JP6854024B2 - 反芻動物の妊娠判定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
近年、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物の繁殖は、肉用、乳用その他を問わず、殆どが人工授精又は受精卵移植によって行われている。しかしながら、人工授精や受精卵移植による受胎率は高くはなく、例えば乳用牛の受胎率は50％を下回る。低い受胎率は、人工授精又は受精卵移植の回数の増加、妊娠していない空胎期間及び分娩間隔の延長等に起因する生産コスト増大という深刻な経済的負担を畜産業者にもたらす。
家畜動物の発情兆候の微弱化、遺伝的改良による繁殖形質への負の影響、あるいは大規模経営による多頭化飼養等が低い受胎率の原因であると指摘されているが、根本的な原因は明らかでなく、受胎率を高める工夫も行われているものの、改善の兆しは見えていない。そのため、人工授精又は受精卵移植を行った家畜動物の妊娠判定を早期に行い、空胎期間及び分娩間隔を短縮することが強く求められている。
ウシの妊娠判定は、直腸検査法及び超音波診断法によって行われるのが主流である。いずれの方法も判定結果の信頼性は高いが、受精後一ヶ月以上経過するまで実施を待たなければならない。ウシの排卵周期が21日であることからすると、上記の一ヶ月以上の待機は、不受胎が確定するまでの間に新たに人工授精又は受精卵移植を行う機会を1回又は2回失うことを意味する。その結果として生じる空胎期間には、生産収入が得られず、飼育に要する損失額が生じる。
かかる状況において、人工授精又は受精卵移植の後、排卵周期が経過する前に速やかに妊娠判定を行うことが可能となれば、次の排卵周期に合わせて不受胎牛に人工授精又は受精卵移植を行うことが可能となり、事実上の受胎率向上が期待される。
反芻動物では、I型インターフェロンの一種であるインターフェロン−タウ（IFN-τ）が、受精胚の着床に関与している。ウシを例に挙げると、受精後卵割を繰り返しながら子宮内に進入した胚は、将来胎子になり得る内部細胞塊と胎盤を形成する栄養膜細胞の２種類の細胞群に分化した胚盤胞期に達する。この栄養膜細胞からIFN-τが産生され、これにより母体が胚の存在を認識して着床に適した子宮内環境を整える。
反芻動物の栄養膜細胞からのIFN-τの産生量のプロファイルには、反芻動物の種類によらず、卵割から胎盤胞の形成までの産生量は少なく、子宮に到達した胚が収容されている糖タンパク質カプセルである透明帯から脱出するハッチング（孵化）から急速に増加し、着床の前にピークを迎え、その後着床を経て急速に減少するという、概ね共通したパターンがあることが知られている。また母体内膜組織では、栄養膜細胞から産生されるIFN-τの刺激によって、ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1等のIFN-τ誘導性因子（interferon stimulated genes、ISGs）の発現が誘導されることも知られている。一方、卵が受精しない場合又は受精しても受精胚が子宮内に存在していない場合には妊娠は成立せず、IFN-τの産生及びIFN-τ誘導性因子の発現は確認されず、新たな排卵周期が開始されることになる。
以上の機構から、子宮腔内における胚によるIFN-τの産生又は子宮内膜組織におけるIFN-τ誘導性因子の発現は、反芻動物の妊娠の早期判定の指標となり得ると期待される。子宮内部の組織を対象とした検体採取では、対象動物の侵襲や胎子への影響が懸念されるため、代わりに母体の血液検体を対象としたIFN-τ誘導性因子の発現検出による妊娠判定方法が開発された（特許文献１）。しかし、血液診断は、個体毎の遺伝子発現量にばらつきがあるなど、判定結果の信頼性は必ずしも高くはない。
本発明は、対象動物の侵襲や胎子への影響が少なく、飼育現場での実施が可能な家畜動物の妊娠判定を目的とする。
本発明者らは、妊娠したウシの子宮外組織である子宮頸管及び外子宮口周辺腟壁の粘膜においてIFN-τ誘導性因子が発現していることを見出し、さらに腟前庭の粘膜においても同因子が発現していることを見出して、下記の各発明を完成させた。
（１）妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法。
（２）粘膜上皮細胞を含む試料が、腟から陰門までの生殖器から採取される、（１）に記載の方法。
（３）粘膜上皮細胞を含む試料が、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）粘膜上皮細胞を含む試料が、実質的に血液を含まない、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法により測定される、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、粘膜上皮細胞からのRNAの分離精製処理を行わずに測定される、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ヤク及びシカよりなる群から選択される、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）被験反芻動物の粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、及び前記細胞を含む試料を採取するための器具を含む、反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
（１１）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１０）に記載のキット。
