CN115005201A - 褪黑素核受体RORα在提高冷冻精液品质中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了褪黑素核受体RORα在提高精液品质中的用途。通过提高褪黑素核受体RORα的表达量，再加入褪黑素后可以进一步提高冷冻精液解冻后的品质。本发明还提供了一种提高牛冷冻精液品质的方法，该方法将冷冻精液解冻处理后添加褪黑素处理同时添加褪黑素核受体RORα激动剂进行孵育。通过检测精子活率、顶体完整性。结果显示，褪黑素通过核受体基因RORα提高了精液品质。本发明方法具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及繁殖领域。具体涉及冷冻精液品质的提升。
背景技术
随着生物技术的快速发展，配子与胚胎冷冻保存正逐步成为替代活畜保种的最有效方式。精液冷冻保存是将精液经过特殊处理，添加保护剂后，保存在超低温下（通常采用液氮-196℃保存），以达到长期保存的目的。其最大优点是可长期保存，且使用不受时间、地域以及雄性动物寿命的限制。同时，可极大提高种公牛的利用效率。
精液在冷冻过程中的冰晶损伤、抗冻保护剂毒性及氧化应激的发生是造成解冻后精液品质不高，输精后受胎率低的主要原因。这很大程度与精子冷冻过程中产生大量ROS相关。多项研究表明，冷冻精液中添加褪黑素有助于精子抗冻保护。添加褪黑素后的冷冻精液中，活精子数、活力以及动力学相关参数显著提高，精子膜系统如顶体膜、质膜的完整性明显提升。然而，当褪黑素添加到一定量后，精子的质量无法进一步提升。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供褪黑素核受体RORα的用途。
本发明的第二个目的在于提供一种提高冷冻精液品质的方法。
本发明研究发现，由于采用褪黑素来提升冷冻精液品质时会存在瓶颈，想要显著提升冷冻精液的品质已然十分困难。当提高褪黑素核受体RORα的表达量时，精液的品质可以得到进一步显著提升。据此，本发明首先提供褪黑素核受体RORα在提升精液品质中的用途。
上述用途中，所述提高精液品质包括提高精子活力以及提高精子顶体完整性。
本发明进一步提供一种提高精液品质的方法，其通过提高褪黑素核受体蛋白RORα的表达量并向精液中添加褪黑素来提高精液品质。
进一步地，所述精液为冷冻精液，包括但不限于牛、马或其他牲畜或人的精液。在实践中，奶牛性控冻精是繁殖领域运用最多的冷冻精液。
进一步地，所述提高精液品质的方法包括步骤：将冷冻精液解冻回收精子后加入PBS和精液稀释液重悬，再加入褪黑素核受体蛋白RORα激动剂和褪黑素并孵育。
优选地，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.001~0.1mM。更优选地，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.01mM。褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的添加浓度以实现褪黑素核受体蛋白RORα表达提升为有效量。在实践中可以根据本发明实施例提供的方法来确定激动剂的有效添加量。
优选地，所述褪黑素加入至终浓度0.001~0.1mM。更优选地，所述褪黑素加入至终浓度0.01mM。褪黑素的添加浓度以实现精液品质提升为有效量。在实践中可以根据本发明实施例中提供的方法来确定褪黑素的有效添加量。
冷冻精液的解冻和回收可以采用现有的常规手段，优选地，可以采用本发明实施例中的方法，用镊子从液氮中迅速取出性控冻精，置于37℃恒温水浴锅中晃动解冻30s，解冻后，用吸水纸擦拭细管，收集精液于1.5mL离心管中，室温378 ×g离心5min，弃上清，再次加入1mL 37℃ PBS 重悬精子，室温378 ×g离心 5min，弃上清，重复两次。
回收后的精子可以采用常规方法来重悬，例如对于性控冻精，采用1.5mL的离心管离心回收则可以添加170μL PBS和170μL精液稀释液来进行重悬。
本发明中的褪黑素核受体蛋白RORα表达量的提升可以通过例如褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的方式来提升，或者通过过表达的方式来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量，或者通过其他调控途径来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量。但是对于冷冻精液的处理而言，添加激动剂是一个简便有效的途径。
