CN114058584A - 一种临床用自然杀伤细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，主要包括以下步骤：步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞；步骤二、剩余单个核细胞成份的优化；步骤三、NK细胞的培养和扩增；步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定。本发明首先分离出脐带血中的自体血浆及单个核细胞，其次利用磁珠法分选出单个核细胞中以CD34+为表面标记的造血干细胞，获得造血干细胞的同时，也收获了除造血干细胞以外的剩余成份，用此剩余成份及自体血浆培养NK细胞，实现了资源的合理利用，使得同一份脐带血既可以进行造血干细胞回输，又可以培养出符合临床需求的具有抗肿瘤活性的NK细胞，适于广泛推广应用。

Description

一种临床用自然杀伤细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种临床用自然杀伤细胞的制备方法。
背景技术
异基因造血干细胞移植是根治白血病的重要手段，但移植后白血病复发是困扰移植成功的评分障碍。移植后复发率可高达20%—80%，对于复发的患者治疗困难、预后差。二次移植虽可使部分患者再次缓解，但二次移植后相关合并症的发生率为25%—50%，极大地限制了二次移植的应用。近年来临床研究显示，取自原移植供体具免疫活性的淋巴细胞输注，可使异基因造血干细胞移植后白血病复发患者再次缓解，并且疗效好、毒性小。这种供者淋巴细胞输注可能成为新的预防异基因造血干细胞移植后白血病复发的策略。
供者淋巴细胞输注是指通过输入异基因造血干细胞移植术后供者的淋巴细胞来治疗恶性疾病的一种方法。其目标是通过移植物抗肿瘤效应来诱导和维持缓解。其中供者是指为患者提供异基因造血干细胞的人，因骨髓应用受限，目前多指为患者提供脐带血的人。而在实际应用中，寻找脐带血的供者比较繁琐且变数较多，因此有较多的局限性。供者淋巴细胞输注临床应用中供者的自然杀伤细胞（Natural Killer Cell , NK）是较为重要的淋巴细胞。NK细胞来源于骨髓，分布于外周血和脾脏，是一类固有免疫细胞，无需抗原预先致敏，且无主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex ,MHC）限制性，可直接杀伤肿瘤细胞或被感染的细胞，具有广谱的抗肿瘤作用，所以NK细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有巨大的潜力。由于人体自身NK细胞的含量有限，在体外快速扩增获得大量活化的 NK 细胞是DLI临床应用的关键。
因此为解决现有脐带血造血干细胞移植后进一步进行供者NK细胞输注，而供者NK细胞来源获取局限性的问题，本发明提供了一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，可在体外大量培养进而获得符合临床需求的NK细胞。
发明内容
为解决现有脐带血造血干细胞移植后进一步进行供者NK细胞输注，而供者NK细胞来源获取局限性的问题，本发明提出一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，在分选出以CD34+为标记的脐带血造血干细胞后，进一步优化剩余的单个核细胞，可成功提取到符合临床需求的安全且高标准的NK细胞。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞
（1）健康供者的脐带血，转入离心管中充分混匀，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
（2）将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温1800-2400rpm离心15-20min；
（3）吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下800-1400rpm离心3-8min，重复两次；
（4）根据MACS CD34阳性免疫磁珠试剂盒说明书进行CD34+细胞的分选，获得以CD34+为标记的造血干细胞及剩余的单个核细胞成份；
步骤二、剩余单个核细胞成份的优化
（1）剩余的单个核细胞室温800-1400rpm离心3-8min，弃上清；
（2）用含2.5%人血清白蛋白、5%右旋糖苷的PBS缓冲液重悬，800-1400rpm离心3-8min，获得单个核细胞；
步骤三、NK细胞的培养和扩增
（1）自体血浆灭活
a、将步骤一获得的自体血浆加入8%的葡萄糖酸钙，52-58℃放置20-40min，灭活血浆中的补体；
b、2800-3400rpm离心1-5min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用；
（2）细胞培养
a、用PBS重悬滋养层细胞至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清；
b、将步骤一获得的单个核细胞及a中的滋养层细胞用含NK细胞完全培养基重悬，在175cm2培养瓶中混合，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
