CN117844751A - 通用型nk细胞公共库、nk细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通用型NK细胞公共库、NK细胞制剂及其制备方法，单次分离50‑100mL脐带血获得的单个核细胞，使用滋养层细胞经过7‑10天体外扩增，根据表面标志物检测结果，计算NK细胞数量并冻存得到通用型NK细胞种子库，应用时将种子细胞与滋养层细胞按照精确比例共培养，再次经过7‑10天诱导培养，即可得到纯度大于90％的NK细胞制剂。本发明采用二次扩增的方式，首先制备NK种子库，再将种子库细胞进行短期扩增培养，即可得到纯度高，质量优的NK细胞制剂，此方法仅需要少量脐带血，最终细胞制剂即可获得1‑3×1012个NK细胞，可满足1000人次的用量。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，具体是指一种使用脐带血制备通用型NK细胞公共库、NK细胞制剂及其制备方法。
背景技术
NK细胞是免疫系统的重要组成部分，对靶细胞的识别与杀伤不受MHC限制，不需抗原预先致敏就可以直接杀伤同系、同种、异种肿瘤细胞及被病毒感染的靶细胞。NK细胞主要通过以下途径发挥杀伤作用：(1)通过释放细胞质内的穿孔素和颗粒酶调控凋亡。细胞毒性颗粒中含有的穿孔素被释放到NK细胞和肿瘤细胞间的裂隙，可破坏肿瘤细胞膜，使丝氨酸蛋白酶进入细胞内，并造成细胞内大分子物质流出，导致靶细胞溶解。(2)死亡受体介导的靶细胞凋亡。NK细胞表达Fas配体，通过与肿瘤细胞表面相应死亡受体结合而将其杀死。(3)细胞因子介导的杀伤作用。活化的NK细胞能分泌多种细胞因子，如TNF、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子、IL-15、IL-10、IL-13等。通过分泌的细胞因子来抑制肿瘤细胞的增殖以及杀伤肿瘤细胞。
大量临床实验证明，自体NK细胞治疗在肿瘤治疗中虽有一定的治疗效果，且无明显毒副作用，但杀瘤效果有限，因为NK细胞上的杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)与肿瘤细胞上的MHCⅠ类分子相匹配，从而阻断了NK细胞的激活。为了克服这类限制，采用异体来源的NK细胞进行肿瘤过继性免疫治疗的研究越来越多。异体NK细胞种子来源主要有四种，①外周血来源的NK细胞：外周血中的成熟NK细胞是目前大部分非基因修饰NK细胞产品的主要细胞来源，但因其含量较少，仅占循环淋巴细胞的5-15％，并不是通用型NK的首选来源。②脐带血来源的NK细胞：因其取材方便，无伦理问题，且NK细胞含量丰富，占总淋巴细胞数量的15-30％，是目前异体NK细胞治疗研究的主要种子来源。③NK细胞系：是同种的NK细胞群，由于其较强的克隆能力，能够在体外大规模培养。目前有10种NK细胞系，其中只有NK-92细胞系已用于临床产品开发，NK-92细胞系来自于1992年一名恶性非霍奇金淋巴瘤患者，因其潜在的致瘤性风险，在人体回输前需要对细胞进行辐照，但辐照后的细胞其在体内的持久性和阳性表达均会受到影响。④iPSCs：诱导多能干细胞来源的NK细胞(iPSC-NK细胞)是基于NK细胞治疗领域的最新补充之一。iPSC来源于重编程的体细胞，如易于获得的成纤维细胞和血细胞，其多能干表型对NK细胞具有很高的分化和扩增能力。但使用该方法制备NK细胞，需先将iPSCs诱导为造血干细胞，再从造血干细胞诱导为NK细胞，操作繁琐、周期漫长，且作为最新的NK细胞来源，其安全性和可行性仍需进一步探讨。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通用型NK细胞公共库、NK细胞制剂及其制备方法，需患者提供种子细胞，减少患者痛苦，且制剂制备周期较短。
本发明是这样实现的，一种通用型NK细胞公共库的制备方法，包括以下步骤：
(1)配置完全培养基：培养基中含有体积比浓度10％-20％的胎牛血清和终浓度400-600IU/mL的白细胞介素2；
(2)分离脐血单个核细胞(UBMC)：将50-100mL脐带血样本按照血液样本体积：氯化钠注射液体积比等于1：1的比例进行样本稀释后，再以血液样本稀释液体积：淋巴细胞分离液体积等于2：1的比例将血液样本加入到淋巴细胞分离液中，以离心力300-500g低速离心20-25分钟，回收白膜层细胞，以50-100mL氯化钠注射液清洗一遍后用完全培养基重悬细胞，按照(4-5)×105个细胞/mL的浓度将最终获得的脐带血单个核细胞接种至T182细胞培养瓶中；
(3)金属浴复苏滋养层细胞(APC)，按照UBMC：APC＝1：1-2的数量比例，将APC接种至步骤(2)的培养瓶中，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱培养；
