CN111849897A - 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法 - Google Patents

一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111849897A
CN111849897A CN202010785080.1A CN202010785080A CN111849897A CN 111849897 A CN111849897 A CN 111849897A CN 202010785080 A CN202010785080 A CN 202010785080A CN 111849897 A CN111849897 A CN 111849897A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
cik
cytokine
killer cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010785080.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111849897B (zh
Inventor
郭子宽
潘慧欣
王恒湘
哈小琴
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Kelinen Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Kelinen Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Kelinen Biotechnology Co Ltd filed Critical Beijing Kelinen Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202010785080.1A priority Critical patent/CN111849897B/zh
Publication of CN111849897A publication Critical patent/CN111849897A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111849897B publication Critical patent/CN111849897B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，涉及生物医药领域。具体而言，该方法在细胞培养前，使用浓度为0.1‑2％的明胶溶液包被培养瓶，之后吸除明胶溶液，接种细胞。相较于已有的专利方法，在培养CIK细胞前进行明胶包被，可显著增加目标细胞和自然杀伤细胞比例，增强细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。该方法不仅适用于CIK细胞培养，也可适用于自然杀伤细胞培养，具有极大的市场前景及经济价值。

Description

一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的疾病，随着人们寿命的延长，癌症已经是一种常见多发病，也是临床工作者经常面对的难题。癌症的治疗手段包括手术治疗、化学治疗、放射治疗及生物治疗。作为癌症治疗的较新颖的手段，生物治疗正逐渐从临床试验阶段进入临床应用，成为癌症治疗不可或缺的方式。细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine-induced killercells，CIK细胞)，也是应用于临床新方法。在西欧，CIK细胞治疗已经获得政府批准，用于急性白血病及骨髓增生异常综合征的治疗。我国也已经开展了多项临床试验，用于治疗肝癌、肺癌、肾癌等实体瘤。CIK细胞也用于预防造血干细胞移植后复发[1]。此外，在CIK细胞群中，细胞毒作用的主要效应细胞是CD3+/CD56+的细胞，亦即是表达CD56的T淋巴细胞，因此具有MHC非限制性及限制性杀伤能力，因此，异体CIK细胞也适用于严重巨细胞病毒及EB病毒感染的控制[2,3]。总体上讲，CIK细胞治疗对于预防手术后癌症复发，以及某些类型白血病及骨髓增生异常综合征，都可能获得令人满意的效果。
