髓抑制治疗。在一些实施方案中，该预治疗包括给该受试者施与免疫治疗、化疗、放射治疗或其组合。在一些实施方案中，放射治疗包括全身放射。在一些实施方案中，该施与包括静脉内施与该药物制备物。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。在一些实施方案中，该方法还包括在施与步骤前在OP9细胞饲养层的存在下共培养CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞至少5天。

当前公开的主题还提供了用于诱导CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞；和(b)在OP9饲养层的存在下共培养CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以诱导该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的时间。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是骨髓衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、脐带血衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、或其组合。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低干细胞。在一些实施方案中，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。在一些实施方案中，该造血能力包括当将该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞施与受试者时将骨髓移入受试者的能力。在一些实施方案中，该造血能力包括在受试者中提供骨髓长期移入的能力。在一些实施方案中，足以诱导造血能力的时间包括共培养至少5天。在一些实施方案中，当前公开的方法进一步包括从人脐带血分离CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞。

当前公开的主题还提供了包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的细胞培养系统。在一些实施方案中，该细胞培养系统还包含OP9细胞饲养层。在一些实施方案中，CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是人脐带血CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、人骨髓CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞或其组合。在一些实施方案中， CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。

因此，当前公开的主题的一个目的是提供用于分离脐带血细胞CD133⁺/CD45^-/GlyA^-亚群的方法。

上文已指出了当前公开的主题的一个目标，并且其全部或部分由当前公开的主题实现，当联系作为后文中最佳描述的附图时，其他目标也会随着描述的进行而变得明显。

附图简述

图1A和1B是分别是通过应用磁性细胞分选(MACS)以及随后的荧光激活细胞分选(FACS)分离的联合策略分离ALDH^低 和ALDH^高CB-VSEL的示意方法，以及基于ALDH活性的FACS分离CB-VSEL亚群的代表性选通策略。

图2是体外扩增ALDH^低 和ALDH^高CB-VSEL亚群的技术的示意图。将新鲜分离的细胞亚群培养在甲基纤维素克隆形成测试中(顶图)，或在OP9细胞饲养层上扩增5天(底图)并随后在甲基纤维素克隆测试中测试克隆形成祖细胞的数量。

图3是柱状图，其显示了在来自CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高亚群的克隆形成培养物中获得的造血集落(CFU)总数。计算每一群的每1 x 10³ 个分选细胞的集落数量。展示的值是平均值± SEM; *: p < 0.05；N = 5。

图4是由与OP9细胞共培养的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高亚群形成的“鹅卵石”区域的两张显微照片的组。两张显微照片都是亮视野图。每一显微照片左下角的线条表示10 μm。显示了纺锤样形状的OP9细胞在培养板中形成饲养层。

图5是来自在OP9饲养细胞上扩增的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高亚群的克隆形成甲基纤维素测试中获得的集落的两张显微照片的组。两张照片均展示亮视野图。每一显微照片左下角的线条表示10 μm。

图6A和6B分别是柱状图和显微照片，其显示了从由ALDH^低 和ALDH^高CB-VSEL开始的克隆形成培养物获得的细胞的CD45表达。

图6A显示了通过流式细胞术分析的从由ALDH^低 和ALDH^高CB-VSEL开始的克隆形成培养物获得的细胞的CD45抗原表达。图6B显示了下述细胞的代表性图片：所述细胞从克隆形成培养物中的ALDH^低 CB-VSEL获得，并随后再铺板至单细胞培养物，针对CD45染色(TRITC)，并通过表面荧光显微镜术分析。左图和右图的比较显示了左图中由黑色箭头指示的CD45^-细胞，以及在右图中由白色箭头指示的几个CD45⁺细胞。左图中显示的比例线条表示10 μm，并且该比例尺对两个图是相同的。

图7是针对血型糖蛋白A(上图)或CD45(下图)染色的衍生自CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低和CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高 CB-VSEL的集落的一系列代表性表面荧光图片。以相同的放大倍数显示所有图片，以及比例线条表示10 μm。

图8A和8B是柱状图，其显示了CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高级份中与多能性状态和造血定型相关的基因的表达。

图8A显示了紧接着分离后CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高级份中与多能性状态和造血定型相关的基因的表达；以及图8B显示了与OP9细胞共培养及随后的克隆形成培养后CB-VSEL的ALDH^低 和ALDH^高级份中与多能性状态和造血定型相关的基因的表达。Y轴上的倍差数表示平均值(平均值± SEM)。*: 与总具核细胞(TNC)相比p < 0.05。

图9A是柱状图，其显示了可从TNC (裂解RBC后分离)和单核细胞 (MNC；Ficoll-Paque分离后) 级份中分离的CB-VSEL和HSC的绝对数量。以每1 ml经处理的CB表达数据。

图9B是柱状图，其显示了与HSC相比的CB-VSEL的大小和细胞核比细胞质之比(N/C比)。数值表示平均值± SEM. *: p < 0.05；N = 5。

图10A和1B是柱状图，其显示了CB衍生的CD45^-/CD133⁺/ALDH^高和CD45^-/CD133⁺/ALDH^低 VSEL在移植至经致死放射的NOD/SCID小鼠后体内测试的造血潜能，在移植4-6周后测试。

图10A是柱状图，其显示了CB衍生的CD45^-/CD133⁺/ALDH^高和CD45^-/CD133⁺/ALDH^低 VSEL对移植小鼠的周围血(PB)、脾(SP)和骨髓(BM)中的造血细胞的贡献。从鼠PB、BM和SP中CB衍生的VSEL亚群衍生得到的人造血CD45⁺水平在两个移植CB-VSEL级份之间是相当的：7.1 ± 2.9% (PB)、23.2 ± 0.2% (SP)和25.2 ± 1.0% (BM)。

图10B是柱状图，其显示了在NOD/SCID小鼠周围血中造血谱系重建的程度。CD3是T细胞标记物，CD19是B细胞标记物(尽管其还在滤泡树突状细胞上表达)、CD66b是粒细胞标记物，以及GlyA是红细胞谱系标记物。

图11是上胚层衍生的胚胎干细胞在成人组织中发育沉积(developmental deposition)的可能机制的示意图。VSEL在胎肝、BM和其他组织中的存在可由CXCR4⁺上胚层衍生的VSEL随SDF-1梯度的发育沉积来解释。胎肝可作为这些细胞迁移途径的重要交叉点。

图12显示了FL中各群体含量的流式细胞分析结果，显示了分析VSEL含量(Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞)的选通策略。

图13A和13B是柱状图，其分别显示了多能干细胞和组织定型干细胞的标记物表达，以及胎肝细胞在各个发育阶段的VSEL含量和VSEL-DS形成能力。Sca-1⁺Lin^-CD45^- FL衍生的细胞表达PSC的几种标记物，并且在与C2C12肌原细胞共培养时长成球形。数值表示从三个独立实验获得的平均值(平均值±SEM)。在每一实验中合并了来自15-20个胚胎的胎肝。

图13A是柱状图，其显示了与胎肝细胞单核细胞相比较时，分选的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- FL衍生的细胞级份中表征多能干细胞(PSC)和组织定型干细胞(TCSC)的几个基因的mRNA的表达分析。在受精后不同的时间点进行分析。

图13B是柱状图，其显示了Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- FL-衍生的细胞百分比含量与从分选的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 体外培养的VSEL衍生的球体(VSEL-DS)绝对数量的关于总FL细胞的关系。

图14是FL衍生的VSEL含量和形态的一系列IMAGESTREAM® System (ISS)分析。用Sca-1特异的抗体(与FITC缀合)、Lin标记物特异的抗体(每一个与PE缀合)、以及CD45特异的抗体(与PE-Cy5™缀合)染色FL衍生的细胞，用多聚甲醛溶液(2%)固定，用TRITON™ X (0.01%)透化，并通过ISS分析。图14显示了在15.5 dpc的FL中基于它们的大小和抗原性模式鉴定Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞。左上图根据它们的形态学参数显示了所有经分析的对象，所述参数包括在亮视野中的细胞核面积和长宽比。基于亮视野细胞图，作为细胞短轴(宽)对长轴(高)之比计算长宽比(圆的，非伸长的细胞拥有接近1.0的长宽比，而伸长的细胞或团块具有更低的长宽比)。使具有DNA内容物的圆的单细胞包括在区R1中，并进一步分析CD45表达。对来自区R2的CD45^-细胞分析Lin标记物表达，并将Lin^-/CD45^-细胞封入区R3中。然后基于Sca-1表达显现来自这一区域的细胞，并使Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 包括在区R4中。

图15是两张照片，其概述了胎肝中Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞(黑菱形) 和Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL (灰圆圈；左图) 以及Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ HSC (右图)在dpc 12.5、15.5和17.5天绝对数量的改变。