(4)NK种子库制备：每日观察细胞状态，每间隔48h取细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4-0.6)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％ CO2培养箱进行连续培养；当培养至7-10天，细胞总数达到(2-4)×108个细胞时，取(2-5)×106个细胞进行流式检测，检测NK细胞表面标志物CD3-CD16+/CD56+的表达量，当比例达到80％以上，计算纯NK细胞数量，按照(1-2)×106个CD3-CD16+/CD56+细胞/mL进行NK细胞种子库冻存。
上述的制备方法制得的通用型NK细胞公共库。
采用上述制备的通用型NK细胞公共库制备通用型NK细胞制剂的方法，包括以下步骤：
(1)脐血NK细胞制剂制备：金属浴复苏4-8支权利要求1制备的NK种子库细胞，按照(2.5-5)×104个细胞/mL浓度接种至T182细胞培养瓶中，金属浴复苏APC，按照NK种子细胞数：APC＝1：2-4的比例加入到含NK种子细胞的T182细胞培养瓶中，置于37℃，5.0％ CO2培养箱进行连续培养；
(2)第一次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％ CO2培养箱继续培养；
(3)第二次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％ CO2培养箱继续培养；
(4)第7-10天，细胞浓度达到(2-4)×109个细胞/L时，回收全部细胞。
如上述制备方法制得的通用型NK细胞制剂。
本发明具有的优点和技术效果：本发明采用单次分离50-100mL脐带血获得的淋巴细胞，使用滋养层细胞经过7-10天体外扩增，根据表面标志物检测结果，计算NK细胞数量并冻存得到通用型NK细胞种子库，将种子细胞与滋养层细胞按照精确比例共培养7-10天，即可得到纯度大于90％的NK细胞制剂。本发明采用二次扩增的方式，首先制备NK种子库，再将种子库细胞进行短期扩增培养，即可得到纯度高，质量优的NK细胞制剂，此方法仅需要少量脐带血，最终细胞制剂即可获得(1-3)×1012个NK细胞，可满足1000人次的用量。区别于传统NK细胞制剂单次制备单次采血的问题，该方法无需患者提供种子细胞，减少患者痛苦，且制剂制备周期较短，可根据不同需求同时制备多种规格细胞制剂，使用更加灵活便捷，制剂细胞纯度高，批次间品质稳定可控。
附图说明
图1是本发明实施例1D8镜下观察细胞扩增状态图(4倍镜)；
图2是本发明实施例2D8镜下观察细胞扩增状态图(4倍镜)；
图3是本发明实施例1种子库细胞培养D7天流式结果图；
图4是本发明实施例1细胞制剂培养D8天流式结果图；
图5是本发明实施例2种子库细胞培养D7天流式结果图；
图6是本发明实施例2细胞制剂培养D8天流式结果图；
图7是本发明实施例1制剂细胞扩增曲线图；
图8是本发明实施例2制剂细胞扩增曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
(1)本发明配置完全培养基：X-VIVO 15(LONZA/04-418Q)培养基中含有体积比浓度10-20％的胎牛血清和终浓度400-600IU/mL的白细胞介素2。
(2)分离脐血单个核细胞(UBMC)：将50-100mL脐带血样本按照血液样本体积：氯化钠注射液体积等于1：1的比例进行样本稀释后，再以血液样本体积：淋巴细胞分离液体积等于2：1的比例将血液样本加入到淋巴细胞分离液(达优/7912011)中，以离心力300-500g低速离心20-25分钟，回收白膜层细胞，以氯化钠注射液清洗一遍后用完全培养基重悬细胞，按照4-5×105个细胞/mL的浓度接种至T182细胞培养瓶(瓶1)中。
(3)金属浴复苏滋养层细胞(APC)(杭州中赢)，按照UBMC细胞数：APC＝1：1-2的比例，将APC接种至瓶1中，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱培养。
(4)NK种子库制备：每日观察细胞状态，每间隔48-72h取细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至0.4-0.6×109个细胞/L，置于37℃，5.0％ CO2培养箱进行连续培养。当培养至7-10天，细胞总数达到2-4×108个细胞时，取2-5×106个细胞进行流式检测，检测NK细胞表面标志物CD3-CD16+/CD56+的表达量，根据检测结果，计算纯NK细胞数量，按照1-2×106个纯NK细胞/mL/管进行种子库冻存。
(5)配制1瓶完全培养基备用。金属浴复苏4-8支NK种子细胞，按照2.5-5×104个细胞/mL浓度接种至T182细胞培养瓶中，金属浴复苏APC，按照种子细胞数：APC＝1：2-4的比例加入到含NK种子细胞的T182细胞培养瓶中，置于37℃，5.0％ CO2培养箱进行连续培养。