在CIK细胞培养最终产品中有多种免疫细胞，包括自然杀伤细胞(NK细胞)，表达CD56分子而不表达CD3分子，称为CD3-/CD56+，T淋巴细胞(CD3+/CD56-)以及CD3+/CD56+细胞。常规CIK细胞培养中，培养的目的在于获得高比例的CD3+/CD56+细胞，这群细胞是CIK培养的目标细胞。在组成CIK细胞的群体中，具有较强肿瘤细胞杀伤能力的是CD3+/CD56+细胞和CD3-/CD56+细胞，即目标细胞和NK细胞。但是，在常规CIK细胞培养体系中，NK细胞比例较低，发挥细胞毒作用的主要细胞为CD3+/CD56+细胞。然而，由于血液样品供者个体差异，以及常规体系中抗CD3单克隆抗体对T淋巴细胞刺激的非特异性，CD3+/CD56+细胞比例常较低，尤其是2周培养方案更是如此[4-6]。因此，有人通过抗人胸腺细胞球蛋白替代抗CD3抗体[4,5]，或使用重组人IL-15替代重组人IL-2[6]，以期获得更好的培养效果。然而，这些改变并没有提高NK细胞比例，培养体系中缺少了一种功能细胞。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是CIK细胞培养后，目标细胞比例偏低，杀伤功能不足。
本发明的一个目的是提供一种简易的刺激CIK细胞活化的方法，使获得的CIK细胞群中含有较多的CD3-/CD56+细胞(NK细胞)和CD3+/CD56+细胞(CIK目标细胞)，细胞群体的杀伤能力更高，可能具有更好的临床应用前景。
本发明经过多次实验，找到了一种可以同时促使CD3+/CD56+细胞(CIK目标细胞)和CD3-/CD56+细胞(NK细胞)增殖的活化剂。利用这种活化剂处理后的培养器皿，使用常规CIK培养方法培养细胞，即可获得含较高比例目标细胞的细胞群。该方法操作简单，并可同时获得较高比例的NK细胞，从而具有更强的细胞毒效力。
本发明提供的一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，包括以下步骤：
1)活化剂包被：在培养瓶中加入含有0.1-2％(g/100ml)明胶的明胶溶液；明胶溶液的溶剂为0.85％(g/100ml)的NaCL，或含生理盐水的磷酸盐缓冲液(PBS)；将明胶溶液的液体平铺于培养瓶底部，置于4℃过夜，或2周内使用，或置于37℃至少2小时。包被温度为不导致溶液凝固或结冰的温度，优选4℃、室温或37℃。
2)活化剂处理：取出培养瓶，吸除活化剂，加入生理盐水，轻轻晃动使盐水平铺于培养瓶底部，吸除生理盐水，即可使用该培养瓶接种细胞。
3)单个核细胞的分离、血浆处理：用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取抗凝外周血或脐带血中的单个核细胞，计细胞数；同时收集血浆，在56℃30分钟灭活后，离心去除血小板；处理后的血浆用于以下细胞培养。
4)细胞培养：将单个核细胞悬浮于培养基中，加入血浆2-10％，γ干扰素1000-2000U/ml，在37℃、5％CO2、95％湿度的环境下培养24小时。之后，加入IL-2和IL-15，二者终浓度分别为200-2000U/ml和10-100ng/ml。加入抗人CD3单克隆抗体，200-1000ng/ml，继续培养48小时。
5)补液及转瓶培养：补充新鲜培养基，体系含血浆2-10％，IL-2和IL-15，后者终浓度分别为200-2000U/ml和10-100ng/ml。当培养基总体积达到培养瓶最大量时，将细胞悬液转移至底面积为225cm2的培养瓶中。同时，收集原培养瓶中的残留细胞，转入新培养瓶中。向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。
6)培养及细胞收集：继续培养至总时间2-3周，离心收集细胞。计细胞数。
步骤1)中，优选的：(1)明胶的浓度为1％(g/100ml)；(2)使用PBS作为溶解明胶的溶剂；(3)将培养瓶置于4℃过夜，或者，置于4℃，2周内使用。
步骤3)中，优选的，将收集的血浆灭活后，立即置于-20℃，5分钟后取出离心。优选的，离心去除血浆中血小板时，离心力达到3000g，离心时间15分钟。去除血浆中的血小板，有利于后续的细胞培养扩增。
步骤4)中，优选的，单个核细胞的浓度为3×106个/ml；重组人γ干扰素浓度为2000U/ml；37℃培养24小时后，加入IL-2的浓度为500U/ml，IL-15浓度为50ng/ml。
步骤5)中，优选的，补充的新鲜培养基体积与补液前培养基体积相同，亦即，等量补液。优选的，新鲜培养基中不含IL-2。优选的，新鲜培养基中含IL-15浓度为50ng/ml。为转移原培养瓶中的残留细胞，向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。
步骤6)中，优选的，培养总时间为2周，离心收集细胞时，离心力为500g，8分钟。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：本发明相比于已有的专利方法，是一种更为简单有效的杀伤细胞(CIK细胞、NK细胞)的体外扩增培养技术，有效地降低了杀伤细胞的体外扩增培养成本。在包被步骤中，加入明胶，显著地增加NK细胞的比例；具有极大的市场前景和经济价值。