本发明还提供褪黑素核受体蛋白RORα激动剂的用途，也即通过黑素核受体蛋白RORα激动剂来提升褪黑素核受体蛋白RORα的表达量，进而提升精液品质。也即可以通过黑素核受体蛋白RORα激动剂来提升精液品质。即提供褪黑素核受体蛋白RORα激动剂在提升精液品质中的用途。
进一步，本发明还提供褪黑素和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂在制备提升冷冻精液品质制剂中的用途。
进一步本发明还提供一种制剂，其包括褪黑素和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂。用于冷冻精液品质的提升。此制剂中含有有效量的褪黑素和有效量的褪黑素核受体蛋白RORα激动剂即可。优选地，两者按照摩尔比之比例如为1~10:1~10，例如为1:0.5~5，例如为1:1。在本发明的一个实施例中，其添加量为终浓度0.01mM褪黑素和0.01mM核受体蛋白RORα激动剂。在具体应用时，可以按照本发明实施例中的方法来测试最终添加量。对于制剂而言，可以将制剂浓度设置成例如褪黑素3.4mM和褪黑素核受体蛋白RORα激动剂3.4mM。
发明提通过提高褪黑素核受体RORα的表达量，再加入褪黑素后可以进一步提高冷冻精液解冻后的品质。本发明方法将冷冻精液解冻处理后添加褪黑素处理同时添加褪黑素核受体RORα激动剂进行孵育，通过检测精子活率、顶体完整性。结果显示，褪黑素通过核受体RORα提高了精液品质。本发明方法及制剂具有良好的应用前景。
附图说明
图1为褪黑素核受体基因RORα在牛冷冻精子中的表达；
图2为牛冷冻精子褪黑素添加前后以及与激动剂和抑制剂共孵育后褪黑素核受体基因RORα的表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明的精神和实质的情况下，对本发明技术方案的修改或润湿，均属于本发明的范围。
实施例1
1.1材料与方法
1.1.1试验设计
取3头奶牛的冷冻精液各8支，分为对照组、褪黑素、褪黑素+激动剂、褪黑素+抑制剂组共孵育2小时后，进行精液品质检测以及RNA和蛋白提取，分别进行荧光定量PCR和Western blot检测，各组试验重复3次。
1.1.2主要仪器设备
名称 厂家
37℃恒温水浴锅 上海科佐
精子（微生物）动静态分析系统 清华同方
荧光显微镜 尼康
枪头 Axygen
离心管 Axygen
1mL注射器 金塔
酶标仪 TICAN
200微升离心管 Axygen
电泳仪 BIO-RAD
凝胶成像系统 BIO-RAD
荧光定量PCR仪 BIO-RAD
蛋白转印系统 BIO-RAD
50μL离心管 Axygen
4℃冰箱 海尔
-80℃冰箱 海尔
1.1.3主要试剂及溶液配制
名称 厂家
Steridyl（精 液 稀 释 液 ） Minitube
Melatonin SIGMA
CGP52608 SIGMA
TO901317 SIGMA
碘化丙啶（PI） SIGMA
Hochest33342 SIGMA
FITC-PNA SIGMA
TRIzol（货号15596026） Invitrogen
RNA/DNA/蛋白质提取试剂盒（货号DP423） TIANGEN
DNAse 1 TIANGEN
氯仿 天津致远
异丙醇 AMRESCO
乙醇 天津致远
DEPC水 MACGENE
RNA-free water TIANGEN
β-巯基乙醇 SIGMA
PBS HYCLONE
RNA store TIANGEN
糖原 碧云天
琼脂糖 BIOWEST
琼脂糖核酸染料染料 TIANGEN
DNA loading buffer TIANGEN
DNA ladder marker TIANGEN
反转录试剂盒 BIO-RAD
SYRB酶 BIO-RAD
50XTAB 碧云天
RIPA裂解液 碧云天
4XLoading buffer BIO-RAD
SDS SIGMA
蛋白酶抑制剂 碧云天
PMSF 碧云天
BCA蛋白浓度试剂盒 碧云天
Bio-rad 10% 预混免染胶 BIO-RAD
Bio-rad 12% 预混免染胶 BIO-RAD
TEMED SIGMA
预染蛋白marker Thermo Fisher
未预染蛋白marker BIO-RAD
电泳液 碧云天
半干转膜液 碧云天
PVDF膜 碧云天
TBST MACGENE