(6)第一次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至0.8-1.2×109个细胞/L，置于37℃，5.0％ CO2培养箱继续培养。
(7)第二次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，补加剩余全部完全培养基，置于37℃，5.0％ CO2培养箱继续培养。
(8)细胞制剂制备：培养至第7-10天，细胞浓度达到2-4×109个细胞/L时，将全部细胞转移到多个500mL离心杯中以离心力500g离心8-10min，离心后吸弃上清，使用含体积分数0.2-0.4％人血白蛋白的氯化钠注射液重悬细胞后，以离心力300-500g离心8-10min清洗细胞2-3次，使用含1-3％人血白蛋白的氯化钠注射液重悬细胞，制成NK细胞制剂。
实施例1
(1)配置完全培养基：X-VIVO 15(LONZA/04-418Q)培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清和终浓度500IU/mL的白细胞介素2。
(2)UBMC细胞提取：将脐血样本经输血器放入一个250mL离心管(管1)中，测量其净血量为60mL，向管1补加60mL氯化钠注射液，充分混匀后，将稀释样本按照30mL/管缓慢加入到4支含有淋巴细胞分离液的50mL离心管中(每个离心管含淋巴细胞分离液15mL)，配平离心，离心程序：500g、19℃、23min、启动slow、刹车slow。离心后小心吸出白膜层细胞，至于一个新的250mL离心管中，补加氯化钠注射液至总体积200mL，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后吸弃上清，使用4mL完全培养基重悬细胞，悬液体积4.3mL，吸取300uL细胞悬液计数，结果：14.7×109/L，细胞总数：6.468×107。
(3)NK种子库制备：根据计数结果，取1.4mL细胞悬液接种于1个T182培养瓶中，金属浴复苏1支APC细胞(2*107/支)接种至该培养瓶中，并向该培养瓶中补加完全培养基至总体积50mL，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中培养。每日观察细胞状态，培养第3天，取200uL细胞悬液计数，结果：0.5×109/L，未做其他处理，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。培养第5天，取200uL细胞悬液计数，结果：1.5×109/L，根据计数结果，补加100mL完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。培养第7天，取200uL细胞悬液计数，结果：2.2×109/L，细胞总数3.3×108，取1mL细胞悬液送检表面标志物(结果见图3)，根据流式结果计算出纯NK细胞总数为2.657×108。将全部细胞悬液转入500mL离心杯，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后弃上清，使用66mL 1640培养基重悬细胞，补加66mL冻存保护液(冻存保护液成分为体积分数40％1640培养基、20％DMSO(ORIGEN/CP70)、体积分数40％胎牛血清)混匀后按照NK细胞数2×106/1mL/管灌装至132个2ml冻存管中，放入程控降温盒后转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮保存。
(4)制剂细胞培养：配制1瓶完全培养基备用。金属浴复苏5管NK种子细胞，按照1管/瓶，接种于5个T182培养瓶中，金属浴复苏10支APC细胞，按照2支/瓶，接种于以上5个T182培养瓶中，每瓶补加完全培养基至总体积40mL，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中培养。第3天，取1瓶细胞吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：1.4×109/L，每瓶补加30mL完全培养基，将细胞浓度调整到0.8×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。第5天，取1瓶细胞吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：2.0×109/L，将剩余完全培养基(550ml)平均加入到各个培养瓶中，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。