（１２）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１０）又は（１１）に記載のキット。
（１３）IFN-τに応答して誘導される分子がmRNAであり、前記分子の発現量を測定するための試薬が核酸増幅法のための試薬である、（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載のキット。
（１４）前記細胞を含む試料を採取するための器具が、低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するための器具である、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載のキット。
（２）粘膜上皮細胞を含む試料が、腟から陰門までの生殖器から採取される、（１）に記載の方法。
（３）粘膜上皮細胞を含む試料が、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）粘膜上皮細胞を含む試料が、実質的に血液を含まない、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法により測定される、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、粘膜上皮細胞からのRNAの分離精製処理を行わずに測定される、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ヤク及びシカよりなる群から選択される、（１）〜（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）被験反芻動物の粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、及び前記細胞を含む試料を採取するための器具を含む、反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
（１１）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１０）に記載のキット。
（１２）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１０）又は（１１）に記載のキット。
（１３）IFN-τに応答して誘導される分子がmRNAであり、前記分子の発現量を測定するための試薬が核酸増幅法のための試薬である、（１０）〜（１２）のいずれか一項に記載のキット。
（１４）前記細胞を含む試料を採取するための器具が、低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するための器具である、（１０）〜（１３）のいずれか一項に記載のキット。
本発明によれば、交配、人工授精又は受精卵移植後に新たな排卵周期が始まる前に速やかに妊娠判定を行うことができる。不受胎のときは次の排卵周期に合わせて交配、人工授精又は受精卵移植を行うことによって空胎期間及び分娩間隔を短縮することが可能となり、実質的に受胎率向上を図ることができる。
本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程を含む。
本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある反芻動物に適用される。妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物は、予め交配、人工授精又は受精卵移植が行われた反芻動物である。交配は、特にはいわゆる種雄との交尾である自然交配により行われるが、人為的な交配であってもよい。また、人工授精及び受精卵移植は当業者に公知のいずれの方法によっても行うことができ、これらの具体的な手技又は方法等によって本発明の適用は制限されない。
本発明の適用対象となる反芻動物は、反芻を行う哺乳動物であれば特に制限はないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヤク、スイギュウ及びシカを好ましい例として挙げることができる。ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウがより好ましい適用対象であり、特にウシ、スイギュウ、ヤクがより好ましい。ウシは肉牛、乳牛のいずれでもよい。スイギュウは、沼沢型、河川型のいずれでもよい。
妊娠初期に相当する期間とは、授精胚によるIFN-τの産生が始まる妊娠認識開始時から着床までに相当する期間をいう。妊娠初期に相当する期間は、ウシでは受精後14〜20日、ヒツジでは14〜20日、ヤギでは16〜20日、ヤクでは14〜19日、スイギュウでは14〜20日、シカでは14〜20日である。本発明は、上記妊娠初期に相当する期間のなかでもIFN-τの産生量がピークに近い期間にある反芻動物に適用されることが特に好ましい。
交配又は人工授精が行われた反芻動物に本発明を適用する場合、妊娠初期に相当する期間は、交配又は人工授精が行われた日を受精後０日として計算される。また、受精卵移植が行われた反芻動物に本発明を適用する場合、妊娠初期に相当する期間は、移植される受精卵が受精した日を受精後０日として計算される。例えば、供卵牛への人工授精が行われた日から７日後に採取された受精後７日目の受精卵を受胚牛に移植したとき、当該受胚牛における妊娠初期に相当する期間は、受精後14〜20日、すなわち受精卵移植後7〜13日である。
子宮頸管から陰門までの生殖器とは、反芻動物の雌の生殖器のうちの子宮頸管から陰門に至るまでの部分であり、典型的には子宮頸管、腟、腟前庭及び陰門を指す。腟の深部、すなわち子宮頸管の腟側の管口の周辺部は、外子宮口周辺部とも呼ばれる。