附图说明
为使本发明更好地被理解，以传统方法为对照，对本发明具体实施如下例。附图为主要结果显示，其中：
图1.实施例1的传统方法培养外周血CIK细胞，48h时在显微镜下观察的细胞形态；
图2.实施例1的本发明方法培养外周血CIK细胞，48h时在显微镜下观察的细胞形态；
图3.实施例1的传统方法培养外周血CIK细胞，1周时在显微镜下观察的细胞形态；
图4.实施例1的本发明方法培养外周血CIK细胞，1周时在显微镜下观察的细胞形态；
图5.实施例1的传统方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以同型对照抗体标记结果；
图6.实施例1的传统方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE抗体标记结果；
图7.实施例1的本发明方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以同型对照抗体标记结果；
图8.实施例1的本发明方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE抗体标记结果；
图9.实施例2的传统方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以同型对照抗体标记结果；
图10.实施例2的传统方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE抗体标记结果；
图11.实施例2的本发明方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以同型对照抗体标记结果；
图12.实施例2的本发明方法培养CIK细胞两周，收集细胞进行流式细胞学检测，以抗人CD3-FITC和抗人CD56-PE抗体标记结果；
图13.MTT实验中，实施例1的传统方法培养的CIK细胞，体外杀伤K562细胞的效果；
图14.MTT实验中，实施例1本发明方法培养的CIK细胞，体外杀伤K562细胞的效果；
图15.MTT实验中，实施例2传统方法培养的CIK细胞，体外杀伤K562细胞的效果；
图16.MTT实验中，实施例2本发明方法培养的CIK细胞，体外杀伤K562细胞的效果。
图1-图4的标示大小均为50μm。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述
实施例1
本实施例公开了一种细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)的体外活化及培养扩增方法，以40ml人外周血为例，所述方法如下：
1.细胞培养及收获
(1)2％明胶的配制：称取明胶(美国Sigma公司产品，货号G7041)2g，称取氯化钠0.85g，加入去离子水90ml。搅拌溶解，加入去离子水调整总体积至100ml。通过0.22μm针头滤器过滤。置于4℃储存。
(2)活化剂包被：准备两个底面积为75cm2的培养瓶，分别标示为ctr和test。标记为ctr的培养瓶加入生理盐水，标示为test培养瓶中加入2％明胶(活化剂)10ml，平铺于培养瓶底部。将培养瓶置于37℃，2小时。
需要说明的是，ctr表示传统方法，test表示本发明提供的方法。
(3)活化剂处理：吸除标示为test的培养瓶中的明胶，加入生理盐水，轻轻晃动使盐水平铺于培养瓶底部，吸除生理盐水。吸除标示为ctr的培养瓶中的生理盐水。培养瓶备用。
(4)抽取健康人外周血40ml，肝素抗凝。
(5)单个核细胞的分离、血浆处理：取2支50ml离心管，分别加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，密度1.077g/ml)20ml。每管缓慢滴加抗凝外周血20ml。用800g，离心30分钟。吸取中间白膜层，加入生理盐水洗涤2次，500g，离心10分钟。计细胞数共5.6×106个，培养基悬浮细胞。取上层血浆共25ml，置于56℃，30分钟。将已经灭活的血浆置于-20℃，静置5分钟，离心3000g，30分钟，以去除血浆中的血小板。
(6)细胞接种：按照文献[6]报道的方法培养CIK细胞。配制培养基20ml，含自体血浆0.5ml，重组人IFN-gamma(北京同立海源生物科技有限公司产品)40,000U，悬浮单个核细胞。向标示为ctr和test的培养瓶中，分别加入10ml细胞悬液。将细胞置于37℃，5％CO2浓度，95％湿度下培养24小时。
(7)之后，按照下表1所示，补充新鲜培养基、血浆、细胞因子及单克隆抗体。表1中所示血浆、细胞因子及抗体及加培养基量，均为单个培养瓶添加量。总体积为每组总体积。