发明详述

当移植至合适的受体时，原始LT-HSC可保持长期的造血作用。尽管已经实验地证实了这些细胞的存在，但此类细胞的表型以及因此的特定分离仍然是有争议的。

越来越多的证据表明BM含有多能(P)SC群，其可产生LT-HSC (Kucia等，(2006) Leukemia 20:857-869)。最近，在分析鼠BM期间，发现了稀有(BM 单核细胞(MNC)的-0.01%)且极小(约2-4 μm) 的Sca-1⁺/lin^-/CD45^- 细胞同质群，所述细胞表达PSC标记物诸如SSEA-1、Oct-4、Nanog和Rex-1，以及高表达Rif-1端粒酶蛋白(Kucia等， (2006) Leukemia 20:857-869)。直接电子显微镜分析揭示这些细胞表现出初级上胚层衍生的ESC典型的几种特征，诸如由一窄环细胞质包围的大细胞核，以及开放型染色质(常染色质)。在与C2C12鼠肉瘤支持饲养层共培养时，这些细胞长成由具有含常染色质的大细胞核的未成熟CXCR4⁺/SSEA-1⁺/Oct-4⁺细胞组成的球体。当铺板至促进组织分化的培养物时，这些细胞显示出多能性并扩增为来自所有三个胚细胞层的细胞。基于这点，将这些细胞称为极小胚胎样(VSEL)SC (也参见PCT国际专利申请公开WO 2007/067280 和2009/059032号)。

本文公开的是集中在这些细胞的造血分化上的研究。据信VSEL可能是BM中最原始的PSC群，以及它们能够沿着造血谱系分化并产生LT-HSC。如本文所提出的那样，从BM中新鲜分离的VSEL不拥有即刻的造血活性；它们不会长成造血集落，也不能辐射防护经致死辐射的受体。然而，若将CD45^- VSEL铺在支持OP9细胞系上，它们产生CD45⁺/CD41⁺/Gr1⁺/Ter119⁺细胞集落。这些细胞的表型类似于从建立的胚胎细胞系体外衍生的最早造血细胞的那些。VSEL的这一造血分化伴随着几种调节造血作用的基因(例如，PU-1、c-myb、LMO2和Ikaros)mRNA的上调。更重要的是，当移植至野生型(WT)动物时，CD45+/CD41^-/Gr-1^-/Ter119^- 细胞扩增自从GFP⁺ 小鼠分离的VSEL。这些保护WT免受致死辐射，并在体内分化为所有主要的造血谱系(例如，Gr-1⁺、B220⁺和CD3⁺ 细胞)。在移植至第二受体后，这一造血活性得以保持。基于这点，似乎VSEL是能产生LT-HSC的PSC，并且CD45⁺细胞可衍生自CD45^- 群。

I. 定义

尽管相信以下术语对本领域技术人员人员而言能很好的理解，但提出了以下的定义以帮助当前公开的主题的解释。

除非下面另外定义，本文所用的所有技术和科学术语，意图具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的含义。本文所用的技术参考文献意图指本领域通常理解的技术，包括对于本领域技术人员显而易见的那些技术的变体或等效技术的替换。尽管相信以下术语对本领域技术人员人员而言能很好的理解，但提出了以下的定义以帮助当前公开的主题的解释。

根据长期存在的专利法惯例，术语“一”、“一个”及“该(这)”用在这个申请(包括权利要求书)中时是指“一个或更多个”。例如，短语“一个细胞”指的是一个或更多个细胞，包括但不限于多个相同的细胞类型或多个不同的细胞类型。类似地，当在本文中用于指示实体时，短语“至少一个”例如是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更多个该实体，包括但不限于1至100以及超过100的整数值。

除非以其他方式指出，在说明书和权利要求中使用的表达组分量、反应条件等的所有数值均理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。当提及可测量值诸如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，本文使用的术语“约”意味着包括在某些实施方案中从该特定量±20%、在某些实施方案中±10%、在某些实施方案中±5%、在某些实施方案中±1%、在某些实施方案中±0.5%以及在某些实施方案中±0.1%的变化量，因为此类变化量适于实现本发明的方法。因此，除非相反的指出，否则在这一说明书和所附权利要求中提出的数值参数是可根据寻求由当前公开的主题获得的期望性质而不同的近似值。

当在一列实体的上下文中使用时，本文所使用的术语“和/或”是指单个或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括单个的A、B、C和D，但还包括A、B、C和D的任意和所有组合。

术语“包括”与“包含”、“含有”、“其特征在于”同义，为包括在内的或开放式的，并且不排除其他的、未列出的元件和/或方法步骤。“包括”是领域术语，其意味着存在所列举的元件和/或步骤，但可添加其他元件和/或步骤，并且仍然落入相关主题的范围之内。

本文所使用的短语“由……组成”排除没有具体列出的任何元件、步骤或组分。例如，当在权利要求文本中的分句中出现，而非紧接前序部分时，短语“由……组成”仅限于该分句中阐述的元件；其他元件不从作为一个整体的该权利要求中排除。

本文所使用的短语“基本上由……组成”将相关公开内容或权利要求的范围限制在具体指定的材料和/或步骤，加上不会实质上地影响该公开的和/或要求保护的主题基础和新颖特征的那些。例如，药物组合物“可基本上由”药物活性剂或多个药物活性剂“组成”，其意味着所列出的药物活性剂是在该药物组合物中存在的唯一的药物活性剂。然而，应当注意，载体、赋形剂和其他非活性剂可以并很可能存在于该药物组合物中。

就术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”而言，当在本文中使用这三个术语之一时，当前公开的和要求保护的主题可包括使用其他两个术语的任一个。例如，当前公开主题在一些实施方案中涉及包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞的组合物。应当理解，当前公开的主题因此还包括在一些实施方案方案中基本上由CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞组成的组合物，以及在一些实施方案中由CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞组成的组合物。类似地，也应当理解，在一些实施方案中，当前公开的主题的方法包括本文公开的和/或权利要求中叙述的步骤，在一些实施方案中，当前公开的主题的方法基本上由本文公开的和/或权利要求中叙述的步骤组成，以及在一些实施方案中，当前公开的主题的方法由本文公开的和/或权利要求中叙述的步骤组成。

当在骨髓移植的上下文中使用时，本文所使用的短语“长期”是指一段时间，在这段时间中供体细胞或从其中衍生的后代细胞保持在供体中的活力和功能。当衍生自供体细胞的造血细胞施与后在一些实施方案中在受体中存在至少3个月、在一些实施方案中6个月、在一些实施方案中9个月、在一些实施方案中12个月以及在一些实施方案中超过12个月时，认为骨髓移植产生了长期的移植。

II ．分离脐带血细胞亚群的方法

在一些实施方案中，当前公开的主题提供了用于分离脐带血 (CB)细胞的CD133⁺/CD45^-/GlyA^-亚群的方法。在一些实施方案中，该方法包括(a)提供初始脐带血细胞群；(b)使所述初始细胞群与对CD133特异的第一配体(例如抗体)、对CD45特异的第二配体(例如抗体)以及对血型糖蛋白A(GlyA)特异的第三配体(例如抗体)在足以允许每个抗体与其在初始细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合的条件下接触；(c)选择CD133⁺、CD45^-且GlyA^-的细胞。

因此，在一些实施方案中，当前公开的主题提供了从CB细胞群分离CD45^-干细胞亚群的方法。在一些实施方式中，该方法包括(a)提供怀疑包含CD45^-干细胞的CB细胞群；(b)将所述CB细胞群与对CD45特异的第一抗体，对CD133特异的第二抗体接触，接触条件足以允许每个抗体与其在细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合；(c)选择为CD133⁺、并且CD45^-的CB细胞的第一亚群；(d)将所述CB细胞的第一亚群与对于一个或更多个细胞表面标记物特异的一个或更多个抗体在足以允许每个抗体与其在CB细胞群的每个细胞上的靶标(如果存在)结合的条件下接触，所述标记物选自包括而不限于CD45R/B220、Gr-1、TCRaβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119的组；(e)从所述CB细胞的第一亚群去除结合到步骤(d)的抗体的至少一个的那些细胞；以及(f)收集为CD133⁺/CD45^-/GlyA^-的CB细胞的第二亚群，由此分离CD45^-干细胞的亚群。

本文所使用的术语“CD45”是指酪氨酸磷酸酶，也称为白细胞共同抗原(LCA)，并具有基因记号PTPRC。这一基因相应于GENBANK®登记号NP_002829(人类)、NP_035340(小鼠)、NP_612516(大鼠)、XP_002829(狗)、XP_599431(牛)及AAR16420(猪)。另外的CD45同源物的氨基酸序列也存在于GENBANK®数据库中，包括那些来自几种鱼类和几种非人类灵长类的那些。

本文所使用的术语“CD34”指的是存在于一些造血和非造血干细胞上的细胞表面标记物，并具有基因记号CD34。GENBANK®数据库披露了来自人类(例如，AAB25223)、小鼠(NP_598415)、大鼠(XP_223083)、猫(NP_001009318)、猪(MP_999251)、牛(NP_776434)及其它的CD34的氨基酸和核酸序列。

在小鼠中，一些干细胞还表达干细胞抗原Sca-1(GENBANK®登记号NP_034868)，也称为淋巴细胞抗原Ly-6A.2。

本文所使用的术语“CD133”是指存在于一些造血干细胞、内皮祖细胞、成胶质细胞瘤、神经元和神经胶质干细胞以及一些其他细胞类型上的细胞表面标记物。其还称为Prominin 1 (PROM1)。GENBANK®数据库披露了来自人类(例如，NM_006017和NP_006008)、小鼠(NM_008935和NP_032961)、大鼠(NM_021751 和NP_068519)和其他的CD133核酸及氨基酸序列。

本文所使用的术语“GlyA”是指血型糖蛋白A，其为存在于红细胞上的细胞表面分子。GENBANK®数据库披露了来自人类(例如，NM_002099和NP_002090)、小鼠 (NM_010369和 NP_034499)和其他的GlyA核酸和氨基酸序列。