粘膜上皮細胞を含む試料は、子宮頸管から陰門までの生殖器のうちの少なくとも１の部位から採取されたものであればよい。試料は、直接あるいは、必要に応じて腟を腟鏡等を用いて拡張させた後に、スプーン、綿棒、耳かき、スポンジその他の低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するのに好適な器具を所望の採取部位に到達するまで挿入し、各部位の表面を掻き取る又は拭い取ることで採取することができる。採取された粘膜上皮細胞を含む試料は、粘膜上皮細胞を含むものであるかぎり、粘液、粘膜固有層又は粘膜筋板の細胞を含んでいてもよい。好ましくは、粘膜上皮細胞を含む試料は、腟から陰門までの生殖器から採取される。また好ましくは、粘膜上皮細胞を含む試料は、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される。特に好ましい実施形態において、粘膜上皮細胞を含む試料は、腟から陰門までの生殖器の表面から非侵襲的に採取され、実質的に血液を含まない。ここで「実質的に血液を含まない」とは、当該試料を用いてIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する際に測定結果に影響を与えるような量の血液を含まないことを意味する。典型的に、「実質的に血液を含まない」試料に含まれる細胞は、その大多数が、例えば90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上が粘膜上皮細胞である。
粘膜上皮細胞を含む試料は、被験反芻動物から採取したそのままの状態で測定に供してもよく、又はその中に含まれる細胞を分離して測定に供してもよく、又はこれらのホモジネートを測定に供してもよく、又はこれらから測定対象となるmRNA若しくはタンパク質等の成分を分離して測定に供してもよい。また、冷蔵、凍結若しくは乾燥させてから、又はホルマリン固定などの一般的な保存方法によって処置してから測定に供してもよい。
測定対象の成分を分離せずに組織又は細胞に対して直接測定を行う場合、組織又は細胞の内部に存在する当該成分の検出を容易にするため、細胞膜透過性を高める処置を行って、mRNA又はタンパク質検出のための試薬の細胞内への浸透を促進することもできる。
IFN-τに応答して誘導される分子としては、IFN-τ誘導性因子の遺伝子から転写されるmRNA及び／又は当該遺伝子にコードされるタンパク質を挙げることができる。IFN-τ誘導性因子としては、ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1、OAS-2、LOC100139670、USP18、RSAD2、UBA7、GBP4、GBP5、TNFSF10、JAK1、STAT2及びPLAC8等が知られている。また、IFN-τに応答して誘導される分子は、対象とする反芻動物から摘出された子宮頸管から陰門までの生殖器のうちの少なくとも１の部位から粘膜上皮細胞を分離し、IFN-τの存在下及び非存在下でそれぞれ培養したときの遺伝子発現プロファイルを比較することで特定することもできる。そのような遺伝子発現解析は、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を用いた当業者に公知の手法によって行うことができる。
IFN-τに応答して誘導される分子の好ましい例としては、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質を挙げることができる。
ウシ（Bos taurus）のLOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子から転写されるmRNAの塩基配列、及びそれらにコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、GenBankに表１に示されるアクセッション番号でそれぞれ登録されている。
mRNAの発現量の測定は、対象とするmRNAの塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いた定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅法、mRNAの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、mRNAの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸が固定化されたDNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を用いたマイクロアレイ法その他の、mRNAの発現量を測定することができる公知の方法により行うことができる。前記核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質、放射性同位体、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。特に、反芻動物を飼育している現場での測定、いわゆるオンサイトの測定は、定量PCR法又はLAMP法により行うことが好ましい。
タンパク質の発現量の測定は、対象とするタンパク質に特異的な抗体を用い、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法により行うことができる。この場合、特異抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はFab断片若しくはF(ab’)2断片などの部分断片などでもよい。