(8)转瓶培养时，将细胞悬液转移至底面积为225cm2的培养瓶中。同时，为收集原培养瓶中的残存细胞，向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。向培养瓶中加入新鲜培养基(60ml/瓶)，培养基中含自体血浆2.5％和IL-15(50ng/ml)。培养瓶仍延续以前标示，分别为ctr和test。
(9)分瓶培养时，向培养瓶中加入400ml含2.5ml自体血浆和重组人IL-15(20μg)的新鲜培养基，此时培养瓶中细胞总体积为800ml。按照100ml/瓶将细胞悬液转移至T225培养瓶中。培养瓶仍延续以前标示，分别为ctr和test。
(10)收集细胞时，将细胞转移至500ml离心管中，离心，500g，15分钟。用生理盐水悬浮部分细胞，计细胞浓度及细胞活力。离心，500g，10分钟。用生理盐水悬浮部分细胞，用于抗体标记及流式细胞学分析；用培养基悬浮用于MTT实验。
表1:实施例1的ctr和test组细胞培养过程中体系的组成及处理
Figure BDA0002621651240000061
Figure BDA0002621651240000071
2.细胞计数及活力测定
上述实验收集的ctr和test细胞，用培养基悬浮。吸取细胞悬液10μl至EP管，加入2％胎盘蓝溶液40μl，混匀，计数板计数。结果显示：(1)ctr组胎盘蓝拒染率为96.5％，test组拒染率为96.0％；(2)ctr组活细胞浓度为1.73×106/ml，test组活细胞浓度为1.68×106/ml；(3)ctr组活细胞总数为5.54×109，test组活细胞总数为5.38×109。
3.MTT实验
1)收取培养的CIK细胞作为效应细胞，K562白血病细胞株作为靶细胞。取对数生长期K562细胞调整细胞浓度为2×105个/ml，CIK细胞浓度分别调整为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml。
2)96孔培养板，设计三个分组，分别为靶细胞组、单纯效应细胞组和效应/靶细胞混合组。效应/靶细胞混合组中，效靶比(CIK细胞：K562细胞)依次为1:1、10:1和20:1，每组平行6个复孔。
靶细胞组每孔加入K562细胞悬液50μl，加入NK细胞培养基50μl，共6孔；
效应/靶细胞组分1:1，10:1和20:1三小组，每小组6孔，每孔加K562细胞悬液50μl；
单纯效应细胞组分1:1,10:1和20:1三小组，每小组6孔，分别加入浓度为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml的CIK细胞50μl，然后加入NK细胞培养基50μl；
效应/靶细胞组也分为3小组，即1:1,10:1和20:1三小组，每小组6孔，分别加入浓度为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml的CIK细胞50μl。
加样分组如下表2所示。√为加样孔。
表2:
Figure BDA0002621651240000081
Figure BDA0002621651240000091
实施例1的MTT实验具体结果如说明书附图13和附图14所示。
图13中，ctr 1:1表示传统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)1:1；ctr 10:1表示传统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)10:1；ctr 20:1表示传统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)20:1。
图14中，test 1:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)1:1；test 10:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)10:1；test 20:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)20:1。
4.抗体标记及流式细胞学分析
收集CIK细胞，计细胞数，向每个流式测定管中分别加入1×106个细胞，分别标记为：(1)ctr同型对照；(2)ctr-CD3/CD56；(3)test同型对照和(4)test-CD3/CD56。(1)和(3)管中加入同型对照抗体；(2)和(4)管中加入FITC标记的抗人CD3和PE标记的抗人CD56抗体。室温避光反应20分钟。洗涤。生理盐水悬浮。FACS-Calibur收集数据，Flowjo 6.0软件分析结果。