因此，CD45^-干细胞的亚群表示存在于分离步骤前的细胞群中的CD45^-细胞的亚群。在一些实施方式中，CD45^-干细胞的亚群来自人类，并且是CD34⁺/lin^-/CD45^-。在一些实施方式中，CD45^-干细胞的亚群来自小鼠，并且是Sca-1⁺/lin^-/CD45^-。

所公开的亚群的分离可以利用可以基于CD45、CD133、GlyA、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R/B220、Gr-1、TCRaβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119标记物的一种或多种的表达或表达缺乏来分离细胞的任何方法进行，包括但不限于荧光活化的细胞分选(FACS)。

本文所使用的lin^-指的是不表达下列标记物的任何一种的细胞：CD45R/B220、Gr-1、TCRaβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119。这些标记物存在于下述细胞上：从早期Pro-B到成熟B细胞的B细胞谱系的细胞(CD45R/B220)；骨髓谱系的细胞，诸如在骨髓发育期间的单核细胞、骨髓粒细胞及外周中性白细胞(Gr-1)；胸腺细胞、外周T细胞及肠上皮内皮淋巴细胞(TCRaβ和TCRγδ)；骨髓细胞、NK细胞、一些活化的淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞、B1细胞及树突细胞的亚类(CD11b)；以及成熟的红细胞和红细胞系前体细胞(Ter-119)。

所述分离步骤可以作为一系列步骤以逐步方式或同时进行。例如，每个标记物的存在或缺乏可以单独地评估，在每个步骤基于是否存在单独的标记物产生两个亚群。此后，感兴趣的亚群可以被选择并基于下一标记物的存在或缺乏而被进一步分开。

可选地，所述亚群可以通过仅分离出具有特定标记物模式的那些细胞而产生，其中短语“标记物模式(marker profile)”指的是两种或更多种标记物的存在或缺乏的总结。例如，混合的细胞群可以含有CD133⁺和CD34 ^-细胞。类似地，相同的混合细胞群可以含有CD45⁺和CD45^-细胞。因此，这些细胞中的一些将是CD133⁺/CD45⁺，另一些将是CD133⁺/CD45^-，另一些将是CD133^-/CD45⁺，其它将是CD133^-/CD45^-。这些标记物的单独的组合的每种代表不同的标记物模式。随着另外的标记物被加入，所述模式可以变得更复杂，并且对应最初的混合细胞群中越来越小的百分比。在一些实施方式中，当前公开的主题的细胞具有CD133⁺/CD45^-/GlyA^-的标记物模式。

在当前公开的主题的一些实施方案中，对由感兴趣的细胞类型表达的标记物(诸如，在CD133⁺/CD45^-/GlyA^-细胞的表面上表达的多肽)特异的抗体用于分离和/或纯化具有感兴趣的标记物模式的BM细胞的亚群。应当理解基于感兴趣的标记物模式，所述抗体可以用于阳性或阴性地选择群体的级份，其在一些实施方式中随后被进一步分级分离。

在一些实施方式中，采用具有不同特异性的多个抗体、抗体衍生物、和/或抗体片段。在一些实施方式中，每个抗体、或其片段或衍生物，对选自包括而不限于CD133、CD45、GlyA、Ly-6A/E (Sca-1)、CD34、CXCR4、AC133、CD45、CD45R、B220、Gr-1、TCRαβ、TCRγδ、CD11b、Ter-119、c-met、LIF-R、SSEA-1、Oct-4、Rev-1和 Nanog的组的标记物是特异性的。在一些实施方式中，分离和/或纯化表达一个或更多个选自包括但不限于SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog的组的基因的细胞。

当前公开的主题涉及细胞群，其在一些实施方式中表达下述抗原：CXCR4、AC133、CD34、SSEA-1(小鼠)或SSEA-4(人类)、胎儿碱性磷酸酶(AP)、c-met及LIF-受体(LIF-R)。在一些实施方式中，当前公开的主题的细胞不表达下述抗原：CD45、谱系标记物(即，细胞为lin^-)、GlyA、HLA-DR、 I类MHC、CD90、CD29及CD105。因此，在一些实施方式中，当前公开的主题的细胞可以被表征如下：CXCR4⁺/CD133⁺/CD34⁺/SSEA-1⁺ (小鼠)或SSEA-4⁺(人类)/AP⁺/c-met⁺/LIF-R⁺/CD45^-/lin^-/HLA-DR^-/ I类MHC ^-/ GlyA^-/CD90^-/CD29^-/CD105^-。

应当理解，为了分离具有期望标记物模式(例如，CD133⁺/CD45^-/GlyA^-)的细胞亚群，可以任何方便的组合，同时或反复地使用基于相关标记物的表达来用于分离细胞的配体(例如，抗体)。例如，可同时、以任意组合、或以任何顺序单独地使用与CD133、CD45和GlyA结合的抗体，以便于分离期望的亚群。

在一些实施方式中，每个抗体、其片段或衍生物包括可检测的标签。结合于不同标记物的不同的抗体、或其片段或衍生物可以包括不同的可检测标签或可以采用相同的可检测标签。

各种可检测标签对于本领域技术人员是公知的，用于将可检测标签结合到生物分子诸如抗体和其片段和/或衍生物的方法也是公知的。本文所使用的短语“可检测标签”指的是可以加入到抗体、或其片段或衍生物的任何部分，其允许抗体的检测。代表性的可检测部分包括但不限于：共价附着的生色团、荧光部分、酶、抗原、具有特异反应性的基团、化学发光部分及电化学可检测的部分等。在一些实施方案中，抗体被生物素化。在一些实施方式中，利用第二抗体检测生物素化的抗体，所述第二抗体包括亲和素或链霉亲和素基团并且还缀合于包括但不限于Cy3、Cy5及Cy7的荧光标签。在一些实施方式中，抗体、其片段或衍生物用荧光标签诸如Cy3、Cy5、或Cy7直接标记。在一些实施方式中，所述抗体包括生物素-缀合的大鼠抗-小鼠Ly-6A/E(Sca-1；克隆E13-161.7)、链霉亲和素-PE-Cy5缀合物、抗-CD45-APCCy7(克隆30-F11)、抗-CD45R/B220-PE(克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1-PE(克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβ PE(克隆H57-597)、抗-TCRγδ PE(克隆GL3)、抗-CD11b PE(克隆M1/70)及抗-Ter-119 PE(克隆TER-119)。在一些实施方式中，所述抗体、片段、或其衍生物用荧光标签直接标记，并且通过荧光激活细胞分选术分离结合于抗体的细胞。另外的检测策略对于本领域技术人员是公知的。

虽然FACS扫描是用于纯化细胞亚群的便利方法，但是应当理解也可以采用其它方法。可以采用的示例性方法是采用特异性结合于CD45、CXCR4、CD34、AC133、Sca-1、CD45R/B220、Gr-1、TCRaβ、TCRγδ、CD11b和Ter-119的一种或多种的抗体，所述抗体包含这样的部分(例如生物素)，对于所述部分高亲和力结合试剂是可获得的(例如亲和素或链霉亲和素)。例如，生物素部分可以附着于对于每种标记物的抗体，对于所述标记物，在细胞表面上的存在是所期望的(例如，CD34、Sca-1、CXCR4)，并且具有结合的抗体的细胞群可以与包含亲和素或链霉亲和素部分的亲和试剂接触(例如，包含亲和素或链霉亲和素的柱)。回收结合于柱的那些细胞，并按预期的进一步分级分离。可选地，结合于所述群中要去除的那些细胞上存在的标记物(如，CD45R/B220、Gr-1、TCRaβ、TCRγδ、CD11b及Ter-119)的抗体可以用生物素标记，可回收不与亲和试剂结合的细胞，并进一步纯化。

还应理解可在纯化过程的一个或更多个步骤中一起采用不同的分离技术(诸如亲和纯化和FACS)。

在一些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物还表达选自包括但不限于c-met、c-kit、LIF-R及其组合的组的标记物。在一些实施方式中，所公开的分离方法进一步包括分离为c-met⁺、c-kit⁺、和/或LIF-R⁺的那些细胞。

在一些实施方案中，VSEL干细胞或其衍生物还表达SSEA-1、Oct-4、Rev-1及Nanog，并且在一些实施方案中，所公开的分离方法进一步包括分离表达这些基因的那些细胞。

在一些实施方案中，基于醛脱氢酶(ALDH)的表达对当前公开的主题的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞群进一步进行分离。例如，可应用配体ALDEFLUOR® (STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada)基于ALDH染色来分离CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞。如此，当前公开的方法在一些实施方案中还可包括从CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞中分离ALDH^高细胞，从CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞中分离ALDH^低细胞，或分别从CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞中分离ALDH^高细胞和ALDH^低细胞。

当前公开的主题还提供了分离的干细胞群，其中所述分离的干细胞群包含基本上纯化的分离自脐带血(CB)的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 细胞。该分离的干细胞群可包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低细胞、CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低细胞或其组合。