特異抗体は、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、３H、１４C、３２P、３５S、１２５I、１３１I等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
本発明の第１の態様は、前記測定工程で測定されたIFN-τに応答して誘導される分子の発現量と、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む。
妊娠していない同種の反芻動物とは、交配、人工授精又は受精卵移植を行っていない、被験反芻動物と同種の雌の反芻動物をいう。また、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞とは、妊娠していない同種の反芻動物の、被験反芻動物の粘膜上皮細胞が採取された部位と同じ部位から採取された粘膜上皮細胞をいい、例えば被験反芻動物の粘膜上皮細胞が子宮頸管から採取されたものである場合、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞は、妊娠していない同種の反芻動物の子宮頸管から採取されたものである。
妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量は、被験反芻動物における前記分子の発現量に対するコントロールとして利用される。したがって、例えば受精後18日目の乳牛の子宮頸管の粘膜上皮細胞におけるISG15遺伝子のmRNAの発現量を測定した場合、同じ排卵周期にある非妊娠乳牛の子宮頸管の粘膜上皮細胞におけるISG15遺伝子のmRNAの発現量がコントロールとなる。コントロールは、非妊娠の反芻動物の妊娠初期に相当する期間におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を予め測定しておくことで用意してもよい。コントロールにおける反芻動物の種類、粘膜上皮細胞の採取部位、採取時期、測定対象となる分子、測定方法等の条件は、測定工程において説明したとおりであり、被験反芻動物と同じ条件を用いることが好ましい。
IFN-τに応答して誘導される前記分子の発現量の比較は、測定方法に応じて適宜行うことができる。例えばリアルタイムPCR法による測定の場合、被験反芻動物及び非妊娠の反芻動物それぞれの粘膜上皮細胞を含む試料を用いてターゲット遺伝子（前記分子の遺伝子）のCt値及びリファレンス遺伝子（ハウスキーピング遺伝子等）のCt値を測定し、比較Ct法により被験反芻動物における前記分子の発現量がコントロールにおける前記分子の発現量の何倍になるかを算出することで、比較を行うことができる。例えば、リアルタイムPCR法又はLAMP法により測定した被験反芻動物における前記分子のΔCt値又はΔTt値が、コントロールのΔCt値又はΔTt値の2倍より大きいとき、好ましくは3倍より大きいとき、より好ましくは5倍より大きいとき、特に好ましくは10倍より大きいときは被験反芻動物は妊娠していると判定することができる。
判定工程における判定は、被験反芻動物及び非妊娠の反芻動物それぞれにおける発現量を測定してそれらを直接比較することで行ってもよいが、妊娠動物由来の検体では陽性となるが非妊娠動物由来の検体では陰性となるように測定条件を設定し、被験反芻動物由来の検体が陽性陰性のいずれの測定結果を示すかを観察することによって行うこともできる。例えば、PCR法やLAMP法等の核酸増幅法によって前記分子の発現量を測定する場合、妊娠動物由来検体では増幅産物が検出されるが非妊娠動物由来検体では増幅産物の量が検出感度以下又は所定の値以下となるように検体を適宜希釈し、又は増幅反応のサイクル数若しくは反応時間を適宜調整し、これを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物の有無を観察することにより又は増幅産物の量を前記所定の値と比較することにより判定を行うこともできる。
第１の態様における判定工程は、前記測定工程で測定されたIFN-τに応答して誘導される分子の発現量とカットオフ値とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する別の判定工程に置き換えることもできる。したがって、本発明の別の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量とカットオフ値とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
カットオフ値は、試料の採取部位や測定対象の前記分子に応じて、ROC曲線等を用いて適宜設定される。被験反芻動物における分子の発現量がカットオフ値より大きければ被験反芻動物は妊娠しており、カットオフ値より小さければ被験反芻動物は妊娠していないと判定することができる。
上記の判定基準に基づいて非妊娠と判定された被験反芻動物は、直近に到来する排卵周期に応じて再度交配、人工授精又は受精卵移植に供すればよい。
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様に基づいて妊娠を判定するためのキットに関する。キットは、粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、具体的には上で挙げた種々の測定方法のための試薬を含む。これらの試薬としては、例えば核酸増幅法又はELISA法のための試薬、典型的にはプライマー核酸又はプローブ核酸、dNTP、特異抗体、二次抗体、酵素、緩衝液、発色試薬等を挙げることができる。キットは、前記分子の発現量を測定するための装置、被験反芻動物から粘膜上皮細胞を含む試料を採取するための器具、例えばスプーン、耳かき、綿棒又はスポンジ等、前記試料を保持するための容器又は支持体等をさらに含んでいてもよい。好ましくは、キットは、IFN-τに応答して誘導される分子の発現量に基づいて被験反芻動物の妊娠を判定することについての指示書をさらに含んでいてもよい。