结果如说明书附图5-8所示。结果显示，用传统方法培养的CIK细胞，目标细胞(CD3+/CD56+细胞)比例为25.8％，NK细胞(CD3-/CD56+细胞)比例为0.545％。用本发明方法培养的CIK细胞，目标细胞(CD3+/CD56+细胞)比例为50.1％，NK细胞(CD3-/CD56+细胞)比例为2.82％。
可见，用本发明方法培养的CIK细胞，CD3+/CD56+细胞比例(50.1％)高于传统方法培养的CIK细胞中CD3+/CD56+细胞比例(25.8％)。
5.统计学分析
细胞计数以计量资料表示。MTT实验数据两组比较，用双尾t实验统计处理，比较两个平均数的差异，设P小于0.05为差异显著。流式细胞学资料以百分数表示，结果见表3。
表3:实施例1的MTT实验显示细胞毒性统计学数据
Figure BDA0002621651240000101
实施例2
本实施例公开了一种细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)的体外培养扩增方法，以50ml人外周血为例，所述方法如下：
1.细胞培养及收获
(1)活化剂包被：准备4个底面积为75cm2的培养瓶，分别标示为ctr和test。标记为ctr的培养瓶加入生理盐水，标示为test培养瓶中加入2％明胶(活化剂)10ml，平铺于培养瓶底部。将培养瓶置于4℃，过夜。
(2)活化剂处理：吸除标示为test的培养瓶中的明胶，加入生理盐水，轻轻晃动使盐水平铺于培养瓶底部，吸除生理盐水。吸除标示为ctr的培养瓶中的生理盐水。培养瓶备用。
(3)抽取健康人外周血50ml，肝素抗凝。
(4)单个核细胞的分离、血浆处理：取4支50ml离心管，分别加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，密度1.077g/ml)12.5ml。每管缓慢滴加抗凝外周血12.5ml。800g，离心30分钟。吸取中间白膜层，加入生理盐水洗涤2次，500g，10分钟。计细胞数共8.5×106个，培养基悬浮细胞。取上层血浆共34ml，置于56℃，30分钟。将已经灭活的血浆置于-20℃，静置5分钟，离心，3000g，30分钟，以去除血浆中的血小板。
(5)细胞接种：配制培养基40ml，含自体血浆1ml，重组人IFN-gamma(北京同立海源生物科技有限公司产品)80,000U，悬浮所有单个核细胞。向标示为ctr和test的培养瓶中，分别加入10ml细胞悬液。将细胞置于37℃，5％CO2，95％湿度下培养24小时。
(6)之后，按照下表4所示，补充新鲜培养基、血浆、细胞因子及单克隆抗体。表4中所示血浆、细胞因子及抗体及加培养基量，均为单个培养瓶添加量。总体积为每组总体积。
表4：实施例2的ctr和test组细胞培养过程中体系的组成及处理
Figure BDA0002621651240000111
Figure BDA0002621651240000121
(7)转瓶培养时，将细胞悬液转移至底面积为225cm2的培养瓶中。同时，为收集原培养瓶中的残存细胞，向原培养瓶中加入冷的生理盐水(4℃)，使之平铺于培养瓶底部，静置5分钟后，吹打并将细胞转移至离心管中。500g离心8分钟，将细胞悬浮加入底面积为225cm2的培养瓶中。向培养瓶中加入新鲜培养基(40ml/瓶)，培养基中含自体血浆2.5％和IL-15(50ng/ml)。培养瓶仍延续以前标示，分别为ctr和test。
(8)分瓶培养时，向培养瓶中加入400ml含重组人IL-15(20μg)的新鲜培养基，此时培养瓶中细胞总体积为800ml。按照200ml/瓶将细胞悬液转移至T225培养瓶中。培养瓶仍延续以前标示，分别为ctr和test。
(9)收集细胞时，将细胞转移至500ml离心管中，离心，500g，15分钟。用生理盐水悬浮部分细胞，计细胞浓度及细胞活力。离心，500g，10分钟。用生理盐水悬浮部分细胞，用于抗体标记及流式细胞学分析；用培养基悬浮用于MTT实验。
2.细胞计数及活力测定
上述实验收集的ctr和test细胞，用培养基悬浮。吸取细胞悬液10μl至EP管，加入2％胎盘蓝溶液40μl，混匀，计数板计数。结果显示：(1)ctr组胎盘蓝拒染率为94.3％，test组拒染率为95.9％；(2)ctr组活细胞浓度为2.8×106个/ml，test组活细胞浓度为2.6×106个/ml；(3)ctr组活细胞总数为8.96×109个，test组活细胞总数为8.32×109个。
3.MTT实验
1)收取培养的CIK细胞作为效应细胞，K562白血病细胞株作为靶细胞。取对数生长期K562细胞调整细胞浓度为2×105个/ml，CIK细胞浓度分别调整为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml。