含有当前公开的主题的CD133⁺/CD45^-/GlyA^-细胞的细胞群可以从任何受试者或从含有它们的受试者内的任何来源分离。在一些实施方式中，所述细胞群包括骨髓样品、脐带血样品、 外周血样品、或胎肝样品。在一些实施方案中，在用足以将CD45^-干细胞从骨髓迁移到受试者的外周血的量的迁移剂处理受试者后，从受试者的骨髓分离所述细胞群。本文所使用的短语“迁移剂”指的是这样的化合物(例如，肽、多肽、小分子、或其它试剂)，其在给予受试者时导致VSEL干细胞或其衍生物从受试者的骨髓迁移到外周血。换句话说，将迁移剂给予受试者导致受试者外周血中存在比在即将给予迁移剂之前存在于其中的数量增加的VSEL干细胞和/或VSEL干细胞衍生物。然而，应当理解迁移剂的效果不需要是即时的，通常包括延迟时间，在此期间迁移剂作用于受试者中的组织或细胞类型以便产生其效果。在一些实施方案中，所述迁移剂包括粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗剂(例如，T140肽；Tamamura等(1998)253 Biochem BiophysRes Comm 877-882)的至少一种。

当前公开的主题还提供了通过当前公开的方法分离的CD45^-干细胞群。

III. 用于施与受试者的方法和组合物

III.A. 方法

当前公开的主题还提供了用于在受试者中种群恢复细胞类型的方法。在一些实施方案中，该方法包括以一定的量和通过一定的途径给受试者施与在可药用载体中包含多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的组合物，所述量和途径足以允许CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受试者中种群恢复细胞类型。在一些实施方案中，该细胞类型是造血细胞。在当前公开的方法的一些实施方案中，该多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞包含分离自脐带血的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞。在一些实施方案中，该靶部位包括受试者的骨髓。

因此，在一些实施方案中，当前公开的主题还提供了用于骨髓移植的方法。在一些实施方案中，该方法包括给至少部分地缺乏骨髓的受试者施与包含有效量的分离自所述细胞来源(例如，脐带血、骨髓、外周血和/或胎肝)的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的药物制备物，其中该有效量包含分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以移入受试者骨髓的量。

在阅读了当前公开内容后，骨髓移植将是本领域普通技术人员一般公知的技术。几个已经公开美国和其他专利及专利申请描述了标准技术的变化。简而言之，将接受骨髓移植(BMT)的受试者一般进行一系列的预治疗，所述预治疗经设计以准备接受所施与的细胞的骨髓空间。这些预治疗可包括但不限于，经设计以抑制受试者免疫系统从而使得供体和受体不是组织可相容时移植物不会受到排斥，以及在骨髓中产生空间以允许施与的细胞移入的治疗。示例性的产生空间的预治疗包括暴露于破坏所有或部分骨髓的化疗，以及全身放射(TBI)。

如此，在一些实施方案中，当前公开的主题提供了这样的方法，其中至少部分地缺乏骨髓的受试者经历了至少部分地减少该受试者骨髓的预治疗。本文所使用的短语“至少部分地缺乏骨髓的受试者”是指接受了脊髓抑制治疗或脊髓减少治疗的受试者，其每一个均消除受试者中至少部分骨髓。脊髓抑制和脊髓减少治疗是本领域普通技术人员公知的，并且可包括免疫治疗、化疗、放疗或其组合。

III.B. 组合物

一旦受试者经历了合适的预治疗(若需要的话)，则施与包含当前公开的主题的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 干细胞分离群的组合物。在一些实施方案中，该组合物在可药用载体(任选地，对人使用而言是可药用的载体)中包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 干细胞。

在一些实施方案中，施与新鲜分离的当前公开主题的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 干细胞，尽管也可使用冷冻细胞。用于冷冻保存用于施与受试者的干细胞的方法是本领域普通技术人员公知的。

在一些实施方案中，在饲养细胞层的存在下共培养当前公开主题的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- 干细胞，以提高该细胞移入受试者和/或在受试者中产生血细胞的效率。在一些实施方案中，饲养细胞层包含OP9细胞。

III.B.1 ．制剂

当前公开的主题的组合物在一些实施方案中包括包含载体的组合物，尤其是可药用载体，诸如但不限于人类中可药用的载体。任何合适的药物制剂可以用于制备用于施与受试者的组合物。

例如，合适的制剂可以包括含水和无水无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌抗生素、以及使该制剂与预定的受者的体液等渗的溶质。

应当理解，除了上面特别提及的成分，当前公开的主题的制剂还可包含本领域中关于讨论的制剂类型的常见的其它试剂。例如，可以使用无菌不含致热原的含水和无水溶液。

当前公开的主题的治疗方法和组合物可以与其他的佐剂或生物反应修饰剂一起使用，所述修饰剂包括但不限于细胞因子和其它免疫调节化合物。

III.B.2 ．施与

用于施与当前公开的主题的组合物的合适的方法包括但不限于静脉内施与和直接递送到靶组织或器官。在一些实施方案中，施与方法包括用于细胞在靶部位(例如，骨髓)区域化递送或聚集的特征。在一些实施方案中，所述细胞被直接递送入靶部位。在一些实施方案中，通过细胞的静脉内注射完成当前公开主题的细胞的选择性递送，其中它们靶向(home to)靶部位并移入其中。

III.B.3 ．剂量

有效剂量的当前公开主题的组合物被施与有需要的受试者。“治疗有效量”或“治疗量”是足以产生可测量的反应(例如，被治疗的受试者中的生物或临床相关反应)的治疗组合物的量。可以改变当前公开主题的组合物中的活性成分的实际剂量水平以便施与可以有效实现对于特定受试者的期望治疗反应的活性化合物的量。所选的剂量水平将依赖于治疗组合物的活性、施与途径、与其他药物或治疗的组合、要治疗的状况的严重性、以及要治疗的受试者的状况和先前医疗史。然而，化合物的开始剂量在低于实现期望的治疗效果所需的水平，并逐渐提高剂量直到实现期望的效果，这在本领域的技术范围内。组合物的效能可以变化，因此“治疗有效量”可以变化。然而，利用本文所述的实验方法，本领域技术人员可以容易地评估当前公开主题的候选化合物的效能和功效并因而调整治疗方案。

在阅览本文呈现的当前公开主题的公开内容后，考虑特定剂型、所述组合物所用的施与方法及要治疗的特定疾病，本领域的普通技术人员可以调整给予个体受试者的剂量。剂量的进一步计算可以考虑受试者的身高和体重、症状的严重性和阶段及另外的有害身体状况的存在。这样的调整或改变，以及何时和怎样进行这样的调整或改变的评估对于医药领域中的普通技术人员是熟知的。

IV ．其他应用

当前公开的主题还提供了用于诱导CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的方法。本文所使用的短语“造血能力”是指CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞(或其后代细胞)分化为造血细胞(例如，终端分化造血细胞)的能力。该短语因此包括单个细胞能够种群恢复受试者的效率(例如，如由施与受试者以便使该受试者获得临床相关益处所需的最小细胞数测得)，以及该细胞在受试者中产生临床相关益处所需的时间。在一些实施方案中，当前公开主题的细胞的造血能力包括在受试者中提供骨髓长期移入的能力。

如本文所公开，CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞可显示出不同的造血能力，在一些实施方案中，其基于分离该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的来源，以及该细胞可能接受的任何预处理(例如，与OP9细胞共培养)。因此，在一些实施方案中，当前公开的主题的方法包括(a)提供CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞；以及(b)在饲养层(例如，OP9饲养层)的存在下共培养CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以诱导该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的时间。

此外，当前公开的方法可采用的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是骨髓衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、脐带血衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、或其组合。此外，该CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低干细胞、CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞，或其组合。

V. 细胞培养系统

在一些实施方案中，当前公开的主题还提供了包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的细胞培养系统。在一些实施方案中，该细胞培养系统还包含饲养细胞层，任选OP9细胞饲养层。

实施例

下面的实施例提供了示意性的实施方案。根据本发明披露的内容和本领域的一般技术水平，本领域的技术人员将认识到下面的实施例仅是示例性的并且可以采用各种变化、修改及改变而不偏离当前披露的主题的范围。

实施例 1-4 中使用的材料和方法

最近，在脐带血(CB)中鉴定了原始的极小胚胎样干细胞(VSEL)群。这些CB-VSEL干细胞(i)尺寸极小(< 6 µm；通常为2-4 μm)；(ii)是SSEA-4⁺/Oct-4⁺/CD133⁺/CXCR4⁺/Lin^-/CD45^-的；(iii)对基质衍生的因子1(SDF-1)梯度强烈的反应；以及(iv)拥有相对大的含有原始常染色质的细胞核(Kucia等，(2007) Leukemia 21:297-303; PCT 国际专利申请公开号WO 2007/067280和2009/059032；其全文通过引用并入本文)。在本公开内容之前，CB衍生的CD133⁺/Lin^-/CD45^- VSEL潜在的造血能力是未知的。

从健康供体收集脐带血(CB)样本。通过应用氯化铵低渗溶液的裂解去除红细胞(RBC)，导致CB-VSEL的最佳回收。

针对CD133对总CB具核细胞(TNC)染色，并且然后通过应用AUTOMACS™ 系统(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, California, 美利坚合众国；参见附图1)的磁性细胞分选(MACS)从而分离CD133⁺细胞。

随后用检测ALDH的ALDEFLUOR®试剂(STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia，加拿大)染色CD133⁺级份，随后CD45及血型糖蛋白A(GlyA)免疫标记，以及复染CD133用于进一步分离。通过应用MOFLO™分选仪(Beckman Coulter, Inc. Miami, Florida, 美利坚合众国；参见图1B)，通过荧光激活细胞分选术(FACS)分离CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 和 CD133-/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高 CB-VSEL亚群。