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１．妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管及び外子宮口周辺部）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
１）粘膜の採取
北海道大学北方生物圏フィールド科学センター生物生産研究農場酪農生産研究施設で飼育されているホルスタイン種搾乳牛のうち、後の妊娠鑑定で妊娠が確定した人工授精後18日が経過したウシ及び人工授精を行っていないウシをそれぞれ選び、外陰部を逆性石鹸水溶液で拭いた。直接、あるいは腟鏡を用いて腟前庭を開口し、市販されている計量スプーンを挿入して、子宮頸管及び外子宮口周辺部それぞれから粘膜を掻き取って採取した。採取した試料の目視観察では血液の混入は確認されず、また顕微鏡観察では試料に含まれる細胞の大多数（95％以上）が粘膜上皮細胞であることが確認された。試料を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに速やかに回収し、-80℃にて凍結保存した。
１）粘膜の採取
北海道大学北方生物圏フィールド科学センター生物生産研究農場酪農生産研究施設で飼育されているホルスタイン種搾乳牛のうち、後の妊娠鑑定で妊娠が確定した人工授精後18日が経過したウシ及び人工授精を行っていないウシをそれぞれ選び、外陰部を逆性石鹸水溶液で拭いた。直接、あるいは腟鏡を用いて腟前庭を開口し、市販されている計量スプーンを挿入して、子宮頸管及び外子宮口周辺部それぞれから粘膜を掻き取って採取した。採取した試料の目視観察では血液の混入は確認されず、また顕微鏡観察では試料に含まれる細胞の大多数（95％以上）が粘膜上皮細胞であることが確認された。試料を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに速やかに回収し、-80℃にて凍結保存した。
２）total RNAの抽出
凍結した粘膜を融解し、ISOGEN IIを500μL加えて混和した。RNase free H2O（Nippon Gene）を200μL加え、15秒間チューブをよく振った。15分間の室温静置の後、4℃、12,000gで15分間遠心し、その上清を1.5 mLチューブに回収した。回収した上清と等量の2-プロパノール（Wako）を加えて転倒混和した後、-30℃で10分間静置した。静置後、4℃、12,000gで10分間遠心し、上清を取り除いた。75％エタノールを各チューブに500μL加えて転倒混和し、4℃、15,000gで5分間遠心した。以上の作業を反復し、上清を取り除いた後10分間真空乾燥し、RNase free H2Oを30μL加えて、total RNAを得た。RNA濃度を測定後、使用時まで-80℃で保存した。
凍結した粘膜を融解し、ISOGEN IIを500μL加えて混和した。RNase free H2O（Nippon Gene）を200μL加え、15秒間チューブをよく振った。15分間の室温静置の後、4℃、12,000gで15分間遠心し、その上清を1.5 mLチューブに回収した。回収した上清と等量の2-プロパノール（Wako）を加えて転倒混和した後、-30℃で10分間静置した。静置後、4℃、12,000gで10分間遠心し、上清を取り除いた。75％エタノールを各チューブに500μL加えて転倒混和し、4℃、15,000gで5分間遠心した。以上の作業を反復し、上清を取り除いた後10分間真空乾燥し、RNase free H2Oを30μL加えて、total RNAを得た。RNA濃度を測定後、使用時まで-80℃で保存した。
３）逆転写反応によるcDNA合成
ReverTra Ace（登録商標） q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて、total RNAからのcDNA逆転写を行った。この反応に要する加熱および冷却の処理はすべてASTEC ProgramTemp Control System PC-815を用いて行った。得られたtotal RNAとRNase free H2Oを、total RNA濃度が100 ng/12μLとなるように調製し、65℃で5分間熱変性処理を加え、速やかに氷上で冷却した。その後、ゲノム由来のDNAを消化するため、それぞれのチューブに4×DN Master MixとgDNA removerを50:1で混合したものを4μL加え、37℃で5分間加熱し、速やかに氷上で冷却した。次に、それぞれのチューブに5 ×RT Master Mix IIを4μL添加し、37℃15分間、50℃で15分間加熱して逆転写反応を行った後、98℃5分間加熱することで酵素失活反応を行い、cDNAを合成した。得られたcDNAは80μLの滅菌水を加えることで5倍希釈し、使用時まで-30℃で保存した。