封闭液 碧云天
脱脂牛奶 BIO-RAD
ECL显色液 BIO-RAD
EDTA SIGMA
1.2试验方法
1.2.1精液解冻
用镊子从液氮中迅速取出性控冻精，置于37℃恒温水浴锅中晃动解冻30s，解冻后，用吸水纸擦拭细管，收集精液于1.5mL离心管中，室温378 ×g离心5min，弃上清，再次加入1mL 37℃ PBS 重悬精子，室温378 ×g离心 5min，弃上清，重复两次。
1.2.2褪黑素以及激动剂和拮抗剂孵育
对照组为精液中添加170μL PBS和170μL精液稀释液；褪黑素组在对照基础上添加0.01mM Melatonin；激动剂组是在对照组中添加0.01mM Melatonin+0.01mM CGP52608；抑制剂组是在对照组中添加0.01mM Melatonin+0.01mM TO901317。室温孵育2小时后进行下面的实验。
1.2.3 精液品质测定
精子活率检测：取孵育后的精液混合物100 μL，添加5 μL PI和5 μLHochest33342置于37℃水浴锅避光孵育10 min。取出10 μL制片，置于荧光显微镜下400×观察，统计视野里的死精子数（红色）和总精子数（蓝色），计算精子活率。每个样品取5个视野计算平均值。计算公式为：
精子活率（%）=（总精子数―死精子数）/总精子数×100%
精子顶体完整率检测：取孵育后的精液混合物100 μL，添加5 μL PI、5 μLHochest33342及10 μL FITC-PNA，置于37℃水浴锅避光孵育30min。取出10 μL制片，置于荧光显微镜下400×观察，统计视野里的死精子数(红色)和总精子数（蓝色），以及发生顶体反应或顶体破损精子数（绿色），计算活精子中没有顶体反应的精子数占总精子数的比例。每个样品取5个视野计算平均值。计算公式为：
顶体完整率（%）=（Hochest33342染色精子数-绿色精子数-未染绿色但是染红色的精子数）/ Hochest33342染色精子数×100%
1.2.4精子RNA提取
将离心管置于冰上。向精子沉淀中加入300 μL RNAstore，用移液器将沉淀吹打均匀，置于4℃冰箱中过夜。将精子从冰箱中取出置于冰上，加入2倍体积预冷的PBS，4℃ 5000g离心5min，弃上清，精子沉淀置于冰上备用。
向精子沉淀中加入500μL RL裂解液（按照试剂盒在RL裂解液中加入β-巯基乙醇至终浓度为1%），60℃水浴3min直至溶液透亮，显微镜下观察，没有完整的精子形态。向离心管中加入500微升TRIzol，涡旋15s，静置3min，4℃ 15000×g离心15min，取500μL上清，加入一倍体积100%无水乙醇，轻柔混匀。转入RNase-Free 吸附柱CR3中吸附，13,400×g离心45S去废液，将RNase-Free 吸附柱CR3转入收集管中，向RNase-Free 吸附柱CR3中加入700μL去蛋白液，13,400×g离心45S去废液，向RNase-Free 吸附柱CR3中加入500μL漂洗液，室温静置2min，13,400×g离心45S去废液，重复漂洗一次，静置晾干，将RNase-Free 吸附柱CR3转入新的RNase-Free离心管中，加入RNase-Free ddH2O室温放置2 min，13,400×g离心2min得到RNA溶液。
1.2.5 精子蛋白提取
将离心管置于冰上。向精子沉淀中加入300 μL RNAstore，用移液器将沉淀吹打均匀，置于4℃冰箱中过夜。将精子从冰箱中取出置于冰上，加入2倍体积预冷的PBS，4℃ 5000g离心5min，弃上清，精子沉淀置于冰上备用。
向精子沉淀中加入40μL RIPA、10μL 10% SDS和50μL 4xLoading buffer，1μL蛋白酶抑制剂，1μLPMSF，涡旋震荡混匀。将混合液置于沸水浴中煮10min后，4℃ 15000g离心10min，取上清。
1.2.6 荧光定量PCR
用iScript™ cDNA Synthesis Kit Cdna 反转录试剂盒进行基因组DNA去除和第一链互补DNA的合成。参考国内外文献，根据NCBI数据库中牛的GAPDH、 RORα基因的序列设计特异性引物（表1），并由上海生工生物科技有限公司合成。应用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR系统进行检测，使用iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix荧光定量试剂进行试验，每个样品总体积为20 μL且有 3个重复。PCR扩增循坏条件包括初始变性95℃ 10min，随后开始40个循环的变性95℃持续10 s，退火60℃持续20 s，延伸72℃持续25 s。随后是一个循坏的最终延伸72℃持续5min。用2−ΔΔCT分析法来测定mRNA转录组的相对水平，用持家基因（GAPDH）进行校正，使相对值正常化。取对照组的CT值作为参考，计算每个组分mRNA转录的相对表达水平。