在第一步中，通过在补充有造血生长因子(IL-3、GM-CSF、SCF、EPO、Flt-3和TPO)的甲基纤维素中的克隆形成分析来测试CB-VSEL的两个新鲜分离的级份，以鉴定造血能力。然后，将CB-VSEL的两个亚群在OP9基质细胞上培养5天，并随后转移至补充有生长因子的甲基纤维素上。培养7天后计算集落的数量(参见图2)。

通过实时RT-PCR确定新鲜分离的CB-VSEL和在OP9细胞上扩增的CB-VSEL衍生的细胞中与多能性或造血定型相关的基因表达水平(Oct-4、C-myb、HoxB-4和LMO-2)。

实施例1

新鲜分离的 CB-VSEL 没有显示出造血潜能，但在 OP9 细胞上共培养后可变为造血的

应用克隆形成分析体外测试新鲜分离的CB-VSEL的造血潜能。新鲜分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 和 CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高 CB-VSEL均不能在体外长成造血集落(参见图3)。

然而，当将新鲜分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL的任一级份(即，ALDH^低 或ALDH^高)在OP9基质细胞上共培养时，它们获得了体外造血潜能(参见图3和4)。ALDH^低 和ALDH^高CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL均形成类似于“鹅卵石”区域的初级集落，其是典型的长期造血干细胞(LT-HSC；参见图4)。有趣的是，ALDH^高CB-VSEL比ALDH^低CB-VSEL更快地形成此类集落。

随后将在OP9饲养层扩增的细胞转移至补充有造血生长因子的甲基纤维素中。与CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低衍生的群相比较，观察到由CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高衍生的细胞的集落形成的显著升高。CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低细胞的克隆形成活性在时间上也有延缓(参见图3)。从两个级份获得的此类集落的代表性亮视野图片显示于图5。

流式细胞术和表面荧光显微分析揭示了从由CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 和CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高 CB-VSEL起始的集落中收集的细胞获得了CD45的表达(参见图6)。类似地，从CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL的两个亚群起始的造血集落对几个造血标记物是阳性染色的，所述标记物包括GlyA和CD45(参见图7)。

实施例2

CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH ^低 CB-VSEL 在表达多能干细胞标记物的初级细胞亚群中富集

通过应用实时RT-PCR分析，确定了新鲜分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 CB-VSEL展示出与CB-衍生的 TNC相比较的119.5 ± 15.5倍高的水平的示例性多能干细胞标记物Oct-4的mRNA(参见图8A)。CB-VSEL的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高 亚群表达更高水平的与造血相关的基因，诸如C-myb(与CB-衍生的 TNC相比时差80.2 ± 27.4倍；参加图8A)。

在OP9细胞上共培养后，ALDH^低 CB-VSEL中Oct-4的表达下降(与ALDH^高 CB-VSEL仅差1.9 ± 1.1倍)，而几种造血基因的表达升高(参见图8B)。

实施例3

在 CB 单位的常规处理期间发生 CB-VSEL 的丧失

通过应用流式细胞分析，确定了显著部分(42.5 ± 12.6%)的CD133⁺/Lin^-/CD45^- CB-VSEL会在CB单位的储存和/或冷冻的常规制备期间丧失。在Ficoll-Paque梯度上离心后，也观察到类似的效应(参见图9A)，可能是由于CB-VSEL不寻常的小尺寸和高密度所致。图9B显示了CB-VSEL由通过ImageStream™系统分析的比HSC更小的尺寸和更高的N/C比来表征。

实施例4

CB 衍生的 VSEL 在移植的 NOD/SCID 小鼠中对造血谱系的贡献

在移植至经致死辐射的NOD/SCID小鼠后，在体内测试CB衍生的VSEL的造血潜能(参见图10A和10B)。

移植4-6周后，CD45^-/CD133⁺/ALDH^高和CD45^-/CD133⁺/ALDH^低VSEL均在测试的经致死辐射的NOD/SCID小鼠中产生人淋巴-造血嵌合现象。在两个移植的CB-VSEL级份中，鼠周围血(PB)、骨髓(BM)和脾(SP)中人类造血CD45⁺ 细胞的水平是相当的：PB 中7.1 ± 2.9% ； SP 中23.2 ± 0.2% ；以及BM中 25.2 ± 1.0% 。这一数据提示新鲜分离的CD45^- CB-VSEL从克隆形成祖细胞中耗尽，但是在原始HSC中高度富集。

基于本文公开的体外和体内数据，CB中的造血干细胞从更原始至更分化的以下层次是显而易见的：CD45^-/CD133⁺/ALDH^低；CD45^-/CD133⁺/ALDH^高；CD45⁺/CD133⁺/ALDH^低；以及然后是 CD45^-/CD133⁺/ALDH^高。本文呈现的数据还提示人CB衍生的CD45^- VSEL代表极原始的长期种群恢复的HSC(LT-HSC)群。

并且最终，确定了当前采用的常规CB处理策略会导致不期望的多达约50%的CB-VSEL的损失，提示此类策略负面地影响了CB分离物作为LT-HSC来源的总效率。

实施例 1-4 的讨论

当在OP9基质细胞上扩增/共培养时，ALDH^低 和ALDH^高CD133⁺/GlyA^-/CD45^- CB-VSEL变成造血的。两个级份均形成 “鹅卵石”区域，其含有能够生长为造血集落的细胞。

CB-VSEL的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 级份在多能干细胞的标记物中富集，并且展示出延缓的克隆形成能力，其在体外培养期间是延长且持久的。

基于通过在Ficoll-Paque梯度上的离心从而消除红细胞(RBC)或在储存/冷冻之前减少体积的CB处理方法能导致CB-VSEL的显著丧失。

CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低 极小CB衍生的MNC表达VSEL标记物并且展示出低的ALDH活性，其对于最原始的LT-HSC 群是富集的。

这一群可在CB衍生的细胞的长期移植中起作用，并且能够提供可用于HSC扩增的细胞的来源。

实施例 5-8 的材料和方法

动物。这些公开的实验按照美国肯塔基路易斯维尔的路易斯维尔大学实验机构动物管理和使用委员会(Laboratory Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the University of Louisville, Louisville, Kentucky, United States of America) 的指引进行，并且遵守美国国立卫生研究院发布的实验室动物管理和使用规程(NIH 公开No.85-23，1996年修订)。

分离 FL 细胞用于 FACS 分选和分析。交配后12.5天(dpc)、15.5 dpc和17.5 dpc从C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, 美利坚合众国)胚胎分离胎肝细胞。在每一实验中合并来自15-20个胚胎的胎肝。机械破碎组织，洗涤释放的细胞，并过滤通过40 μm滤器。随后应用1x BD PHARMLYSE™ (BD PHARMINGEN™, San Jose, California, 美利坚合众国)裂解红细胞。获自每一肝的具核细胞总数应用血细胞计数器计算得到，并且用于计算肝脏中检测群的绝对数量。进一步在含有2%胎牛血清(FBS)的培养基中测试新鲜分离的细胞的CD45、造血谱系标记物(Lin)和Sca-1的表达30分钟。下面的大鼠抗小鼠抗体(获自BD PHARMINGEN™, San Jose, California, 美利坚合众国)用于染色分离的细胞：抗-CD45(克隆30-F11；与APC-Cy7™缀合，所述 APC-Cy7™是由与花青染料Cy7™偶联的异藻蓝蛋白 (APC)组成的双发光团)、抗-CD45R/B220 (克隆RA3-6B2，与藻红蛋白 (PE)缀合)、抗-Gr-1 (克隆RB6-8C5，与PE缀合)、抗-TCRαβ (克隆H57-597，与PE缀合)、抗-TCRγδ (克隆 GL3，与PE缀合)、抗-CD11b (克隆M1/70，与PE缀合)、抗-Ter119 (克隆TER-119，与PE缀合) 以及抗-Ly-6A/E (Sca-1; 克隆E13-161.7，与生物素缀合，并通过与 PE-Cy5™缀合的链霉亲和素检测)。应用同种型对照估测阳性群。染色后，洗涤细胞，重悬于含有10% FBS的RPMI培养基中，并应用MOFLO™ 细胞分选仪(Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida, 美利坚合众国)进行分选。

根据之前描述的用于从鼠骨髓分离VSEL的策略(Zuba-Surma等，(2008) J Cell Mol Med 12:292-303)以5000至10,000细胞/秒的分选事件速率进行分选。简而言之，在第一步中通过显示出向前散射(FSC) vs. 侧面散射(SSC)信号的点图显现细胞，所述信号分别与细胞的大小和粒度/复杂度相关。在与具有1、2、4、6、10和15 µm 标准直径的6种不同尺寸的珠粒(可从INVITROGEN™, a division of Life Technologies Corp., Carlsbad, California, 美利坚合众国，获得的流式细胞尺寸珠)比较后，选择无颗粒的(agranular)、2 - 10 µm的小事件用于分选。分析这些小细胞的Sca-1和谱系标记物的表达，将Sca-1⁺/Lin^- 事件包括在内用于分选，并根据CD45表达将其进一步分为两个群：Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞(VSEL) 和Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ 细胞(HSC)。参见Zuba-Surma等，(2008) J Cell Mol Med 12:292-303。