2)96孔培养板，设计三个分组，分别为靶细胞组、单纯效应细胞组和效应/靶细胞混合组。效应/靶细胞混合组中，效靶比(CIK细胞：K562细胞)依次为1:1、10:1和20:1，每组平行6个复孔。
3)靶细胞组每孔加入K562细胞悬液50μl，加入NK细胞培养基50μl，共6孔；
效应/靶细胞组分1:1,10:1和20:1三小组，每小组6孔，每孔加K562细胞悬液50μl；
单纯效应细胞组分1:1,10:1和20:1三小组，每小组6孔，分别加入浓度为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml的CIK细胞50μl，然后加入NK细胞培养基50μl；
效应/靶细胞组也分为3小组，即1:1,10:1和20:1三小组，每小组6孔，分别加入浓度为2×105个/ml，2×106个/ml，4×106个/ml的CIK细胞50μl。
加样分组如下表5所示。√为加样孔。
表5:
Figure BDA0002621651240000131
具体结果如说明书附图15和附图16所示。
图15中，ctr 1:1表示传统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)1:1；ctr 10:1表示统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)10:1；ctr 20:1表示传统方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)20:1。
图16中，test 1:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)1:1；test 10:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)10:1；test 20:1表示本发明方法培养的CIK细胞，效靶比(CIK细胞：K562细胞)20:1.
4.抗体标记及流式细胞学分析
收集CIK细胞，计细胞数，向每个流式测定管中分别加入1×106个细胞，分别标记为：(1)ctr同型对照；(2)ctr-CD3/CD56；(3)test同型对照和(4)test-CD3/CD56。(1)和(3)管中加入同型对照抗体；(2)和(4)管中加入FITC标记的抗人CD3和PE标记的抗人CD56抗体。室温避光反应20分钟。洗涤。生理盐水悬浮。FACS-Calibur收集数据，Flowjo 6.0软件分析结果。
结果如说明书附图9-12所示。结果显示，用传统方法培养的CIK细胞，目标细胞(CD3+/CD56+细胞)比例为34.6％，NK细胞(CD3-/CD56+细胞)比例为1.06％。而用本发明方法培养的CIK细胞，目标细胞(CD3+/CD56+细胞)比例为36.1％，NK细胞(CD3-/CD56+细胞)比例为39.5％。
可见，本发明方法培养的CIK细胞中，CD3+/CD56+细胞比例(36.1％)高于传统方法培养的CIK细胞中CD3+/CD56+细胞比例(34.6％)，本发明方法培养CIK细胞获得的细胞中CD3-/CD56+比例为39.5％，高于传统方法培养CIK获得的细胞中CD3-/CD56+比例(1.06％)。
5.统计学分析
细胞计数以计量资料表示。MTT实验数据两组比较，用双尾t实验统计处理，比较两个平均数的差异，设P小于0.05为差异显著。流式细胞学资料以百分数表示，结果见表6。
表6:实施例2的MTT实验显示细胞毒性统计学数据
Figure BDA0002621651240000151
从实施例1和实施例2可以看出，应用本发明方法培养的CIK细胞，目标细胞比例较高，并可获得较高数量的NK细胞，其杀伤活性也较强。本发明提供的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，在培养CIK细胞前，使用明胶包被培养瓶，从而促进NK细胞增殖及CD3+/CD56+细胞的发育，获得的细胞可更强地杀伤肿瘤细胞。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详细描述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上所述，为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
参考文献
1.Hontscha C,Borck Y,Zhou H,Messmer D,Schmidt-Wolf IG.Clinical trialson CIK cells:first report of the international registry on CIK cells(IRCC).JCancer Res Clin Oncol.2011；137(2):305-310.