ReverTra Ace（登録商標） q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて、total RNAからのcDNA逆転写を行った。この反応に要する加熱および冷却の処理はすべてASTEC ProgramTemp Control System PC-815を用いて行った。得られたtotal RNAとRNase free H2Oを、total RNA濃度が100 ng/12μLとなるように調製し、65℃で5分間熱変性処理を加え、速やかに氷上で冷却した。その後、ゲノム由来のDNAを消化するため、それぞれのチューブに4×DN Master MixとgDNA removerを50:1で混合したものを4μL加え、37℃で5分間加熱し、速やかに氷上で冷却した。次に、それぞれのチューブに5 ×RT Master Mix IIを4μL添加し、37℃15分間、50℃で15分間加熱して逆転写反応を行った後、98℃5分間加熱することで酵素失活反応を行い、cDNAを合成した。得られたcDNAは80μLの滅菌水を加えることで5倍希釈し、使用時まで-30℃で保存した。
４）リアルタイムPCR
子宮外組織における妊娠応答性を評価するための目的遺伝子としてISG15、Mx1、Mx2、OAS-1X及び内部標準遺伝子としてH2AFZをそれぞれ選択した。データベース（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で公開されている各遺伝子の塩基配列を参照して、exon-intron境界領域を含む150bp前後の増幅産物が得られるようにForward及びReverseプライマー（表２）を設計、合成した。
子宮外組織における妊娠応答性を評価するための目的遺伝子としてISG15、Mx1、Mx2、OAS-1X及び内部標準遺伝子としてH2AFZをそれぞれ選択した。データベース（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で公開されている各遺伝子の塩基配列を参照して、exon-intron境界領域を含む150bp前後の増幅産物が得られるようにForward及びReverseプライマー（表２）を設計、合成した。
PCR反応液はTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を5μL、上述のForward及びReverseプライマーをそれぞれ0.5μLずつ、鋳型としての前記cDNA溶液を4μL添加して10μLとした。LightCyclerNano（Roche Diagnostics）を用い、95℃, 30秒を1サイクル、95℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒を45サイクル、60℃20秒、95℃20秒をそれぞれ1サイクルとしたリアルタイムPCRを行った。子宮頸管におけるISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1Xの相対的遺伝子発現量を図１に、外子宮口周辺部におけるISG15、Mx1及びMx2の相対的遺伝子発現量を図２に、それぞれ示す。
非妊娠牛の子宮頸管及び外子宮口周辺部粘膜における各遺伝子の発現量と比べて、妊娠確定牛の子宮頸管粘膜におけるISG15の発現量は122倍、Mx1は31倍、Mx2は66倍、及びOAS-1Xは7倍に、また外子宮口周辺部粘膜におけるISG15の発現量は14倍、Mx1は10倍、及びMx2は12倍に、それぞれ亢進していることが確認された。このことから、妊娠確定牛の人工授精作業から18日目の子宮頸管及び外子宮口周辺部の粘膜において、IFN-τによる感作作用が確認された。
実施例２．妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
採取器具として計量スプーンに代えて綿棒を用いた点以外は実施例１と同様にして、妊娠牛の子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭それぞれから、並びに非妊娠牛の子宮頸管から粘膜を採取した。採取後の綿棒を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに浸漬して粘膜中の細胞を回収し、実施例１と同様にしてtotal RNAの抽出、逆転写反応によるcDNA合成及びリアルタイムPCRを行った。
採取器具として計量スプーンに代えて綿棒を用いた点以外は実施例１と同様にして、妊娠牛の子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭それぞれから、並びに非妊娠牛の子宮頸管から粘膜を採取した。採取後の綿棒を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに浸漬して粘膜中の細胞を回収し、実施例１と同様にしてtotal RNAの抽出、逆転写反応によるcDNA合成及びリアルタイムPCRを行った。
ISG15の相対的遺伝子発現量の結果を図３に示す。妊娠時の子宮頸管、外子宮口周辺部（腟深部）、陰部（腟前庭）のいずれの粘膜においてもISG15の発現が観察された。遺伝子発現量は子宮からの距離が離れるに従って減少したものの、非妊娠牛の子宮頸管粘膜における発現量と比べると20−150倍以上の発現の亢進が確認された。
実施例３．定量的RTLAMP法による妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
実施例１の１）及び２）と同様の方法で採取及び調製した妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管粘膜由来RNAサンプルについて、total RNA量をそれぞれ100ngに合わせた後にDNase処理を行い、混入DNAを消化した。DNase処理した妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、DNase未処理の妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、並びにDNase未処理の非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル1000ngを用いて、直接RTLAMP反応を行った。
