CN107904204A - 一种nk细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增和细胞收获步骤，完成NK细胞的制备；本发明的提供的无血清培养基成分明确，安全性高，单个核细胞经过该培养基培养激活后，扩增能力强，经过15‑18天的培养，扩增160‑200倍，经流式细胞仪检测，CD3‑CD56+的NK细胞含量为65‑70%，CD3+CD56+的NK样T细胞含量为5‑15%，NK和NKT细胞的含量超过75%，对K562的杀伤活性在20：1的效靶比时达到了85%以上，另外本发明中的扩增方法简单，高效，有利于规模化生产。

Description

一种NK细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞的制备方法，具体涉及一种NK细胞的制备方法。
背景技术
NK细胞的发现距今已有几十年的历史，其属于固有免疫系统，是人体免疫系统给的第一道防线。NK细胞约占血液中淋巴细胞的5%-10%，特征指标是CD3-CD56+,是一类无T和B细胞特征性标志的淋巴细胞，同时也存在于外周组织中，如肝脏、腹膜腔、胎盘等，在外周血中循环的NK细胞通常处于免疫静止状态，一旦被细胞因子激活，它们会渗透到大多数组织中攻击肿瘤细胞和病毒感染细胞。
NK细胞是固有免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞，NK细胞识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞。同时，还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的适应性免疫进行调节，是连接机体固有免疫和特异性免疫的桥梁。鉴于应用NK细胞免疫治疗肿瘤具有良好的临床应用前景，近年来NK细胞一直是国内外学者研究的热点。目前，体外培养激活NK细胞的方法很多，有在培养体系中加入动物血清，也有通过灭火的K562细胞作为饲养层体外刺激NK细胞，或通过基因重组技术向细胞内转入外源基因或通过磁珠分选出NK细胞再体外扩增等等，虽然这些方法能够有效的扩增NK细胞，但过程复杂，成本高、不可控因素较多，安全性有待验证，不适用于临床NK细胞治疗。因此，如何提供一种安全、高效、稳定扩增NK细胞的培养基和培养方法成为目前NK细胞临床治疗亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种扩增方法简单，高效，有利于规模化生产的NK细胞的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种NK细胞的制备方法，其创新点在于：经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T75瓶，每瓶10 ml，4℃过夜或37℃预包被1 h，最优浓度为3 ug/ml人源化CD16单抗和2 ug/ml OKT-3单抗；
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性。由专业护士抽取50-80 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15-20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25-30 ml混匀的外周血液，进行离心，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，1500-2000 rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；
（4）接种：细胞以1-2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养；
（5）扩增:第3-4天加入等量的无血清培养基，之后每2-3天根据细胞密度加入1-2倍体积的无血清培养基和0-3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在2-3×106/ml，终体系为2000 ml；
（6）细胞收获和鉴定：经过15-18天的扩增，细胞密度达到3-4×106/ml时，将细胞悬液经过2000 rpm转速下，10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测，细胞用于冻存或其它用途，具体鉴定步骤如下：
a)细胞增殖能力：分别在第0、4、8、12、16天取培养的细胞，用台盼蓝染色计数后，用当天细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数；
b)NK细胞的表型：
取D16天的NK细胞，以DPBS缓冲液制备成浓度为1×108个/ml的细胞悬液,取100 ul细胞悬液放于1.5ml EP管中，分别加入CD3-FITC和CD56-PE抗体各20 ul，4℃避光孵育30min，加入400 ul的DPBS，1500 rpm 离心6 min，弃上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测；
c)NK细胞的杀伤活性：
以处于对数生长期的人白血病细胞K562为靶细胞，将扩增的NK细胞作为效应细胞，采用LDH法检测NK细胞的杀伤活性。具体为按1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔，用酶标仪检测450 nm时的OD值；
杀伤率计算公式为：杀伤率=[1-(实验孔OD值-效应孔OD值\靶细胞孔OD值)]×100%，实验孔为含有效应细胞和靶细胞的孔；
经过此6步即完成了NK细胞的制备。
进一步的，所述步骤（3）中的离心条件为：2000 rpm转速下，离心20-30 min。
进一步的，所述步骤（4）中的接种培养具体条件为：放入37℃，5%的CO2培养箱进行培养。
进一步的，所述步骤（4）、步骤（5）中的无血清培养基的成分为：基础液为AIM-V培养基，添加物为0.5-2%的人血白蛋白、500-1000 U/ml 重组人IL-2、10-50 ng/ml 重组人IL-15、5-40 ng/ml 重组人IL-12、10-100 ng/ml IFN-r、10-100 ng/ml 重组人IL-1a、0-20ng/ml的类胰岛素一号增长因子和5-20 ug/ml的注射用黄芪多糖。