IMAGESTREAM® 系统 (ISS) 分析。如上文针对FACS分选和分析所描述的那样分离并处理胎肝组织。简而言之，在机械消化组织并应用1x BD PharmLyse™ 缓冲液(BD Pharmingen™)裂解红细胞(RBC)后，获得具核FL衍生的细胞的完整群。然后针对CD45表达、Lin标记物表达以及Sca-1抗原的表达染色细胞。基于ISS可用的检测通道，应用以下抗小鼠抗体用于染色：大鼠抗CD45 (PE-Cy5™-缀合的克隆30-F11；eBioscience, San Diego, California, 美利坚合众国)；“谱系混合物”(BD PHARMINGEN™, San Jose, California, 美利坚合众国, 其包含抗-CD45R/B220 (PE-缀合的克隆RA3-6B2)、抗-Gr-1 (PE-缀合的克隆RB6-8C5)、抗-TCRαβ (PE-缀合的克隆 H57-597)、抗-TCRγδ (PE-缀合的克隆GL3)、抗-CD11b (PE-缀合的克隆M1/70)、抗-Ter119 (PE-缀合的克隆TER-119))；以及抗-Ly-6A/E (Sca-1；异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的克隆E13-161.7；BD PHARMINGEN™)。染色后洗涤细胞，用4%多聚甲醛固定20分钟，并用0.1% TRITON® X-100溶液透化10分钟。分析前5分钟加入7-氨基放线菌素D(7-AAD；INVITROGEN™; 40µM)以显现细胞核，进一步获得样本并应用IMAGESTREAM® 系统100 (Amnis Corporation, Seattle, Washington, 美利坚合众国)分析。参见Basiji等，(2007) Clin Lab Med 27:653-670; Zuba-Surma等，(2007a) Folia Histochem Cytobiol 45:279-290；Zuba-Surma等， (2007b) Adv Cell Biol 34:361-375。

为鉴定胚胎表面标记物SSEA-1阳性染色的SSEA-1⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-亚群，最初在10%驴血清(Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania, 美利坚合众国)的存在下温育细胞，以封闭二抗的非特异性结合位点，随后在37℃用一抗抗鼠SSEA-1抗体(鼠IgM; Chemicon Int., Temecula, California, 美利坚合众国；1:200)染色2小时。洗涤后加入与FITC缀合的二抗(多克隆驴抗-小鼠IgM；Jackson Immunoresearch)。在37℃温育细胞2小时，然后洗涤，用直接缀合的抗Sca-1 (PE-Cy5™)、CD45 (PE)和Lin (PE)抗体染色。将染色的细胞重悬于PBS中用于进一步分析。在分析前5分钟加入7-AAD，并在ISS 100上直接运行样本。

为检测细胞核内Oct-4并鉴定Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 群，最初用4%多聚甲醛固定新鲜分离的细胞20分钟，然后用0.1% TRITON® X-100溶液透化10分钟。洗涤细胞，在10%驴血清(Jackson Immunoresearch)的存在下温育，并在37℃用一抗抗鼠Oct-4 抗体 (小鼠单克隆 IgG；Chemicon Int.；1:200)染色2小时。洗涤后加入与FITC缀合的二抗(多克隆驴抗-小鼠IgG；Jackson Immunoresearch)。在37℃温育细胞2小时。针对Oct-4染色后，用直接缀合的抗Sca-1 (PE-Cy5)、CD45 (PE)和Lin (PE)抗体温育细胞。将染色的细胞重悬于PBS中用于进一步分析。在分析前5分钟加入7-AAD，并在ISS 100上直接运行样本。

分别通过通道3、4、5和6检测来自FITC、PE、7-AAD和PE-Cy5的信号，同时分别在通道1和2中收集侧面散射和亮视野图片。

扩增和 VSEL-DS 形成培养。将新鲜分选的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-(VSEL) 和Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ (HSC)细胞在C2C12鼠肌原细胞饲养层上培养，所述饲养层接种在22 mm 玻璃底平板上(Willco Wells B.V., Amsterdam, Netherlands)。在无任何补充的生长因子、含有低百分比血清的培养基(含2% FBS 的DMEM，INVITROGEN™)中培养细胞。培养9天后，通过计数估测VSEL衍生的球体(VSEL-DS)形成。

实时 PCR 。在新鲜分离的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- (VSEL)和Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ (HSC)中研究肝谱系定型标记物(α-胎蛋白和细胞角蛋白 19；CK19)及细胞多能性相关标记物(Oct-4、Nanog、Rex-1、Dppa1和Rif1)mRNA的表达水平，与未分级分离的FL衍生细胞相比较。应用RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, California, 美利坚合众国)分离总mRNA，并通过TAQMAN® 逆转录试剂(Applied Biosystems, Inc., Foster City, California, 美利坚合众国)逆转录。应用ABI PRISM® 7000 序列检测系统 (Applied Biosystems, Inc.)通过实时RT-PCR对感兴趣的基因和β2-微球蛋白mRNA表达进行定量评估。引物用PRIMER EXPRESS®软件设计，并且之前已经公开。参见Kucia 等， (2006) Leukemia 20:857-869。使用含有12.5 μl SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc.) 和10 ng正向和反向引物的25 μl反应混合物。随后测定阈值循环(Ct；即，定义为扩增的感兴趣的基因到达固定阈值的量的循环数)。用比较Ct方法计算 mRNA表达的相对定量。靶标的相对定量值，针对内源性对照β2-微球蛋白基因并相对于校准物标准化，表达为2^{- ΔΔ Ct} (倍差)，其中ΔCt＝靶基因(α-胎蛋白、CK19、Oct-4、Nanog、Rex-1、Dppa3和Rif-1)的Ct-内源性对照基因(β2-微球蛋白)的Ct，ΔΔCt＝靶基因的样品的ΔCt -靶基因的校准物的ΔCt。为了避免扩增污染DNA的可能性，(i)用于实时RT-PCR的所有引物均设计为含有内含子序列，用于特异性的cDNA扩增；(ii)利用合适的阴性对照(无模板的对照)进行反应；(iii)通过分析扩增产物的熔解曲线(解离图)复查产物的均匀扩增；以及(iv)熔解温度(Tm)为57-60℃，探针Tm比引物Tm至少高10℃。

统计分析。所有数值均作为平均值±平均值标准差(SEM)表示。使用单因素ANOVA分析胎肝中的不同细胞群百分比、形成的胚胎体数目和定量mRNA数据(mRNA水平的倍数改变)。如果ANOVA显示出总体差异，则使用针对非配对数据的Student t-检验进行post hoc对比。概率值(p) 小于0.05被认为是统计学显著的。所有的统计学分析皆通过使用Origin 软件(版本5.0, Microcal Software, Inc. Northampton, Massachusetts, 美利坚合众国)进行。

实施例 5-8 的介绍

已在鼠的包括BM在内的成年组织中鉴定了极小Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞群，其在它们的表面表达CXCR4受体和SSEA-1抗原，以及在细胞核中表达早期转录因子Oct-4。当前发明的共同发明人推测这些细胞是上胚层衍生的多能干细胞(PSC)，其沉积在发育中的器官中，并且成活至成年期作为用于各种器官和组织的组织定型干细胞(TCSC)的备用来源。他们还假定这些细胞的显著部分与HSC一起迁入FL中，在怀孕的第二个三月期末尾它们在FL中以SDF-1依赖的方式从FL重新定位至发育中的BM微环境中(参见图11)。因此，实施例5-8的一个方面研究是否可在怀孕不同时间(12.5、15.5和17.5 dpc)分离的鼠FL中检测到具有VSEL特征的细胞。

实施例5

胎肝中的 Sca-1⁺/lin^-/CD45^- 细胞

应用流式细胞术分析确定FL是否包括VSEL，并且如果是这样的话，则应用图12描述的选通策略估测FL中这些细胞的数目。简而言之，通过酶消化分离鼠FL衍生的细胞，用针对CD45 (APC-Cy7™)、谱系标记物(PE) 和Sca-1 (PE-Cy5™)的抗体染色，并如上文所述应用MOFLO™分析。如在Zuba-Surma等，(2008) J Cell Mol Med 12:292-303中描述的那样，通过应用尺码珠粒设计含有2-10 μm大小的事件的区域 (图12中R1区)。随后评估来自R1的细胞的CD45表达以及谱系(Lin)标记物的表达，并进一步分析Lin^-/CD45^-小事件(图12中R2区)的Sca-1抗原的存在。区3(图12中R3)包括了显示出VSEL表面表型(Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-)的Sca-1⁺细胞。

表1概述了在12.5、15.5和17.5 dpc各亚群的百分比。呈现的数据表示来自三个独立实验的平均数(平均值 ± SEM)。在每一独立实验中合并了来自15-20个胚胎的胎肝。

如在其中所显示的那样，小Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞的百分比在这些时间点从总FL单核细胞的1.33 ± 0.02%下降至0.63 ± 0.27%，至 0.09 ± 0.03%(第12.5和17.5天之间p <0.05)。在17.5 dpc，这些细胞的浓度达到在成年肝脏中观察的水平(参见Zuba-Surma等，(2008) Cytometry A 73A:1116-1127)。并行的，FL中存在的具有造血潜能的细胞(即，CD45⁺和Sca-1⁺)以及Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ 细胞(即，HSC中富集的细胞)的百分比也被确定。这些细胞的百分比也下降，尤其是在15.5至17.5 dpc之间。