第8天，取1瓶细胞，镜下观察细胞形态(结果见图1)，吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：3.3×109/L，细胞总数：3.63×109，取1mL细胞悬液进行表面标志物检测(结果见图4)，其余细胞悬液全部收获至4个500mL离心杯中，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后弃掉离心上清，使用两瓶洗液将细胞重悬至2个500ml离心杯中(每瓶洗液为500mL氯化钠注射液，人血白蛋白终浓度为0.2％(质量比))。重悬细胞后配平，离心清洗细胞3次，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。使用200mL保存液重悬细胞(保存液为190mL氯化钠注射液加10mL人血白蛋白(20g/100ml)，人血白蛋白终浓度为1％(质量比))，制成通用型NK细胞制剂。扩增曲线见图7(7a：细胞扩增浓度曲线；7b：细胞扩增数量曲线)
实施例2
(1)配置完全培养基：X-VIVO 15(LONZA/04-418Q)培养基中含有体积比浓度15％的胎牛血清和终浓度400IU/mL的白细胞介素2。
(2)UBMC细胞提取：将脐血样本经输血器放入一个250mL离心管(管1)中，测量其净血量为90mL，向管1补加90mL氯化钠注射液，充分混匀后，将稀释样本按照30mL/管缓慢加入到6支含有淋巴细胞分离液的50mL离心管中(每个离心管含淋巴细胞分离液15mL)，配平离心，离心程序：500g、19℃、23min、启动slow、刹车slow。离心后小心吸出白膜层细胞，至于一个新的250mL离心管中，补加氯化钠注射液至总体积200mL，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后吸弃上清，使用5mL完全培养基重悬细胞，悬液体积5.2mL，吸取200uL细胞悬液计数，结果：17.0×109/L，细胞总数：8.84×107。
(3)NK种子库制备：根据计数结果，取1.2mL细胞悬液接种于1个T182培养瓶中，金属浴复苏2支APC(2*107/支)细胞接种至该培养瓶中，并向该培养瓶中补加完全培养基至总体积50mL，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中培养。每日观察细胞状态，培养第3天，取200uL细胞悬液计数，结果：0.5×109/L，未做其他处理，放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。培养第5天，取200uL细胞悬液计数，结果：1.7×109/L，根据计数结果，补加120mL完全培养基，调整细胞浓度至0.5×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱继续培养。培养第7天，取200uL细胞悬液计数，结果：2.4×109/L，细胞总数4.08×108，取1mL细胞悬液送检表面标志物(结果见图5)，根据流式结果计算出纯NK细胞总数为3.341×108。将全部细胞悬液转入500mL离心杯，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后弃上清，使用83mL 1640培养基重悬细胞，补加83mL冻存保护液(冻存保护液成分为体积分数40％1640培养基、20％DMSO(ORIGEN/CP70)、体积分数40％胎牛血清)，混匀后按照NK细胞数2×106/1ml/管灌装至167个2ml冻存管中，放入程控降温盒后转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮保存。
(4)制剂细胞培养：配制1瓶完全培养基备用。金属浴复苏5管NK种子细胞，按照1管/瓶，接种于5个T182培养瓶中，金属浴复苏10支APC细胞，按照2支/瓶，接种于以上5个T182培养瓶中，每瓶补加完全培养基至总体积40mL，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中培养。第3天，取1瓶细胞吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：1.4×109/L，每瓶补加35mL完全培养基，将细胞浓度调整到0.8×109/L，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。第5天，取1瓶细胞吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：2.2×109/L，将剩余完全培养基(735ml)平均加入到各个培养瓶中，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。