本发明的有益效果如下：本发明提供的无血清培养基成分明确，安全性高，单个核细胞经过该培养基培养激活后，扩增能力强，经过15-18天的培养，扩增160-200倍，经流式细胞仪检测，CD3-CD56+的NK细胞含量为65-70%，CD3+CD56+的NK样T细胞含量为5-15%，NK和NKT细胞的含量超过75%，对K562的杀伤活性在20：1的效靶比时达到了85%以上，另外本发明中的扩增方法简单，高效，有利于规模化生产。
附图说明
图1为 NK细胞D0、D1、D3、D5、D8、D10、D12、D14天的生长图；
图2为不同培养条件下的NK细胞流式图；
图3为不同培养条件下的NK细胞增殖图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T75瓶，每瓶10 ml，4℃过夜或37℃预包被1 h，最优浓度为3ug/ml人源化CD16单抗和2 ug/ml OKT-3单抗；
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性。由专业护士抽取50-80 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15-20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25-30 ml混匀的外周血液，进行离心，离心条件为：2000 rpm转速下，离心20-30 min，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50ml，1500-2000 rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；
（4）接种：细胞以1-2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养，接种培养具体条件为：放入在37℃，5%的CO2培养箱进行培养；
（5）扩增:第3-4天加入等量的无血清培养基，之后每2-3天根据细胞密度加入1-2倍体积的无血清培养基和0-3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在2-3×106/ml，终体系为2000 ml；无血清培养基的成分为：基础液为AIM-V培养基，添加物为0.5-2%的人血白蛋白、500-1000 U/ml 重组人IL-2、10-50 ng/ml重组人IL-15、5-40 ng/ml 重组人IL-12、10-100 ng/ml IFN-r、10-100 ng/ml 重组人IL-1a、0-20 ng/ml的类胰岛素一号增长因子和5-20 ug/ml的注射用黄芪多糖；
（6）细胞收获和鉴定：经过15-18天的扩增，细胞密度达到3-4×106/ml时，将细胞悬液经过2000 rpm转速下,10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测，细胞用于冻存或其它用途；
细胞鉴定：
a)细胞增殖能力：分别在第0、4、8、12、16天取培养的细胞，用台盼蓝染色计数后，用当天细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数
b)NK细胞的表型
取D16天的NK细胞，以DPBS缓冲液制备成浓度为1×108个/ml的细胞悬液,取100 ul细胞悬液放于1.5ml EP管中，分别加入CD3-FITC和CD56-PE抗体各20 ul，4℃避光孵育30min，加入400 ul的DPBS，1500 rpm 离心6 min，弃上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测；
c)NK细胞的杀伤活性
以处于对数生长期的人白血病细胞K562为靶细胞，将扩增的NK细胞作为效应细胞，采用LDH法检测NK细胞的杀伤活性。具体为按1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔，用酶标仪检测450 nm时的OD值。杀伤率计算公式为：杀伤率=[1-(实验孔OD值-效应孔OD值\靶细胞孔OD值)]×100%，实验孔为含有效应细胞和靶细胞的孔；
经过此6步即完成了NK细胞的制备。
实施例1
一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH7.6的无菌DPBS梯度稀释抗体至30 ug/ml人源化CD16单抗和20 ug/ml OKT-3，各取1 ml加入到15 ml离心管内，再加入8 ml DPBS,吹打混匀，将包被液转移到T75瓶内，4℃过夜
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性。由专业护士抽取50 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15 ml淋巴分离液，再缓慢加入25 ml混匀的外周血液，进行离心，离心条件为：2000 rpm转速下，离心20 min，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，1500rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；
（4）接种：细胞以1.5×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养，接种培养具体条件为：放入在37℃，5%的CO2培养箱进行培养；
（5）扩增:第4天加入等量的无血清培养基，之后每2天根据细胞密度加入1.5倍体积的无血清培养基和1%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，最终体系为2000 ml。所述细胞密度控制在2×106/ml，终体系为2000 ml；无血清培养基的成分为：基础液为AIM-V培养基，添加物为0.5%的人血白蛋白、500 U/ml 重组人IL-2、10 ng/ml重组人IL-15、5 ng/ml 重组人IL-12、10 ng/ml IFN-r、10 ng/ml 重组人IL-1a、5 ng/ml的类胰岛素一号增长因子和5 ug/ml的注射用黄芪多糖；