反応条件は以下のとおりである。一反応につき滅菌蒸留水2.9μl、反応溶液12.5μl、酵素溶液1μl、ISG15を増幅するように設計されたLAMPプライマーFIP（配列番号13）: 40 pmol (0.8μl)、BIP（配列番号14）: 40 pmol (0.8μl)、F3（配列番号11）: 5 pmol (1μl)、B3（配列番号12）: 5 pmol (1μl)を加え、サンプルRNA溶液を5μl加えて最終25μlとし、65℃にて30分以上反応し、ターゲット遺伝子の増幅によって生じた反応物の濁度を継時的な吸光度によって計測した。
実施例１の１）及び２）と同様の方法で採取及び調製した妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管粘膜由来RNAサンプルについて、total RNA量をそれぞれ100ngに合わせた後にDNase処理を行い、混入DNAを消化した。DNase処理した妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、DNase未処理の妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、並びにDNase未処理の非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル1000ngを用いて、直接RTLAMP反応を行った。
反応条件は以下のとおりである。一反応につき滅菌蒸留水2.9μl、反応溶液12.5μl、酵素溶液1μl、ISG15を増幅するように設計されたLAMPプライマーFIP（配列番号13）: 40 pmol (0.8μl)、BIP（配列番号14）: 40 pmol (0.8μl)、F3（配列番号11）: 5 pmol (1μl)、B3（配列番号12）: 5 pmol (1μl)を加え、サンプルRNA溶液を5μl加えて最終25μlとし、65℃にて30分以上反応し、ターゲット遺伝子の増幅によって生じた反応物の濁度を継時的な吸光度によって計測した。
結果を図４及び５に示す。RNAを鋳型とした場合であってもISG15発現量の測定は可能であった。反応開始後30分時の濁度の比較によると、妊娠牛の子宮頸管粘膜におけるISG15発現量は、非妊娠牛の子宮頸管粘膜におけるISG15発現量の約４倍高かった。またDNase処理の有無は定量結果に大きな影響を与えず、またTotal RNA量を10倍に増やした場合にも濁度の推移に大きな変化は認められなかったことから、ゲノムDNA混在下であっても妊娠の判定が可能であることが確認された。
Claims (15)
- 妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法。
- 粘膜上皮細胞を含む試料が、腟から陰門までの生殖器から採取される、請求項１に記載の方法。
- 粘膜上皮細胞を含む試料が、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される、請求項１又は２に記載の方法。
- 粘膜上皮細胞を含む試料が、実質的に血液を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法により測定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、粘膜上皮細胞からのRNAの分離精製処理を行わずに測定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ヤク及びシカよりなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- IFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、及び反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から粘膜上皮細胞を含む試料を採取するための器具を含む、妊娠初期に相当する期間にある反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取される粘膜上皮細胞を含む試料を用いて反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
- IFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬を含む、妊娠初期に相当する期間にある反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取される粘膜上皮細胞を含む試料を用いて反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
- IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１０又は１１に記載のキット。
- IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキット。
- IFN-τに応答して誘導される分子がmRNAであり、前記試薬が核酸増幅法のための試薬である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
- 前記器具が、低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するための器具である、請求項１０又は１２〜１４のいずれか一項に記載のキット。
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