表 1

通过FACS鉴定的各FL细胞亚群百分比

实施例6

FL 衍生的 Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞表达几种 PSC 标记物并且在与 C2C12 肌原细胞共培养时长成球体

BM衍生的VSEL表达多种PSC标记物，包括Oct-4、Nanog和Rex-1，并且当在由肌原细胞系细胞(C2C12)组成的饲养层的存在下培养时，形成特有的胎儿碱性磷酸酶阳性球体，类似于胚胎体。因此，测试了FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞是否表达PSC标记物，并在体外长成特有的球体。结果显示于图13中。

为确定多能VESL在FL中的百分比，如上文所述那样分选Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞，并通过实时RT-PCT确定多能基因在mRNA水平的表达。图13A显示，与FL衍生的单核细胞相比，FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL表达所有的这些多能基因。Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞中Oct-4、Nanog、Rex-1、Dppa-1和Rif1的mRNA水平分别是未分级分离的FL单核细胞中的61.64 ± 9.67、28.88 ± 11.80、 51.86 ± 8.65、71.82 ± 10.67和33.17 ± 4.68倍高。这些细胞还高表达Myf5和GFAP，其为早期中胚层和外胚层转录因子。还观察到所有这些基因的表达随着胚胎的年龄而下降，显示出在12.5 dpc的表达水平最高。

接下来，研究了FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞是否产生球体，以及它们的数量是否取决于鼠胚胎的年龄。确定了通过FACS从FL Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞中分选的细胞在C2C12支持细胞系上培养时长成球体，而Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ HSC不能(参见图13B)。此外，球体的数量随着胚胎年龄的升高而下降，显示出在12.5 dpc数量最高，并且在15.5和17.5 dpc下降(参见图13B)。

实施例7

FL 衍生的 Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞的 IMAGESTREAM ™分析

应用IMAGESTREAM™ 分析以评估FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL与FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45⁺ HSC相比较的平均大小和细胞核细胞质(N/C)比。结果显示于图14中。如其中所示，确定了FL衍生的VSEL和HSC的直径分别为7.19 ± 0.10 μm 和9.44 ± 0.07 μm。因此，分离自FL的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞的平均直径比分离自成年BM的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL的直径(Zuba-Surma 等，(2008) J Cell Mol Med 12:292-303)高约50%。

作为细胞核面积除以细胞质面积计算N/C比，所述面积从细胞核(通过7-AAD染色鉴定)和亮视野图片计算得到。该数值表示从三个独立实验得到的平均数(平均值± SEM)。每一试验中合并了来自15-20个胚胎的胎肝。FL衍生的VSEL和HSC的N/C比分别计算为2.63 ± 0.48和1.77± 0.13(参见表2)，其与在BM中发现的类似。

表2

FL 衍生的 VSEL 和 HSC 的大小及 N/C 比

根据它们的大小将Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞分为两个不同群：小于或大于6 µm。针对Sca-1、造血谱系标记物、CD45的表达，以及应用了7-氨基放线菌素D (7-AAD)的细胞核图像，对来自两个子级份的细胞进行ISS分析。更小的细胞(< 6 µm)相对于较大的细胞(> 6 µm; Sca-1^暗阴性)表达更高的Sca-1 (Sca-1^亮)。

表3概述了Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞两个级份的形态学特征，包括通过ISS分析的大小及细胞核对细胞质 (N/C) 比。Sca-1^亮 细胞(< 6 µm)比Sca-1^暗 较大细胞相比尺寸更小且拥有更高的N/C比。Sca-1^亮 细胞占总Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-群的17.35 ± 3.04%(参见表3)。这些细胞的平均大小是4.88 ± 1.08 µm，并且N/C 比为3.19 ± 1.16。表3中展示的数值表示来自三次独立实验的平均值(平均值± SEM)。每一实验中合并了来自15-20个胚胎的胎肝。对来自每一亚群的至少100张细胞图像进行形态学分析。

还固定了FL细胞，并针对多能干细胞标记物(包括Oct-4和SSEA-1)、以及造血谱系标记物(Lin)、CD45和Sca-1染色。用7-氨基放线菌素D (7-AAD)染色细胞核。与指示多能标记物的图像结合的放大的细胞核图像显示了Oct-4的细胞核内表达，以及SSEA-1在表面出现。多数具有VSEL表型及可检测的多能标记物表达的细胞属于小(< 6 µm) Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞划分。

较小的FL衍生的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL(即，直径小于6 μm的那些)的级份含有表达Oct-4和SSEA-1两者的细胞。

表3

FL 衍生的 Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL 的较小亚群的特征

实施例8

Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 和 Oct-4/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- VSEL 在胚胎和成年肝中的含量

基于流式细胞术和ISS分析，计算了12.5、15.5和17.5 dpc的 FL以及分离自4-8周龄成年小鼠的肝脏中Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 和小Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞总数。结果显示于表4中。

*: p <0.05 vs. 12.5 dpc FL

表4显示了胚胎发育期间的FL(12.5、15.5和17.5 dpc)以及成年鼠肝脏(4-8周)中Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 和小Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-VSEL的百分比含量及绝对数量的变化。表4还显示了小细胞(< 6 µm)的绝对数量，所述细胞形态上相应于VSEL。计算每一完整器官的绝对数量，并且作为来自三个独立实验的平均值呈现(平均值± SEM)。每一实验中合并了来自15-20个胚胎的胎肝。对来自每一亚群的至少100张细胞图像进行形态学分析。

肝发育期间观察到的两个细胞群绝对数量的改变提示了以下这些。最先，FL含有占优势的类似于BM衍生的VSEL的极小Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞，以及一些具有较低的Sca-1抗原表达的较大Oct-4^-/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞(12.5dpc)。这些后者细胞在12.5至15.5 dpc显示出迅速扩增，而Oct-4⁺ VSEL的数量保持相对恒定。此后，在15.5至17.5 dpc，两个群体的绝对数量均下降，这可能与他们的成熟或随着HSC迁出FL并迁入BM相关，因为已知HSC在胚胎发育的这一阶段离开胎肝并迁入发育中的BM微环境中。有趣的是，停留在17.5 dpc的肝中的Sca-1⁺/Lin^-/CD45^- 细胞、Oct-4^-VSEL以及Oct-4⁺ VSEL的绝对数量均大约与在成年(4-8周)器官中观察到的相同。

小Oct-4⁺ VSEL的总数在12.5 dpc FL中最高，并随着成熟而减少。然而，小VSEL的总数在17.5 dpc FL和在分离自成年小鼠的肝中是类似的。停留在FL中的VSEL的含量在15.5至17.5 dpc FL的这一迅速下降与HSC数量的下降是并行的，所述HSC 大约在这一发育阶段离开FL并转移至BM微环境中，它们在那里建立成年血细胞发生。这与FL作为干细胞迁移的交叉点和扩增部位是一致的，并且支持了FL是停留在BM中的VSEL的来源的可能性。

实施例 5-8 的讨论

VSEL由PSC的几种特征表征，诸如胚胎干细胞的标记物特征、细胞核中开放型染色质、当与C2C12细胞共培养时形成胎儿碱性磷酸酶阳性球体的能力，所述球体包含能够分化为所有三个主要谱系的原始细胞(参见Kucia等，(2006) Leukemia 20:857-869；Zuba-Surma等，(2008) Cytometry A 73A:1116-1127；Zuba-Surma等，(2008) J Cell Mol Med 12:292-303)。然而，尽管有VSEL表达Oct-4、Nanog和Klf-4的事实，但它们通常是静止细胞群。它们在与其他细胞类型(例如，C2C12肌原细胞)共培养时增殖，但它们在体内不形成畸胎瘤，并且它们不补充胚泡发育。

在小鼠胚胎发育期间，肝在约7.5-8.5 dpc发育，其作为来自腹面前肠内胚层的内胚层内陷发育(Houssaint (1980) Cell Differ 9:269-279; Jung 等，(1999) Science 284:1998-2003；Rossi等，(2001) Genes Dev 15:1998-2009; Zaret (2001) Curr Opin Genet Dev 11:568-574; Zaret (2002) Nat Rev Genet 3:499-512)。发育早期，FL是主要的造血器官，其在约9-10 dpc变成被卵黄囊衍生的HSC集落化(Zaret (2000) Mech Dev 92:83-88)。

FL在怀孕的第二个三月期期间还成为HSC扩增和分化的重要部位(Zaret (2000) Mech Dev 92:83-88)。最后，血细胞发生从肝中移出，并引入骨髓中(Tavian & Peault (2005) Int J Dev Biol 49:243-250; Tada等，(2006) Anat Histol Embryol 35:235-240)。CXCR4⁺ HSC对发育中的BM中SDF-1的递增浓度作出反应，并在怀孕的第三个三月期期间转移至BM。

本文公开了应用流式细胞术和ISS分析的实验，其评估在不同怀孕时间的期间，FL是否含有类似于成年BM衍生的VSEL的细胞群。确定了鼠FL含有小Oct-4⁺/Sca-1⁺/Lin^-/CD45^-细胞。这些细胞表达SSEA-4，并在与C2C12肌原细胞共培养时能够长成特有的球体。

FL衍生的VSEL数量在12.5 dpc FL中最高，并随后减少。FL中VSEL数量的减少使人联想起在这些相同的发育阶段HSC在这一器官中数量的减少。由于VSEL表达CXCR4，并且通过趋化性应答SDF-1梯度，可能它们与HSC一起离开这一器官并转移至发育中的BM中。然而，小百分比的这些细胞留在发育中肝脏中，并且可在成人动物中检测到。