（6）细胞收获和鉴定：经过18天的扩增，将细胞悬液经过2000 rpm,10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测。细胞用于冻存或其它用途，细胞悬液密度达到2.85×106/ml，细胞总数为57×108，细胞扩增了190倍，流式结果显示如图2（3），CD3-CD56+的NK细胞含量为66.24%，CD3+CD56+的NKT细胞含量为6.68%，对人白血病细胞K562在20：1时的杀伤效应为85.2%，如表1。
实施例2
一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和细胞鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH 7.6的无菌DPBS梯度稀释抗体至30 ug/ml人源化CD16单抗和20 ug/ml OKT-3，各取1 ml加入到15 ml离心管内，再加入8 ml DPBS,吹打混匀，将包被液转移到T75瓶内，37℃包被1 h；
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性。由专业护士抽取60 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，4 h内分离；
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15 ml淋巴分离液，再缓慢加入30 ml混匀的外周血液，进行离心，离心条件为：2000 rpm转速下，离心30 min，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，2000rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；
（4）接种：细胞以2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养，接种培养具体条件为：放入在37℃，5%的CO2培养箱进行培养；
（5）扩增:第3天加入等量的无血清培养基，之后每3天根据细胞密度加入2倍体积的无血清培养基和3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在3×106/ml，终体系为2000 ml；无血清培养基的成分为：基础液为AIM-V培养基，添加物为2%的人血白蛋白、1000U/ml 重组人IL-2、50 ng/ml 重组人IL-15、40 ng/ml重组人IL-12、100 ng/ml IFN-r、100 ng/ml 重组人IL-1a、20ng/ml的类胰岛素一号增长因子和20 ug/ml的注射用黄芪多糖；
（6）细胞收获和鉴定：经过18天的扩增，将细胞悬液经过2000 rpm,10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测。细胞用于冻存或其它用途，细胞悬液密度达到3.95×106/ml，细胞总数为79×108，细胞扩增了197.5倍，流式结果显示如图2（4），CD3-CD56+的NK细胞含量为65.26%，CD3+CD56+的NKT细胞含量为10.53%，对人白血病细胞K562在20：1时的杀伤效应为86.5%，如表1。
实施例3
一种NK细胞的制备方法，经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和细胞鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：分别取人源化CD16单抗(1 mg/ml) 3ul和OKT-3单抗(1 mg/ml) 2ul，用PH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释到1 ml，吹打混匀，再加补9 ml无菌DPBS稀释混匀，将包被液转移到T75瓶，4度过夜。
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体等检测项目均为阴性。由专业护士抽取75 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内。4℃保存，2 h内分离。
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25ml混匀的外周血，2000 rpm，离心25 min。收集上层血浆56℃水浴灭火30 min，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，补充生理盐水至 50 ml，抽取0.5 ml样本计数，2000 rpm，离心10 min。重复2次。
（4）接种：将包被瓶内的盐水吸掉，用培养基将表面洗涤1次，细胞以2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，放入37度，5%的CO2培养箱培养。
（5）扩增：细胞的填液时间如下表，具体如图1所示；
培养基成分为含有0.5%的人血白蛋白、600 U/ml 重组人IL-2、20 ng/ml 重组人IL-15、20 ng/ml 重组人IL-12、30 ng/ml IFN-r、30 ng/ml 重组人IL-1a、15 ng/ml的类胰岛素一号增长因子和8 ug/ml黄芪多糖的AIM-V培养基，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养。
（6）细胞收获和鉴定：经过18天的扩增，将细胞悬液经过2000 rpm,10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测。细胞用于冻存或其它用途，细胞悬液密度达到3.96×106/ml，细胞总数为79.2×108，细胞扩增了198倍，流式结果显示如图2（2），CD3-CD56+的NK细胞含量为69.34%，CD3+CD56+的NKT细胞含量为6.84%，对人白血病细胞K562在20：1时的杀伤效应为89.1%，如表1。