c、离心换液：将培养基吸出至50mL离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀；同时取离心后上清液进行需、厌氧菌和真菌、支原体检测；
d、每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液，每次添加体积不宜超过现有体积一倍，加液时按5%的自体血浆加入NK细胞培养液；
e、计数，滋养层细胞用PBS重悬至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中；
f、当培养液体积大于300ml则转移至培养袋培养；
g、每天观察、计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，8天之后按1%添加自体血浆即可；
h、计数并收获NK细胞，取1ml细胞悬液进行流式检测，检测CD3-CD56+指标；
步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定
（1）用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率；
（2）NK细胞表面标记物CD3-CD56+检测。
优选的，所述步骤三中的完全培养基为NK细胞无血清基础培养基再添加5%的自体血浆。
优选的，所述步骤一中，脐带血转入离心管中充分混匀后，在室温下1800-2400rpm离心15-20min。
优选的，所述步骤一中，生理盐水与血细胞按1:1的比例进行稀释。
优选的，所述步骤二中，单个核细胞的细胞活率>90%，细胞数量>3×107。
优选的，所述步骤e中，加液使细胞浓度在1.0×106cell/ml以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明为一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，本发明首先分离出脐带血中的自体血浆及单个核细胞，其次利用磁珠法分选出单个核细胞中以CD34+为表面标记的造血干细胞，获得造血干细胞的同时，也收获了除造血干细胞以外的剩余成份，用此剩余成份及自体血浆培养NK细胞，大大实现了资源的合理利用，使得同一份脐带血既可以进行造血干细胞回输，又可以培养出符合临床需求的具有抗肿瘤活性的NK细胞，适于广泛推广应用，具有极大的经济及社会价值。
附图说明
图1为本发明的脐带血自然杀伤细胞形态特征图；
图2为本发明的脐带血自然杀伤细胞表面标志图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本专利中培养NK细胞的滋养层细胞为经辐照后的K562细胞，购买自杭州中赢生物。
一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞
（1）健康供者的脐带血，转入离心管中充分混匀，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
（2）将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温2000rpm离心20min；
（3）吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下1200rpm离心5min，重复两次；
（4）根据MACS CD34阳性免疫磁珠试剂盒说明书进行CD34+细胞的分选，获得以CD34+为标记的造血干细胞及剩余的单个核细胞成份；
步骤二、剩余单个核细胞成份的优化
（1）剩余的单个核细胞室温1200 rpm离心5min，弃上清；
（2）用含2.5%人血清白蛋白、5%右旋糖苷的PBS缓冲液重悬，1200 rpm离心5min，获得单个核细胞；
步骤三、NK细胞的培养和扩增
（1）自体血浆灭活
a、将步骤一获得的自体血浆加入8%的葡萄糖酸钙，56℃放置30min，灭活血浆中的补体；
b、3000rpm离心3min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用；
（2）细胞培养
a、用PBS重悬滋养层细胞至50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清；
b、将步骤一获得的单个核细胞及a中的滋养层细胞用含NK细胞完全培养基重悬，在175cm2培养瓶中混合，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
c、离心换液：将培养基吸出至50mL离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀；同时取离心后上清液进行需、厌氧菌和真菌、支原体检测；
d、每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液，每次添加体积不宜超过现有体积一倍，加液时按5%的自体血浆加入NK细胞培养液；
e、计数，滋养层细胞用PBS重悬至50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中；
f、当培养液体积大于300ml则转移至培养袋培养；
g、每天观察、计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，8天之后按1%添加自体血浆即可；