第8天，取1瓶细胞，镜下观察细胞形态(结果见图2)，吹打混匀取200uL细胞悬液计数，结果：3.6×109/L，细胞总数：3.96×109，取1mL细胞悬液进行表面标志物检测(结果见图6)，其余细胞悬液全部收获至4个500mL离心杯中，配平离心，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。离心后弃掉离心上清，使用两瓶洗液将细胞重悬至2个500ml离心杯中(每瓶洗液为500mL氯化钠注射液，人血白蛋白终浓度为0.2％(质量比))。重悬细胞后配平，离心清洗细胞3次，离心程序：500g、19℃、10min、启动max、刹车3。使用200mL保存液重悬细胞(保存液为190mL氯化钠注射液加10mL人血白蛋白(20g/100ml)，人血白蛋白终浓度为1％(质量比))，制成通用型NK细胞制剂。扩增曲线见图8(8a：细胞扩增浓度曲线；8b：细胞扩增数量曲线)。
本发明方法无需患者提供种子细胞，大大减少了患者因采血而带来的痛苦，且制剂制备周期较短，可根据需求同时制备不同规格的细胞制剂，使用更加灵活便捷。制剂细胞纯度可达到90％以上，可满足异体应用，不同批次间的细胞品质良好，稳定可控。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种通用型NK细胞公共库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配置完全培养基：培养基中含有体积比浓度10％-20％的胎牛血清和终浓度400-600IU/mL的白细胞介素2；
(2)分离脐血单个核细胞(UBMC)：将50-100mL脐带血样本按照血液样本体积：氯化钠注射液体积比等于1：1的比例进行样本稀释后，再以血液样本稀释液体积：淋巴细胞分离液体积等于2：1的比例将血液样本加入到淋巴细胞分离液中，以离心力300-500g低速离心20-25分钟，回收白膜层细胞，以50-100mL氯化钠注射液清洗一遍后用完全培养基重悬细胞，按照(4-5)×105个细胞/mL的浓度将最终获得的脐带血单个核细胞接种至T182细胞培养瓶中；
(3)金属浴复苏滋养层细胞(APC)，按照UBMC：APC＝1：1-2的数量比例，将APC接种至步骤(2)的培养瓶中，混匀后放入37℃、5％CO2培养箱培养；
(4)NK种子库制备：每日观察细胞状态，每间隔48h取细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.4-0.6)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％CO2培养箱进行连续培养；当培养至7-10天，细胞总数达到(2-4)×108个细胞时，取(2-5)×106个细胞进行流式检测，检测NK细胞表面标志物CD3-CD16+/CD56+的表达量，当比例达到80％以上，计算纯NK细胞数量，按照(1-2)×106个CD3-CD16+/CD56+细胞/mL进行NK细胞种子库冻存。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的通用型NK细胞公共库。
3.采用权利要求1制备的通用型NK细胞公共库制备通用型NK细胞制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)脐血NK细胞制剂制备：金属浴复苏4-8支权利要求1制备的NK种子库细胞，按照(2.5-5)×104个细胞/mL浓度接种至T182细胞培养瓶中，金属浴复苏APC，按照NK种子细胞数：APC＝1：2-4的比例加入到含NK种子细胞的T182细胞培养瓶中，置于37℃，5.0％CO2培养箱进行连续培养；
(2)第一次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，根据细胞计数结果补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％CO2培养箱继续培养；
(3)第二次补液：间隔48-72h取100-200uL细胞悬液计数，补加完全培养基将细胞浓度调整至(0.8-1.2)×109个细胞/L，置于37℃，5.0％CO2培养箱继续培养；
(4)第7-10天，细胞浓度达到(2-4)×109个细胞/L时，回收全部细胞。
4.如权利要求3所述制备方法制得的通用型NK细胞制剂。
Priority Applications (1)
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| CN202311598480.1A CN117844751A (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 通用型nk细胞公共库、nk细胞制剂及其制备方法 |
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