对比例
将离心获得的单个核细胞悬液，加入NK培养基，调整细胞密度为2×106/ml，接种到预先包被有2 ug/ml OKT-3单抗的T75瓶中，20 ml，补加5%自体血浆，NK培养基成分为：AIM-V培养基含10ng/ml IL-15和500U/ml IL-2；第3天加入等量的无血清培养基，之后每2天加入1倍体积的无血清培养基和1%的自体血浆，最后一次加液可以不加血浆加，终体系为2000ml。当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养。
经过18天的扩增，将细胞悬液经过2000 rpm,10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测。细胞用于冻存或其它用途，细胞悬液密度达到2.2×106/ml，细胞总数为44×108，细胞扩增了110倍，流式结果显示如图2（1），CD3-CD56+的NK细胞含量为46.23%%，CD3+CD56+的NKT细胞含量为12.52%，对人白血病细胞K562在20：1时的杀伤效应为70.6%，如表1。
表1不同培养条件下的NK细胞杀伤率
如图2所示为不同培养条件下的NK细胞流式图，如图3所示为不同培养条件下的NK细胞增殖图。
本发明的提供的无血清培养基成分明确，安全性高，单个核细胞经过该培养基培养激活后，扩增能力强，经过15-18天的培养，扩增160-200倍，经流式细胞仪检测，CD3-CD56+的NK细胞含量为65-70%，CD3+CD56+的NK样T细胞含量为5-15%，NK和NKT细胞的含量超过75%，对K562的杀伤活性在20：1的效靶比时达到了85%，另外本发明中的扩增方法简单，高效，有利于规模化生产。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (4)

1.一种NK细胞的制备方法，其特征在于：经过培养瓶包被、外周血采集、单个核细胞的分离、接种、扩增、细胞收获和鉴定步骤，完成NK细胞的制备；具体步骤如下：
（1）培养瓶包被：1 mg/ml人源化CD16单抗和1 mg/ml OKT-3单抗，用pH 7.6-8.2的无菌DPBS梯度稀释抗体至所需浓度，包被T75瓶，每瓶10 ml，4℃过夜或37℃预包被1 h，最优浓度为3 ug/ml人源化CD16单抗和2 ug/ml OKT-3单抗；
（2）外周血采集：客户经三甲医院检测HBV抗原、抗HCV抗体，抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体的检测项目均为阴性；
由专业护士抽取50-80 ml外周血，放于含有肝素锂抗凝剂的10 ml无菌采血管内，4℃保存，12 h内分离；
（3）单个核细胞分离：向50 ml离心管内预先加入15-20 ml淋巴分离液，再缓慢加入25-30 ml混匀的外周血液，离心，然后收集上层血浆水浴灭火，吸取白膜层细胞放置到50 ml离心管中，抽取计数样本，补充盐水到50 ml，1500-2000 rpm转速下，离心10 min，重复离心2次；
（4）接种：细胞以1-2×106/ml的密度接种到预先包被的T75培养瓶中，加入20 ml无血清培养基和5%的自体血浆，进行接种培养；
（5）扩增:第3-4天加入等量的无血清培养基，之后每2-3天根据细胞密度加入1-2倍体积的无血清培养基和0-3%的自体血浆，当培养体系超过100 ml时转入T-610培养袋继续培养，所述细胞密度控制在2-3×106/ml，培养终体系为2000 ml；
（6）细胞收获和鉴定：经过15-18天的扩增，细胞密度达到3-4×106/ml时，将细胞悬液经过2000 rpm转速下，10 min离心后，收集底部细胞沉淀，离心前收集细胞悬液用于计数、活力和流式检测，离心后上清用于菌检，内毒素、支原体检测，细胞用于冻存或其它用途，具体鉴定步骤如下：
a)细胞增殖能力：分别在第0、4、8、12、16天取培养的细胞，用台盼蓝染色计数后，用当天细胞总数除以第0天的细胞数，得到扩增倍数；
b)NK细胞的表型：
取D16天的NK细胞，以DPBS缓冲液制备成浓度为1×108个/ml的细胞悬液,取100 ul细胞悬液放于1.5ml EP管中，分别加入CD3-FITC和CD56-PE抗体各20 ul，4℃避光孵育30 min，加入400 ul的DPBS，1500 rpm 离心6 min，弃上清，加入500 ul DPBS混匀后转移到流式上机管中，上机检测；
c)NK细胞的杀伤活性：
以处于对数生长期的人白血病细胞K562为靶细胞，将扩增的NK细胞作为效应细胞，采用LDH法检测NK细胞的杀伤活性，
具体为按1:1、10:1、20:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设置效应细胞孔、靶细胞孔，用酶标仪检测450 nm时的OD值；
杀伤率计算公式为：杀伤率=[1-(实验孔OD值-效应孔OD值\靶细胞孔OD值)]×100%，实验孔为含有效应细胞和靶细胞的孔；
经过此6步即完成了NK细胞的制备。
2.根据权利要求1所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的离心条件为：2000 rpm转速下，离心20-30 min。
3.根据权利要求1所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中的接种培养具体条件为：放入37℃，5%的CO2培养箱进行培养。
4.根据权利要求1所述的一种NK细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）、步骤（5）中的无血清培养基的成分为：基础液为AIM-V培养基，添加物为0.5-2%的人血白蛋白、500-1000 U/ml 重组人IL-2、10-50 ng/ml 重组人IL-15、5-40 ng/ml 重组人IL-12、10-100ng/ml IFN-r、10-100 ng/ml 重组人IL-1a、0-20 ng/ml的类胰岛素一号增长因子和5-20ug/ml的注射用黄芪多糖。
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