h、计数并收获NK细胞，取1ml细胞悬液进行流式检测，检测CD3-CD56+指标；
步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定
（1）用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率；
在本实施方式中，经过此方法培养的NK细胞，细胞总数可达到3×109以上，细胞活率在90%以上，具体细胞形态如图1所示。
（2）NK细胞表面标记物CD3-CD56+检测。
在本实施方式中，培养的NK细胞采用流式细胞法进行表型分析，FITC标记的anti-CD3，APC标记的anti-CD56与细胞表面标志性Marker结合，结果如图2所示，细胞表达NK细胞的表面标志CD56，不表达CD3，且CD3-CD56+指标在80%以上，符合NK细胞表型特征。
在本实施方式中，所述步骤三中的完全培养基为NK细胞无血清基础培养基再添加5%的自体血浆。
在本实施方式中，所述步骤一中，生理盐水与血细胞按1:1的比例进行稀释。
在本实施方式中，所述步骤二中，单个核细胞的细胞活率>90%，细胞数量>3×107。
在本实施方式中，所述步骤e中，加液使细胞浓度在1.0×106cell/ml。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、从脐带血中分选CD34+标记的脐带血造血干细胞，并获得剩余单个核细胞
（1）健康供者的脐带血，转入离心管中充分混匀，吸取上层部分获得自体血浆，备用；
（2）将生理盐水与血细胞沉淀稀释，吹打混匀，将混悬液缓慢加到Ficoll层上，室温1800-2400rpm离心15-20min；
（3）吸出离心后的白膜层，PBS缓冲液重悬，室温下800-1400rpm离心3-8min，重复两次；
（4）利用MACS CD34阳性免疫磁珠试剂盒进行CD34+细胞的分选，获得以CD34+为标记的造血干细胞及剩余的单个核细胞成份；
步骤二、剩余单个核细胞成份的优化
（1）剩余的单个核细胞室温800-1400rpm离心3-8min，弃上清；
（2）用含2.5%人血清白蛋白、5%右旋糖苷的PBS缓冲液重悬，800-1400rpm离心3-8min，获得单个核细胞；
步骤三、NK细胞的培养和扩增
（1）自体血浆灭活
a、将步骤一获得的自体血浆加入8%的葡萄糖酸钙，52-58℃放置20-40min，灭活血浆中的补体；
b、2800-3400rpm离心1-5min，弃沉淀，将上清转移至新的离心管中待用；
（2）细胞培养
a、用PBS重悬滋养层细胞至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清；
b、将步骤一获得的单个核细胞及a中的滋养层细胞用含NK细胞完全培养基重悬，在175cm2培养瓶中混合，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
c、离心换液：将培养基吸出至50mL离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀；同时取离心后上清液进行需、厌氧菌和真菌、支原体检测；
d、每天观察细胞，根据细胞悬液颜色或细胞量添加培养液，每次添加体积不宜超过现有体积一倍，加液时按5%的自体血浆加入NK细胞培养液；
e、计数，滋养层细胞用PBS重悬至50ml离心管中，800-1400rpm离心3-8min，弃上清，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中；
f、当培养液体积大于300ml则转移至培养袋培养；
g、每天观察、计数，根据培养液颜色变化或细胞浓度添加培养液，8天之后按1%添加自体血浆即可；
h、计数并收获NK细胞，取1ml细胞悬液进行流式检测，检测CD3-CD56+指标；
步骤四、细胞数量及细胞表型鉴定
（1）用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率；
（2）NK细胞表面标记物CD3-CD56+检测。
2.根据权利要求1所述的一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，脐带血转入离心管中充分混匀后，在室温下1800-2400rpm离心15-20min。
3.根据权利要求1所述的一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，生理盐水与血细胞按1:1的比例进行稀释。
4.根据权利要求1所述的一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，单个核细胞的细胞活率>90%，细胞数量>3×107。
5.根据权利要求1所述的一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的完全培养基为NK细胞无血清基础培养基再添加5%的自体血浆。
6.根据权利要求1所述的一种临床用自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤e中，用NK培养基重悬后添加至培养瓶中，使细胞浓度在1.0×106cell/ml以上。
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