如此，本文首次公开了这样的发现，即在鼠FL中存在VSEL群。这些FL衍生的VSEL尺寸极小，表达几种PSC特有的基因(例如，Oct-4、Nanog、Rex-1、Dppa3和Rif1)，并在与C2C12细胞共培养时长成类似于胚胎体的球体。在FL中它们数量的年龄相关的减少似乎与观察到了多能基因的表达以及通过这些细胞形成VSEL-DS的下降相关联。从这一点，似乎VSEL沉积在发育中的器官中，所述器官作为上胚层迁移的PSC的库，一些VSEL与HSC一起转移至发育中的BM中。

本发明还公开了可用于就它们的克隆形成能力和自我更新而言表征极小胚胎样(VSEL)干细胞(SC)的新策略。提供了强有力的证据证明了不拥有即刻造血活性(即，不在体外形成集落，在与正常基质细胞共培养时没有显示出长期培养原始细胞(LTCiC)活性，没有显示出脾集落形成单位(CFU-S)潜能，并且不能辐射保护经致死辐射的小鼠)的VSEL，在C2C12或OP9细胞上扩增后变成造血的。公开了与造血Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞不同，作为Sca1⁺/lin^-/CD45^-细胞群从相同的骨髓(BM)样本中双分选得到的VSEL在任何之前提及的体外和体内测试中均没有显示出造血活性。这些结果提供的证据证明分离了没有被造血Sca-1⁺/lin^-/CD45⁺细胞“污染”的独特的细胞群。

本文还公开了从BM中分离的Sca-1⁺/lin^-/CD45^-细胞仍然是异型的，并且仅有这些细胞的子集在OP9或C2C12细胞系上共培养后能够获得造血潜能。

由于约60%的VSEL是SSEA-1⁺且约25%是醛脱氢酶高(ALDH^hi)的，因此能够分选这些细胞亚群并测试造血潜能以评估VSEL的造血分化。一旦确立，则获得具有造血潜能的更高度纯化的VSEL亚群，并在克隆水平进行研究。

此外，还公开了从不同器官分离许多VSEL的定量方法。研究了这些细胞在体外共培养时沿着造血谱系分化的能力。此外，公开了解决VSEL体内造血特性的体内实验。具体地，测试了静脉内vs.骨内注射后这些细胞定位至骨的能力。此外，还将VSEL与短期种群恢复性造血SC(ST-HSC)一起共移植。

实施例9

VSEL 在 W/W^V 小鼠模型中逆转贫血

由于致死辐射能够影响造血微环境和VSEL的扩增，因此通过应用W/W^v 小鼠巨红细胞性贫血模型的逆转(Wiktor-Jedrzejczak等，(1979) Experientia 35:546-547)来测试VSEL是否能够重建正常血细胞发生。这一模型允许研究移植的VSEL的造血贡献，而不需要通过辐射条件化用于移植的动物。

因此，用分离自WT同胞仔的VSEL(10-10³/动物)移植W/W^v 小鼠(每组10 只)，并作为来自W/W^v小鼠的对照。移植6个月后，评估在这些小鼠中是否逆转了巨红细胞性贫血。预期来自WT小鼠的VSEL应当比来自W/W^v小鼠的VSEL具有优势。如果VSEL对血细胞发生有贡献，则它们应当逆转这些动物中的巨红细胞性贫血。

实施例 10

移植至 Rag2^-/-/gc^-/- 小鼠

应用Rag2^-/-/gc^-/- 雌性小鼠(B6背景)作为VSEL衍生的造血细胞的接受者。通过400cGy γ-辐射以两个剂量4小时间隔辐射小鼠(6/组)，通过尾静脉注射在400 ml DMEM/1% FCS中的2 x 10⁶ B6 GFP⁺ CD45⁺ VSEL衍生的OP9活化的HSC。随后，每一个月取一次小鼠的血，以评估在PB中循环的GFP⁺造血细胞数。CFU-S测试：应用Rag2^-/-/gc^-/- 雌性小鼠(B6背景)作为VSEL衍生OP9活化的造血细胞的接受者。用900 cGy γ-辐射对接受动物进行辐射，并且眶后地注射在200 ml PBS中的10⁵ 个全BM或10⁶ 个VSEL衍生的CD45⁺造血细胞。注射细胞12天后处死小鼠(12/组+6只用于辐射对照以排除内源CFU-S形成的动物)。在Bouin's缓冲液中固定它们的脾，并且对CFU-S数量打分。这些实验提供了关于分离自在OP9细胞培养物上活化的VSEL衍生的细胞的细胞是否对体内血细胞发生有贡献的其他证据。

实施例11

移植至次级接受者

移植6周后，从移植有GFP⁺ VSEL的小鼠中分离BM细胞。通过FACS分选BM衍生的GFP⁺细胞，并用于救护经致死辐射的WT同系基因型动物。如上所述评估在次级移植动物中的嵌合现象。

参考文献

下面列出的参考文献及说明书中列出的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其公开、科学杂志文章及数据库条目(例如GENBANK®条目，以及其中提供的所有注解)，以引用方式全文并入本文中到这样的程度，即它们补充、解释、为本文所用的方法、技术、和/或组合物提供背景、或教导本文所用的方法、技术、和/或组合物。

应当理解，当前公开的主题的各种细节均可改变，而不会背离当前公开的主题的范围。此外，前述说明书仅用于阐释的目的，并且不是为了限制的目的。

Claims (34)

1.分离脐带血细胞的CD133⁺/CD45^-/GlyA^- 亚群的方法，该方法包括：

(a)提供脐带血细胞的初始群；

(b)使所述初始细胞群与对CD133特异的第一抗体、对CD45特异的第二抗体以及对血型糖蛋白A(GlyA)特异的第三抗体，在足以允许每一抗体与初始细胞群每一细胞上的其靶标，如果存在的话，结合的条件下接触；以及

(c)分离CD133⁺、CD45^-且GlyA^-的细胞亚群。

2.权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使脐带血细胞与特异性结合CD133、GlyA和CD45的多个抗体同时地或反复地接触。

3.权利要求1的方法，还包括从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^高细胞，从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^低细胞，或分别从CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞中分离ALDH^高细胞和ALDH^低细胞。

4.分离的干细胞群，其中所述分离的干细胞群包含基本上纯化的分离自脐带血(CB)的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞。

5.权利要求4的分离群，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞是ALDH^高细胞。

6.权利要求4的分离群，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-细胞是ALDH^低细胞。

7.包含权利要求4的分离的干细胞群和可药用载体的组合物。

8.权利要求7的组合物，其中所述可药用载体对于在人类中的应用是可药用的。

9.用于在受试者中种群恢复细胞类型的方法，所述方法包括以一定的量和通过一定的途径给受试者施与在可药用载体中包含多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的组合物，其中所述量和途径足以允许CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的至少一部分移入靶部位并在其中分化，由此在受试者中种群恢复细胞类型。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞类型是造血细胞。

11.权利要求9的方法，其中所述靶部位包括骨髓。

12.权利要求9的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

13.权利要求12的方法，其中所述哺乳动物是人。

14.权利要求9的方法，其中所述多个分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞包含分离自脐带血的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞。

15.权利要求9的方法，其中所述可药用载体对于在人类中的应用是可药用的。

16.用于骨髓移植的方法，所述方法包括给至少部分地缺乏骨髓的受试者施与包含有效量的分离自脐带血的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的药物制备物，其中所述有效量包含分离的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以移入受试者骨髓的量。

17.权利要求16的方法，其中所述至少部分地缺乏骨髓的受试者经历了至少部分地减少所述受试者骨髓的预治疗。

18.权利要求17的方法，其中所述预治疗包括脊髓减少或脊髓抑制治疗。

19.权利要求18的方法，其中所述预治疗包括给该受试者施与免疫治疗、化疗、放射治疗或其组合。

20.权利要求19的方法，其中所述放射治疗包括全身放射。

21.权利要求16的方法，其中所述施与包括静脉内施与所述药物制备物。

22.权利要求16的方法，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。

23.权利要求16的方法，还包括在施与步骤前在OP9细胞饲养层的存在下共培养CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞至少5天。

24.用于诱导CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的方法，所述方法包括：

(a) 提供CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞；和

(b) 在OP9饲养层的存在下共培养CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞足以诱导所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞的造血能力的时间。

25.权利要求24的方法，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是骨髓衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、脐带血衍生的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、或其组合。

26.权利要求24的方法，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^低干细胞。

27.权利要求24的方法，其中所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。

28.权利要求24的方法，其中所述造血能力包括当将所述CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞施与受试者时将骨髓移入受试者的能力。

29.权利要求28的方法，其中所述造血能力包括在受试者中提供骨髓长期移入的能力。

30.权利要求24的方法，其中所述足以诱导造血能力的时间包括共培养至少5天。

31.权利要求24的方法，进一步包括从人脐带血分离CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞。

32.包含CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞和OP9细胞饲养层的细胞培养系统。

33.权利要求32的细胞培养系统，其中所述的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是人脐带血CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞、人骨髓CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞或其组合。

34.权利要求32的细胞培养系统，其中所述的CD133⁺/GlyA^-/CD45^-干细胞是CD133⁺/GlyA^-/CD45^-/ALDH^高干细胞。

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