表1 本研究中的引物序列
1.2.7 Western blot
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分离。每个上样孔加入20μL蛋白溶液（2×105个精子），RORα受体蛋白使用10%的分离胶电泳，工作条件为：恒压80V 30min，120V90min。将蛋白转移至PVDF膜，工作条件：恒流250mA 2小时 冰浴。PBS洗膜5min后，加入封闭液，室温封闭1小时，加入RORα（1：2000）蛋白一抗，37℃ 孵育2小时。TBST 洗膜5次，每次5min。山羊抗鼠二抗（1：4000）、室温孵育2小时，TBST洗膜5次，每次5min。ECL孵育3min，曝光检测条带。
1.3统计方法
应用SPSS 25.0统计软件的单因素方差分析和Tukey法多重比较法对数据进行分析和差异显著性比较。结果以平均值±标准差 (Mean±SD）表示，P<0.05 表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。应用origin统计作图软件生成柱状图。利用 Image J图像分析软件计算蛋白条带光密度值。
2 结果
2.1核受体基因在冷冻精子中的表达情况
如图1 所示，冷冻精子中存在核受体基因RORα mRNA和蛋白的表达。
2. 2不同处理对冷冻精液品质的影响
四种不同处理孵育2小时后，精子活率以及顶体完整性在核受体激动剂组中最高，与其他组差异显著（P<0.05）（表2）。
表2 不同处理对精液品质的影响
注：同一列，不同字母之间表示差异显著（P<0.05），相同字母之间表示差异不显著（P >0.05）。
2. 3不同处理对核受体基因表达的影响
与对照组相比，褪黑素处理后，精子中褪黑素受体基因RORα mRNA表达量显著降低，蛋白含量显著增加；添加核受体基因激动剂后，褪黑素受体基因RORα mRNA表达量显著降低，蛋白含量显著增加；而添加核受体抑制剂后，褪黑素受体基因RORα蛋白含量显著降低。如图2所示。
表3 不同处理对RORα相对表达量的影响
由此可知，褪黑素核受体基因促进褪黑素对精子的保护作用，提高了冷冻精液品质。
Claims (10)
1.褪黑素核受体RORα在提高精液品质中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高精液品质包括提高精子活力。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高精液品质包括提高精子顶体完整性。
4.一种提高精液品质的方法，其通过提高褪黑素核受体蛋白RORα的表达量并向精液中添加褪黑素来提高精液品质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述精液为冷冻精液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将冷冻精液解冻回收精子后加入PBS和精液稀释液重悬，再加入褪黑素核受体蛋白RORα激动剂和褪黑素并孵育。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.001~0.1mM。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述褪黑素核受体蛋白RORα激动剂加入至终浓度0.01mM。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述褪黑素加入至终浓度0.001~0.1mM。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述褪黑素加入至终浓度0.01mM。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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