2.Nalesnik MA,Rao AS,Furukawa H,Pham S,Zeevi A,Fung JJ,Klein G,Gritsch HA,Elder E,Whiteside TL,Starzl TE.Autologous lymphokine-activatedkiller cell therapy of Epstein-Barr virus-positive and-negativelymphoproliferative disorders arising in organ transplantrecipients.Transplantation.1997；63(9):1200-1205.
3.Luah YH,Sundar Raj K,Koh MBC,Linn YC.A novel simplified method ofgenerating cytomegalovirus-specific cytokine-induced killer cells of highspecificity and superior potency with GMP compliance.Clin Immunol.2019；205(1):83-92.
4.Bonanno G,Iudicone P,Mariotti A,Procoli A,Pandolfi A,Fioravanti D,Corallo M,Perillo A,Scambia G,Pierelli L,Rutella S.Thymoglobulin,interferon-γand interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer(CIK)cells inclinical-grade cultures.J Transl Med.2010；8:129.
5.Rutella S,Iudicone P,Bonanno G,Fioravanti D,Procoli A,Lavorino C,Foddai ML,Lorusso D,Martinelli E,Vacca M,Ipsevich F,Nuti M,Scambia G,PierelliL.Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with anew good manufacturing practice-grade protocol.Cytotherapy.2012；14(7):841-850.
6.Bremm M,Pfeffermann LM,Cappel C,Katzki V,Erben S,Betz S,Quaiser A,Merker M,Bonig H,Schmidt M,Klingebiel T,Bader P,Huenecke S,RettingerE.Improving Clinical Manufacturing of IL-15 Activated Cytokine-Induced Killer(CIK)Cells.Front Immunol.2019；10:1218.

Claims (10)

1.一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，在细胞培养前，使用明胶溶液包被培养器皿。
2.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液为，含明胶的盐溶液，或，含明胶的水溶液。
3.如权利要求2所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液中，明胶的浓度为0.1％(克/100ml)以上。
4.如权利要求3所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述明胶溶液中，明胶的浓度为0.1-2％(克/100ml)。
5.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述包被的作用温度为4℃、室温或37℃。
6.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述包被的作用时间为30分钟以上，1个月以内。
7.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，所述包被的具体操作为，将明胶溶液平铺于培养器皿底部，使待培养的细胞与其接触。
8.如权利要求1所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法，其特征在于，还包括，包被完成后吸除多余的明胶溶液，加入生理盐水，轻轻晃动使生理盐水平铺于培养器皿底部，再吸除多余的生理盐水，即可用该培养器皿接种细胞。
9.一种细胞培养基，其特征在于，应用于如权利要求1-8任一项所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法。
10.如权利要求1-8任一项所述的细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法或权利要求9所述的细胞培养基在培养CIK细胞、自然杀伤细胞方面的应用。
CN202010785080.1A 2020-08-06 2020-08-06 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法 Active CN111849897B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010785080.1A CN111849897B (zh) 2020-08-06 2020-08-06 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010785080.1A CN111849897B (zh) 2020-08-06 2020-08-06 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111849897A true CN111849897A (zh) 2020-10-30
CN111849897B CN111849897B (zh) 2022-04-19

Family

ID=72972558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010785080.1A Active CN111849897B (zh) 2020-08-06 2020-08-06 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111849897B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232789A (zh) * 2022-09-13 2022-10-25 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104818248A (zh) * 2015-03-25 2015-08-05 苏州佰通生物科技有限公司 一种免疫细胞培养基、培养方法及应用
CN107779433A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 天津市康婷生物工程有限公司 便捷的刺激nk细胞增殖和分化的饲养层制备方法
CN110891969A (zh) * 2017-03-20 2020-03-17 四方控股公司 调节免疫细胞的方法和组合物
US20200102538A1 (en) * 2016-11-22 2020-04-02 Alloplex Biotherapeutics Compositions and methods for in vitro activation and expansion of serial killer t cell populations and passive immunization of a cancer patient with tumor cell killing cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104818248A (zh) * 2015-03-25 2015-08-05 苏州佰通生物科技有限公司 一种免疫细胞培养基、培养方法及应用
CN107779433A (zh) * 2016-08-30 2018-03-09 天津市康婷生物工程有限公司 便捷的刺激nk细胞增殖和分化的饲养层制备方法
US20200102538A1 (en) * 2016-11-22 2020-04-02 Alloplex Biotherapeutics Compositions and methods for in vitro activation and expansion of serial killer t cell populations and passive immunization of a cancer patient with tumor cell killing cells
CN110891969A (zh) * 2017-03-20 2020-03-17 四方控股公司 调节免疫细胞的方法和组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
马明瑛等: "明胶法富集外周血单核细胞并刺激其成熟为树突状细胞", 《中国组织工程研究》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115232789A (zh) * 2022-09-13 2022-10-25 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法
CN115232789B (zh) * 2022-09-13 2024-03-01 北京集美生物科技有限公司 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111849897B (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080018089A (ko) 면역치료용 활성화 림프구 제조방법
CN108588022B (zh) 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法
US11944672B2 (en) Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying Treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1
JP6073417B2 (ja) 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物
Després et al. CD34+ cell enrichment for autologous peripheral blood stem cell transplantation by use of the CliniMACs device
CN116745404A (zh) Nk细胞的大量增殖培养方法
CN111849897B (zh) 一种细胞因子诱导杀伤细胞的体外活化方法
KR101900807B1 (ko) 헬퍼 t1 특성들 및 세포용해 특성들을 발현하는 세포들
WO2023216799A1 (zh) 一种人nkt细胞系及其应用
US6692958B2 (en) Cord blood-derived activated lymphocytes, preparations containing said lymphocytes as main ingredient and method and kit for producing said preparations
US20070154877A1 (en) Method for the direct culture of dendritic cells without a preceding centrifugation step
BR112015014270B1 (pt) co-diferenciação de monócitos a partir de doadores alogênicos
AU6125486A (en) Process and composition for treatment of cancer and non- malignant tumors
CN111690606B (zh) 体外激活扩增人体自然杀伤细胞及杀伤率检测方法
CN111154721B (zh) Nk细胞扩增方法
US20220184122A1 (en) A method for providing immune cells
WO2008044876A1 (en) Method for preparing t-cell progenitor from cd34 positive stem cell
EP3876962A1 (en) Treatment method for graft-versus-host disease
TWI669400B (zh) 用於體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之無血清細胞培養液
EP3055691B1 (en) Method for retrieval of stem cells from human and animal blood using an oxygen-ozone mixture
CN110317786B (zh) 一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用
CN115232789B (zh) 一种利用Daudi细胞膜囊制备细胞因子诱导杀伤细胞的方法
TWI669399B (zh) 體外擴增自然殺手細胞及自然殺手ｔ細胞之方法及其醫藥組成物
CN110628714B (zh) 用于体外扩增自然杀手细胞及自然杀手t细胞的无血清细胞培养液
CN115927181A (zh) 一种来源于胸腹水的t淋巴细胞的制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant