WO2019044885A1 - 反芻動物の妊娠判定方法 - Google Patents

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ruminant
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oas
pregnancy
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昌志 高橋
宏樹 国井
月乃 伊藤
学 川原
花子 唄
惇文 鈴木
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国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method of determining pregnancy of a ruminant animal.
  • Pregnancy determination in cattle is mainly performed by rectal examination and ultrasound. Although the reliability of the judgment results is high in either method, it must wait until one month or more after fertilization. Given that the ovulation cycle of cattle is 21 days, waiting for one month or more will lose one or two chances to newly carry out artificial insemination or fertilized egg transfer until abortion is confirmed. Means The resulting empty period results in lost production costs and loss of breeding.
  • interferon-tau IFN- ⁇
  • a type I interferon is involved in the implantation of fertilized embryos.
  • an embryo that has entered the uterus while being repeatedly cleaved after fertilization is a blastocyst that has differentiated into two cell groups, an inner cell mass that can become an embryo in the future and a trophoblast cell that forms a placenta. The period is reached.
  • IFN- ⁇ is produced from these trophoblast cells, whereby the mother recognizes the presence of the embryo and prepares the intrauterine environment suitable for implantation.
  • IFN- ⁇ production from trophoblast cells of ruminants shows little production from cleavage to formation of placental vesicles regardless of the type of ruminant, and embryos that have reached the uterus are accommodated It is known that there is a generally common pattern of rapid increase from hatching (hatching) that escapes from the zona pellucida, which is a glycoprotein capsule, to a peak before implantation, and then to decrease rapidly after implantation. It is done. In maternal intimal tissue, stimulation of IFN- ⁇ produced from trophoblast cells induces the expression of IFN- ⁇ -inducible genes (ISGs) such as ISG15, Mx1, Mx2 and OAS-1. Is also known.
  • ISGs IFN- ⁇ -inducible genes
  • the present invention is directed to the pregnancy determination of livestock animals that can be carried out at breeding sites with minimal impact on target animals and effects on fetuses.
  • IFN- ⁇ -inducing factor is expressed in the mucous membranes of the cervix and extraperitoneal fistula, which are extrauterine tissues of pregnant cows, and also in the vestibular mucosa.
  • Molecules induced in response to IFN- ⁇ are: LOC100139670, ISG15, OAS-1X, OAS-1Y, OAS-1Z, OAS-2, UBA7, USP18, Mx1, Mx2, RSAD2, GBP4, GBP5, An mRNA transcribed from at least one gene selected from the group consisting of TNFSF10, STAT1, STAT2 and PLAC8 genes or a protein encoded by said gene, according to any one of (1) to (4) Method.
  • the molecule induced in response to IFN- ⁇ is mRNA transcribed from at least one gene selected from the group consisting of ISG15, OAS-1X, Mx1 and Mx2 genes The method according to any one of 5).
  • the expression level of the molecule induced in response to IFN- ⁇ is measured by the quantitative PCR method or the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method. Method described.
  • the expression level of a molecule induced in response to IFN- ⁇ is measured without performing separation and purification treatment of RNA from mucosal epithelial cells. Method described.
  • ruminant is selected from the group consisting of cattle, sheep, goats, water buffalo, yak and deer.
  • a ruminant animal comprising a reagent for measuring the expression level of a molecule induced in response to IFN- ⁇ in mucosal epithelial cells of a test ruminant, and an instrument for collecting a sample containing the cell Kit for determining pregnancy.
  • Molecules induced in response to IFN- ⁇ are: LOC100139670, ISG15, OAS-1X, OAS-1Y, OAS-1Z, OAS-2, UBA7, USP18, Mx1, Mx2, RSAD2, GBP4, GBP5,
  • the molecule transcribed in response to IFN- ⁇ is mRNA transcribed from at least one gene selected from the group consisting of ISG15, OAS-1X, Mx1 and Mx2 genes, (10) or The kit as described in 11).
  • any one of (10) to (12), wherein the molecule induced in response to IFN- ⁇ is mRNA, and the reagent for measuring the expression amount of the molecule is a reagent for nucleic acid amplification method Kit according to one item.
  • the kit according to any one of (10) to (13), wherein the device for collecting a sample containing the cells is a device for collecting a sample minimally or non-invasively. .
  • pregnancy determination can be performed immediately after mating, artificial insemination or fertilized egg transplantation before a new ovulation cycle starts.
  • non-conception by performing mating, artificial insemination or fertilized egg transfer according to the next ovulation cycle, it is possible to shorten the empty period and the interval of parturition, and it is possible to substantially improve the conception rate.
  • IFN- ⁇ in mucosal epithelial cells is measured using a sample containing mucosal epithelial cells collected from a genital organ from the cervix to the vulva of a test ruminant animal in a period corresponding to early pregnancy. Measuring the expression level of the molecule induced in response to the reaction, and comparing the expression level with the expression level of the molecule in the corresponding mucosal epithelial cells of the same non-pregnant ruminant animal.
  • the present invention relates to a method of determining pregnancy of a ruminant animal, which comprises a determination step of determining pregnancy of an animal.
  • IFN- ⁇ in mucosal epithelial cells is measured using a sample containing mucosal epithelial cells collected from a genital organ from the cervix to the vulva of a test ruminant animal in a period corresponding to early pregnancy. Measuring the expression level of the molecule induced in response to
  • the first aspect of the present invention is applied to ruminants in a period corresponding to early pregnancy.
  • the test ruminant in a period corresponding to the early pregnancy is a ruminant on which mating, artificial insemination or fertilized egg transfer has been performed in advance.
  • the mating is carried out by natural mating, in particular, so-called mating with a sore, but may be artificial mating.
  • artificial insemination and fertilized egg transfer can be performed by any method known to those skilled in the art, and the application of the present invention is not limited by these specific procedures or methods.
  • the ruminant animal to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it is a mammal to be ruminated, but preferred examples thereof include cattle, sheep, goats, yaks, buffalo and deer. Cattle, sheep, goats and buffalo are more preferred applications, in particular cattle, buffalo and yak are more preferred. Cattle may be beef cattle or dairy cattle. The buffalo may be either a swamp type or a river type.
  • the period corresponding to the early pregnancy means the period from the start of pregnancy recognition when the production of IFN- ⁇ by the insemination embryo starts to the implantation.
  • the period corresponding to the early pregnancy is 14-20 days after fertilization in cattle, 14-20 days in sheep, 16-20 days in goats, 14-19 days in yaks, 14-20 days in buffalo, 14-20 days in deer It is a day. It is particularly preferable that the present invention is applied to ruminants having a period in which the production of IFN- ⁇ is close to the peak, among the periods corresponding to the early pregnancy.
  • the period corresponding to the early pregnancy is calculated on the day on which mating or artificial insemination was performed as 0 day after fertilization.
  • the period corresponding to the early pregnancy is calculated on the day on which the fertilized egg to be transplanted is fertilized is 0 days after fertilization.
  • the period corresponding to the early pregnancy in the recipient cow is , 14 to 20 days after fertilization, that is, 7 to 13 days after fertilized egg transplantation.
  • the genital tract from the cervix to the vulva is the portion from the cervix to the vulva of the female genitals of ruminants, and typically refers to the cervix, fistula, vaginal antrum and vulva.
  • the deep part of the fistula i.e. the peripheral part of the duct opening on the side of the cervix, is also called the external cervix part.
  • the sample containing the mucosal epithelial cells may be taken from at least one site of the genital organ from the cervix to the vulva.
  • the sample should be a spoon, cotton swab, earwax, sponge or any other suitable device for collecting samples in a minimally invasive or non-invasive manner, either directly or, if necessary, after dilating the eyelid with a speculum, etc. It can be inserted until it reaches a desired collection site, and can be collected by scraping or wiping the surface of each site.
  • the sample containing the collected mucosal epithelial cells may contain cells of mucus, lamina limbal, etc.
  • a sample comprising mucosal epithelial cells is taken from the genitals from the vagina to the vulva.
  • the sample containing mucosal epithelial cells is minimally or noninvasively collected from the genital surface.
  • the sample comprising mucosal epithelial cells is non-invasively collected from the surface of the genitals from the vagina to the vulva and substantially free of blood.
  • substantially free of blood means an amount of blood that affects the measurement result when measuring the expression level of the molecule induced in response to IFN- ⁇ using the sample. Means not included.
  • the majority of the cells contained in the “substantially blood-free” sample are, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more. It is a mucosal epithelial cell.
  • the sample containing the mucosal epithelial cells may be subjected to the measurement as it is obtained from the test ruminant, or the cells contained therein may be separated and subjected to the measurement, or these homogenates may be subjected to the measurement.
  • components such as mRNA or protein to be measured may be separated and used for measurement.
  • they may be stored in a refrigerator, frozen or dried, or treated by a general storage method such as formalin fixation before being subjected to measurement.
  • a treatment for enhancing cell membrane permeability is performed to allow mRNA to be measured.
  • the penetration of reagents for protein detection into cells can also be promoted.
  • the molecule induced in response to IFN- ⁇ can include mRNA transcribed from the gene of IFN- ⁇ -inducing factor and / or the protein encoded by the gene.
  • IFN- ⁇ -inducing factors ISG15, Mx1, Mx2, OAS-1, OAS-2, LOC100139670, USP18, RSAD2, UBA7, GBP4, GBP5, TNFSF10, JAK1, STAT2 and PLAC8 are known.
  • molecules induced in response to IFN- ⁇ isolate mucosal epithelial cells from at least one site of the genital region from the cervix to the vulva isolated from a ruminant of interest, and They can also be identified by comparing gene expression profiles when cultured in the presence and absence, respectively.
  • gene expression analysis can be performed by a method known to those skilled in the art using a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array or the like.
  • Preferred examples of molecules induced in response to IFN- ⁇ include LOC100139670, ISG15, OAS-1X, OAS-1Y, OAS-1Z, OAS-2, UBA7, USP18, Mx1, Mx2, RSAD2, GBP4, GBP5 And mRNA transcribed from at least one gene selected from the group consisting of TNFSF10, STAT1, STAT2 and PLAC8 genes or a protein encoded by the gene.
  • the expression level of mRNA can be measured by a nucleic acid amplification method such as a quantitative PCR method or a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method using a primer nucleic acid consisting of an appropriate base sequence designed based on the base sequence of the target mRNA.
  • a hybridization method using a probe nucleic acid consisting of a base sequence capable of hybridizing to a base sequence of mRNA under stringent conditions, a DNA chip on which a nucleic acid consisting of a base sequence hybridizable to the base sequence of mRNA is immobilized A gene chip, a microchip, a microarray method using a bead array or the like, and other known methods capable of measuring the expression level of mRNA.
  • the nucleic acid may be labeled with a fluorescent substance, a radioactive isotope, an enzyme, biotin, streptavidin or another labeling compound depending on the method used.
  • a fluorescent substance e.g., a radioactive isotope
  • an enzyme e.g., a peroxide
  • biotin e.g., a peroxide
  • streptavidin e.g., a radioactive isotope
  • another labeling compound e.g., an enzyme, biotin, streptavidin or another labeling compound depending on the method used.
  • the measurement at the site where a ruminant animal is bred that is, the so-called on-site measurement be performed by a quantitative PCR method or a LAMP method.
  • the amount of protein expression can be measured using an antibody specific for the target protein, direct competition, indirect competition, ELISA such as sandwich, RIA, in situ hybridization, immunoblot analysis, western blot analysis, And by known methods such as tissue array analysis.
  • the specific antibody is not limited by the species of animal from which it is derived, and may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may be an antibody consisting of full-length immunoglobulin or a partial fragment such as Fab fragment or F (ab ') 2 fragment. .
  • Specific antibodies include fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine, phalloidin etc.), colloidal particles such as gold, fluorescent microbeads such as Luminex (registered trademark, Luminex), heavy metals (eg, gold, platinum etc.), dye proteins (eg For example, phycoerythrin, phycocyanin etc., radioactive isotopes (eg 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I, 131 I etc.), enzymes etc. (eg peroxidase, alkaline phosphatase etc.), biotin, streptavidin It may be labeled by another labeling compound.
  • fluorescent substances eg, FITC, rhodamine, phalloidin etc.
  • colloidal particles such as gold
  • fluorescent microbeads such as Luminex (registered trademark, Luminex)
  • heavy metals eg, gold, platinum etc.
  • dye proteins eg For example, phycoerythr
  • the determination process which determines the pregnancy of a test ruminant animal by comparing with the expression level is included.
  • a non-pregnant homologous ruminant refers to a female ruminant of the same species as the test ruminant without mating, artificial insemination or fertilized egg transfer.
  • the corresponding mucosal epithelial cells of the non-pregnant allogeneic ruminant are the same as those of the non-pregnant allogeneic ruminant from the same site as the mucosal epithelial cells of the test ruminant were collected.
  • the mucosal epithelial cells of the test ruminant are taken from the cervix
  • the corresponding mucosal epithelial cells of the same non-pregnant same ruminant are from the uterus of the same non-pregnant same ruminant It was collected from the cervix.
  • the expression level of the molecule in the corresponding mucosal epithelial cells of the same non-pregnant ruminant animal is used as a control for the expression level of the molecule in the test ruminant animal. Therefore, for example, when measuring the expression level of ISG15 gene mRNA in the mucosal epithelial cells of the cervix of the dairy cow at day 18 after fertilization, the mRNA of the ISG15 gene in the mucosal epithelial cells of the cervical canal of nonpregnant dairy cows in the same ovulation cycle The expression level of is a control.
  • the control may be prepared by measuring in advance the expression level of a molecule induced in response to IFN- ⁇ in a period corresponding to the early pregnancy of a non-pregnant ruminant animal.
  • Conditions such as type of ruminant in control, collection site of mucosal epithelial cells, collection period, molecule to be measured, measurement method, etc. are as described in the measurement step, and it is preferable to use the same conditions as the test ruminant .
  • the comparison of the expression level of the molecule induced in response to IFN- ⁇ can be appropriately performed according to the measurement method.
  • the Ct value of a target gene (gene of the aforementioned molecule) and reference gene (housekeeping gene etc.) of samples containing mucosal epithelial cells of test ruminants and non-pregnant ruminants respectively
  • a comparison can be made by measuring the Ct value and calculating how many times the expression level of the molecule in the test ruminant is by the comparison Ct method to be the expression level of the molecule in the control.
  • the ⁇ Ct value or ⁇ Tt value of the molecule in the test ruminant measured by real-time PCR method or LAMP method is larger than twice the ⁇ Ct value or ⁇ Tt value of the control, preferably more than 3 times, more preferably When it is more than 5 times, particularly preferably more than 10 times, it can be determined that the test ruminant is pregnant.
  • the determination in the determination step may be performed by measuring the expression level in each of the test ruminant and the non-pregnant ruminant and directly comparing them, but a sample derived from a pregnant animal is positive but it is derived from a non-pregnant animal
  • the measurement conditions can be set so as to be negative for the sample of and the sample from the test ruminant can be used to observe which positive / negative measurement result is shown.
  • the expression amount of the molecule is measured by a nucleic acid amplification method such as PCR method or LAMP method
  • a nucleic acid amplification method such as PCR method or LAMP method
  • an amplification product is detected in a pregnancy animal-derived sample, but in a non-pregnant animal-derived sample, the amount of amplification product is below detection sensitivity or
  • the sample is diluted appropriately so that it does not exceed a predetermined value, or the cycle number or reaction time of the amplification reaction is appropriately adjusted, and a nucleic acid amplification reaction is performed using this to observe the presence or absence of the amplification product, or
  • the determination may also be made by comparing the amount of V with the predetermined value.
  • the determination step in the first aspect is another method of determining pregnancy of a test ruminant by comparing the expression level of the molecule induced in response to IFN- ⁇ measured in the measurement step with the cutoff value. It can be replaced by the determination step. Therefore, another aspect of the present invention relates to IFN-in the mucosal epithelial cells, using a sample containing mucosal epithelial cells collected from the genital tract from the cervix to the vulva of a test ruminant animal in a period corresponding to early pregnancy. The method further comprises the steps of: measuring the expression level of the molecule induced in response to ⁇ ; and determining the pregnancy of the test ruminant by comparing the expression level with the cutoff value. It relates to the determination method.
  • the cutoff value is appropriately set using an ROC curve or the like according to the sample collection site and the molecule to be measured. If the expression level of the molecule in the test ruminant is larger than the cut-off value, the test ruminant is pregnant, and if smaller than the cut-off value, it can be determined that the test ruminant is not pregnant.
  • test ruminant animal determined to be non-pregnant based on the above criteria may be subjected to mating, artificial insemination or fertilized egg transplantation again according to the ovulation cycle which arrives most recently.
  • kits for determining pregnancy contains a reagent for measuring the amount of expression of a molecule induced in response to IFN- ⁇ in mucosal epithelial cells, specifically a reagent for the various measuring methods mentioned above.
  • these reagents include reagents for nucleic acid amplification or ELISA, typically, primer nucleic acids or probe nucleic acids, dNTPs, specific antibodies, secondary antibodies, enzymes, buffers, color development reagents, etc. .
  • the kit may be a device for measuring the expression level of the molecule, an apparatus for collecting a sample containing mucosal epithelial cells from a test ruminant, for example, a container for holding the sample, such as a spoon, earpick, swab or sponge. Or may further include a support or the like.
  • the kit may further comprise instructions for determining the pregnancy of the test ruminant based on the expression level of the molecule induced in response to IFN- ⁇ .
  • Example 1 Expression analysis of interferon-inducible factor in extrauterine tissues (cervical and extracervical area) of pregnant and nonpregnant cows 1) Collection of mucous membranes Among Holstein milking cows reared at Hokkaido University Northern Biosphere Field Science Center Bioproduction Research Farm Dairy Production Research Institute, 18 days have passed since artificial insemination when pregnancy was confirmed by later pregnancy identification Cows and cows not subjected to artificial insemination were respectively selected, and the vulva was wiped with reverse soap solution. The antrum was opened directly or with a magnifying glass, and a commercially available measuring spoon was inserted to scrape and collect the mucous membrane from each of the cervix and the external uterine ostia area.
  • the sample was quickly collected in an ice-cooled 1.5 mL tube by dispensing 500 ⁇ L of ISOGEN II (Nippon Gene) and stored frozen at -80 ° C.
  • RNA concentration 500 ⁇ L was added to each tube, mixed by inversion, and centrifuged at 15,000 g for 5 minutes at 4 ° C. The above operations were repeated, and after removing the supernatant, it was dried under vacuum for 10 minutes, and 30 ⁇ L of RNase free H 2 O was added to obtain total RNA. After measuring the RNA concentration, it was stored at -80.degree. C. until use.
  • RNA synthesis by reverse transcription reaction Reverse transcription from total RNA was performed using ReverTra Ace (registered trademark) q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover (TOYOBO). All heating and cooling processes required for this reaction were performed using ASTEC ProgramTemp Control System PC-815. The obtained total RNA and RNase free H 2 O were prepared to have a total RNA concentration of 100 ng / 12 ⁇ L, heat-denatured at 65 ° C. for 5 minutes, and rapidly cooled on ice. Then, in order to digest the DNA derived from the genome, 4 ⁇ L of a 50: 1 mixture of 4 ⁇ DN Master Mix and gDNA remover was added to each tube, heated at 37 ° C.
  • the PCR reaction solution was 10 ⁇ L by adding 5 ⁇ L of THUNDER BIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO), 0.5 ⁇ L each of the above-mentioned Forward and Reverse primers, and 4 ⁇ L of the cDNA solution as a template.
  • TOYOBO THUNDER BIRD SYBR qPCR Mix
  • Real time PCR was performed.
  • the relative gene expression levels of ISG15, Mx1, Mx2 and OAS-1X in the cervix are shown in FIG. 1, and the relative gene expression levels of ISG15, Mx1 and Mx2 in the outer uterine cervix area are shown in FIG. 2, respectively.
  • the expression level of ISG15 in the cervix mucosa in confirmed pregnant cows is 122 times, Mx1 is 31 times, Mx2 is 66 times, and It was confirmed that the expression level of ISG15 in the mucous membrane of the outer periphery of the cervix was 14 times, that of Mx1 was 10 times, and that of Mx2 was 12 times that of OAS-1X. From this, on the 18th day after artificial insemination work of the pregnancy-confirmed cow, the sensitization action by IFN- ⁇ was confirmed in the mucous membrane of the cervix and the external cervix area.
  • Example 2 Expression analysis of interferon-inducible factor in extrauterine tissues (cervical canal, outer utero-peripheral area and antrum) of pregnant and non-pregnant cows Example 1 and Example 1 except that a cotton swab was used instead of a measuring spoon as a collection tool Similarly, mucous membranes were collected from the cervix of the pregnant cow, the periphery of the external cervix and the antrum, and from the cervix of the nonpregnant cow.
  • the collected cotton swab is dipped in 500 ⁇ L of ISOGEN II (Nippon Gene) and immersed in an ice-cooled 1.5 mL tube to recover cells in the mucous membrane, and extraction and reverse transcription of total RNA in the same manner as in Example 1 CDNA synthesis by reaction and real-time PCR were performed.
  • ISOGEN II Natural Gene
  • the results of relative gene expression levels of ISG15 are shown in FIG.
  • the expression of ISG15 was observed in any of the mucous membranes of the cervix at the time of pregnancy, the periphery of the external cervix (deep region), and the genital region (ventricular antrum). Although the gene expression level decreased as the distance from the uterus was increased, 20 to 150 times or more of the expression level was confirmed to be enhanced compared to the expression level in the cervical mucosa of nonpregnant cattle.
  • Example 3 Expression analysis of interferon-inducible factor in extrauterine tissue (cervical canal) of pregnant cows and non-pregnant cows by quantitative RTLAMP method Pregnant cows and non-pregnant collected and prepared in the same manner as in 1) and 2) of Example 1 The amount of total RNA was adjusted to 100 ng for each of the bovine cervix mucosa-derived RNA samples, followed by DNase treatment to digest contaminating DNA.

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Abstract

【課題】　本発明は、対象動物の侵襲や胎子への影響が少なく、飼育現場での実施が可能な家畜動物の妊娠判定を目的とする。 【解決手段】　本発明は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。本発明によれば、交配、人工授精又は受精卵移植後に新たな排卵周期が始まる前に速やかに妊娠判定を行うことができる。

Description

反芻動物の妊娠判定方法
　本発明は、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
　近年、ウシ、ヒツジ、ヤギ等の家畜動物の繁殖は、肉用、乳用その他を問わず、殆どが人工授精又は受精卵移植によって行われている。しかしながら、人工授精や受精卵移植による受胎率は高くはなく、例えば乳用牛の受胎率は50％を下回る。低い受胎率は、人工授精又は受精卵移植の回数の増加、妊娠していない空胎期間及び分娩間隔の延長等に起因する生産コスト増大という深刻な経済的負担を畜産業者にもたらす。
　家畜動物の発情兆候の微弱化、遺伝的改良による繁殖形質への負の影響、あるいは大規模経営による多頭化飼養等が低い受胎率の原因であると指摘されているが、根本的な原因は明らかでなく、受胎率を高める工夫も行われているものの、改善の兆しは見えていない。そのため、人工授精又は受精卵移植を行った家畜動物の妊娠判定を早期に行い、空胎期間及び分娩間隔を短縮することが強く求められている。
　ウシの妊娠判定は、直腸検査法及び超音波診断法によって行われるのが主流である。いずれの方法も判定結果の信頼性は高いが、受精後一ヶ月以上経過するまで実施を待たなければならない。ウシの排卵周期が21日であることからすると、上記の一ヶ月以上の待機は、不受胎が確定するまでの間に新たに人工授精又は受精卵移植を行う機会を1回又は2回失うことを意味する。その結果として生じる空胎期間には、生産収入が得られず、飼育に要する損失額が生じる。
　かかる状況において、人工授精又は受精卵移植の後、排卵周期が経過する前に速やかに妊娠判定を行うことが可能となれば、次の排卵周期に合わせて不受胎牛に人工授精又は受精卵移植を行うことが可能となり、事実上の受胎率向上が期待される。
　反芻動物では、I型インターフェロンの一種であるインターフェロン－タウ（IFN-τ）が、受精胚の着床に関与している。ウシを例に挙げると、受精後卵割を繰り返しながら子宮内に進入した胚は、将来胎子になり得る内部細胞塊と胎盤を形成する栄養膜細胞の２種類の細胞群に分化した胚盤胞期に達する。この栄養膜細胞からIFN-τが産生され、これにより母体が胚の存在を認識して着床に適した子宮内環境を整える。
　反芻動物の栄養膜細胞からのIFN-τの産生量のプロファイルには、反芻動物の種類によらず、卵割から胎盤胞の形成までの産生量は少なく、子宮に到達した胚が収容されている糖タンパク質カプセルである透明帯から脱出するハッチング（孵化）から急速に増加し、着床の前にピークを迎え、その後着床を経て急速に減少するという、概ね共通したパターンがあることが知られている。また母体内膜組織では、栄養膜細胞から産生されるIFN-τの刺激によって、ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1等のIFN-τ誘導性因子（interferon stimulated genes、ISGs）の発現が誘導されることも知られている。一方、卵が受精しない場合又は受精しても受精胚が子宮内に存在していない場合には妊娠は成立せず、IFN-τの産生及びIFN-τ誘導性因子の発現は確認されず、新たな排卵周期が開始されることになる。
　以上の機構から、子宮腔内における胚によるIFN-τの産生又は子宮内膜組織におけるIFN-τ誘導性因子の発現は、反芻動物の妊娠の早期判定の指標となり得ると期待される。子宮内部の組織を対象とした検体採取では、対象動物の侵襲や胎子への影響が懸念されるため、代わりに母体の血液検体を対象としたIFN-τ誘導性因子の発現検出による妊娠判定方法が開発された（特許文献１）。しかし、血液診断は、個体毎の遺伝子発現量にばらつきがあるなど、判定結果の信頼性は必ずしも高くはない。
特表２００４－５３４２２４号公報
　本発明は、対象動物の侵襲や胎子への影響が少なく、飼育現場での実施が可能な家畜動物の妊娠判定を目的とする。
　本発明者らは、妊娠したウシの子宮外組織である子宮頸管及び外子宮口周辺腟壁の粘膜においてIFN-τ誘導性因子が発現していることを見出し、さらに腟前庭の粘膜においても同因子が発現していることを見出して、下記の各発明を完成させた。
（１）妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法。
（２）粘膜上皮細胞を含む試料が、腟から陰門までの生殖器から採取される、（１）に記載の方法。
（３）粘膜上皮細胞を含む試料が、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）粘膜上皮細胞を含む試料が、実質的に血液を含まない、（１）～（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１）～（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１）～（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法により測定される、（１）～（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、粘膜上皮細胞からのRNAの分離精製処理を行わずに測定される、（１）～（７）のいずれか一項に記載の方法。
（９）反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ヤク及びシカよりなる群から選択される、（１）～（８）のいずれか一項に記載の方法。
（１０）被験反芻動物の粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、及び前記細胞を含む試料を採取するための器具を含む、反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
（１１）IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、（１０）に記載のキット。
（１２）IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、（１０）又は（１１）に記載のキット。
（１３）IFN-τに応答して誘導される分子がmRNAであり、前記分子の発現量を測定するための試薬が核酸増幅法のための試薬である、（１０）～（１２）のいずれか一項に記載のキット。
（１４）前記細胞を含む試料を採取するための器具が、低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するための器具である、（１０）～（１３）のいずれか一項に記載のキット。
　本発明によれば、交配、人工授精又は受精卵移植後に新たな排卵周期が始まる前に速やかに妊娠判定を行うことができる。不受胎のときは次の排卵周期に合わせて交配、人工授精又は受精卵移植を行うことによって空胎期間及び分娩間隔を短縮することが可能となり、実質的に受胎率向上を図ることができる。
妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管の粘膜におけるISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1Xの相対的遺伝子発現量を示すグラフである。 妊娠牛及び非妊娠牛の外子宮口周辺部の粘膜におけるISG15、Mx1及びMx2の相対的遺伝子発現量を示すグラフである。 妊娠牛の子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭並びに非妊娠牛の子宮頸管の粘膜におけるISG15の相対的遺伝子発現量を示すグラフである。 妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管の粘膜におけるISG15の遺伝子発現量をRTLAMP法で定量的に測定した結果（経時的な濁度の推移）を示すグラフである。 妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管の粘膜におけるISG15の遺伝子発現量をRTLAMP法で定量的に測定した結果（LAMP反応開始後30分時の濁度）を示すグラフである。
　本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
　本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程を含む。
　本発明の第１の態様は、妊娠初期に相当する期間にある反芻動物に適用される。妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物は、予め交配、人工授精又は受精卵移植が行われた反芻動物である。交配は、特にはいわゆる種雄との交尾である自然交配により行われるが、人為的な交配であってもよい。また、人工授精及び受精卵移植は当業者に公知のいずれの方法によっても行うことができ、これらの具体的な手技又は方法等によって本発明の適用は制限されない。
　本発明の適用対象となる反芻動物は、反芻を行う哺乳動物であれば特に制限はないが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヤク、スイギュウ及びシカを好ましい例として挙げることができる。ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウがより好ましい適用対象であり、特にウシ、スイギュウ、ヤクがより好ましい。ウシは肉牛、乳牛のいずれでもよい。スイギュウは、沼沢型、河川型のいずれでもよい。
　妊娠初期に相当する期間とは、授精胚によるIFN-τの産生が始まる妊娠認識開始時から着床までに相当する期間をいう。妊娠初期に相当する期間は、ウシでは受精後14～20日、ヒツジでは14～20日、ヤギでは16～20日、ヤクでは14～19日、スイギュウでは14～20日、シカでは14～20日である。本発明は、上記妊娠初期に相当する期間のなかでもIFN-τの産生量がピークに近い期間にある反芻動物に適用されることが特に好ましい。
　交配又は人工授精が行われた反芻動物に本発明を適用する場合、妊娠初期に相当する期間は、交配又は人工授精が行われた日を受精後０日として計算される。また、受精卵移植が行われた反芻動物に本発明を適用する場合、妊娠初期に相当する期間は、移植される受精卵が受精した日を受精後０日として計算される。例えば、供卵牛への人工授精が行われた日から７日後に採取された受精後７日目の受精卵を受胚牛に移植したとき、当該受胚牛における妊娠初期に相当する期間は、受精後14～20日、すなわち受精卵移植後7～13日である。
　子宮頸管から陰門までの生殖器とは、反芻動物の雌の生殖器のうちの子宮頸管から陰門に至るまでの部分であり、典型的には子宮頸管、腟、腟前庭及び陰門を指す。腟の深部、すなわち子宮頸管の腟側の管口の周辺部は、外子宮口周辺部とも呼ばれる。
　粘膜上皮細胞を含む試料は、子宮頸管から陰門までの生殖器のうちの少なくとも１の部位から採取されたものであればよい。試料は、直接あるいは、必要に応じて腟を腟鏡等を用いて拡張させた後に、スプーン、綿棒、耳かき、スポンジその他の低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するのに好適な器具を所望の採取部位に到達するまで挿入し、各部位の表面を掻き取る又は拭い取ることで採取することができる。採取された粘膜上皮細胞を含む試料は、粘膜上皮細胞を含むものであるかぎり、粘液、粘膜固有層又は粘膜筋板の細胞を含んでいてもよい。好ましくは、粘膜上皮細胞を含む試料は、腟から陰門までの生殖器から採取される。また好ましくは、粘膜上皮細胞を含む試料は、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される。特に好ましい実施形態において、粘膜上皮細胞を含む試料は、腟から陰門までの生殖器の表面から非侵襲的に採取され、実質的に血液を含まない。ここで「実質的に血液を含まない」とは、当該試料を用いてIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する際に測定結果に影響を与えるような量の血液を含まないことを意味する。典型的に、「実質的に血液を含まない」試料に含まれる細胞は、その大多数が、例えば90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上が粘膜上皮細胞である。
　粘膜上皮細胞を含む試料は、被験反芻動物から採取したそのままの状態で測定に供してもよく、又はその中に含まれる細胞を分離して測定に供してもよく、又はこれらのホモジネートを測定に供してもよく、又はこれらから測定対象となるmRNA若しくはタンパク質等の成分を分離して測定に供してもよい。また、冷蔵、凍結若しくは乾燥させてから、又はホルマリン固定などの一般的な保存方法によって処置してから測定に供してもよい。
　測定対象の成分を分離せずに組織又は細胞に対して直接測定を行う場合、組織又は細胞の内部に存在する当該成分の検出を容易にするため、細胞膜透過性を高める処置を行って、mRNA又はタンパク質検出のための試薬の細胞内への浸透を促進することもできる。
　IFN-τに応答して誘導される分子としては、IFN-τ誘導性因子の遺伝子から転写されるmRNA及び／又は当該遺伝子にコードされるタンパク質を挙げることができる。IFN-τ誘導性因子としては、ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1、OAS-2、LOC100139670、USP18、RSAD2、UBA7、GBP4、GBP5、TNFSF10、JAK1、STAT2及びPLAC8等が知られている。また、IFN-τに応答して誘導される分子は、対象とする反芻動物から摘出された子宮頸管から陰門までの生殖器のうちの少なくとも１の部位から粘膜上皮細胞を分離し、IFN-τの存在下及び非存在下でそれぞれ培養したときの遺伝子発現プロファイルを比較することで特定することもできる。そのような遺伝子発現解析は、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を用いた当業者に公知の手法によって行うことができる。
　IFN-τに応答して誘導される分子の好ましい例としては、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質を挙げることができる。
　ウシ（Bos taurus）のLOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子から転写されるmRNAの塩基配列、及びそれらにコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、GenBankに表１に示されるアクセッション番号でそれぞれ登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　mRNAの発現量の測定は、対象とするmRNAの塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いた定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等の核酸増幅法、mRNAの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、mRNAの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸が固定化されたDNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を用いたマイクロアレイ法その他の、mRNAの発現量を測定することができる公知の方法により行うことができる。前記核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質、放射性同位体、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。特に、反芻動物を飼育している現場での測定、いわゆるオンサイトの測定は、定量PCR法又はLAMP法により行うことが好ましい。
　タンパク質の発現量の測定は、対象とするタンパク質に特異的な抗体を用い、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法により行うことができる。この場合、特異抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はFab断片若しくはF(ab’)2断片などの部分断片などでもよい。
　特異抗体は、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Luminex（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば、金、白金等）、色素タンパク質（例えば、フィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば、３H、１４C、３２P、３５S、１２５I、１３１I等）、酵素等（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
　本発明の第１の態様は、前記測定工程で測定されたIFN-τに応答して誘導される分子の発現量と、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む。
　妊娠していない同種の反芻動物とは、交配、人工授精又は受精卵移植を行っていない、被験反芻動物と同種の雌の反芻動物をいう。また、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞とは、妊娠していない同種の反芻動物の、被験反芻動物の粘膜上皮細胞が採取された部位と同じ部位から採取された粘膜上皮細胞をいい、例えば被験反芻動物の粘膜上皮細胞が子宮頸管から採取されたものである場合、妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞は、妊娠していない同種の反芻動物の子宮頸管から採取されたものである。
　妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量は、被験反芻動物における前記分子の発現量に対するコントロールとして利用される。したがって、例えば受精後18日目の乳牛の子宮頸管の粘膜上皮細胞におけるISG15遺伝子のmRNAの発現量を測定した場合、同じ排卵周期にある非妊娠乳牛の子宮頸管の粘膜上皮細胞におけるISG15遺伝子のmRNAの発現量がコントロールとなる。コントロールは、非妊娠の反芻動物の妊娠初期に相当する期間におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を予め測定しておくことで用意してもよい。コントロールにおける反芻動物の種類、粘膜上皮細胞の採取部位、採取時期、測定対象となる分子、測定方法等の条件は、測定工程において説明したとおりであり、被験反芻動物と同じ条件を用いることが好ましい。
　IFN-τに応答して誘導される前記分子の発現量の比較は、測定方法に応じて適宜行うことができる。例えばリアルタイムPCR法による測定の場合、被験反芻動物及び非妊娠の反芻動物それぞれの粘膜上皮細胞を含む試料を用いてターゲット遺伝子（前記分子の遺伝子）のCt値及びリファレンス遺伝子（ハウスキーピング遺伝子等）のCt値を測定し、比較Ct法により被験反芻動物における前記分子の発現量がコントロールにおける前記分子の発現量の何倍になるかを算出することで、比較を行うことができる。例えば、リアルタイムPCR法又はLAMP法により測定した被験反芻動物における前記分子のΔCt値又はΔTt値が、コントロールのΔCt値又はΔTt値の2倍より大きいとき、好ましくは3倍より大きいとき、より好ましくは5倍より大きいとき、特に好ましくは10倍より大きいときは被験反芻動物は妊娠していると判定することができる。
　判定工程における判定は、被験反芻動物及び非妊娠の反芻動物それぞれにおける発現量を測定してそれらを直接比較することで行ってもよいが、妊娠動物由来の検体では陽性となるが非妊娠動物由来の検体では陰性となるように測定条件を設定し、被験反芻動物由来の検体が陽性陰性のいずれの測定結果を示すかを観察することによって行うこともできる。例えば、PCR法やLAMP法等の核酸増幅法によって前記分子の発現量を測定する場合、妊娠動物由来検体では増幅産物が検出されるが非妊娠動物由来検体では増幅産物の量が検出感度以下又は所定の値以下となるように検体を適宜希釈し、又は増幅反応のサイクル数若しくは反応時間を適宜調整し、これを用いて核酸増幅反応を行い、増幅産物の有無を観察することにより又は増幅産物の量を前記所定の値と比較することにより判定を行うこともできる。
　第１の態様における判定工程は、前記測定工程で測定されたIFN-τに応答して誘導される分子の発現量とカットオフ値とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する別の判定工程に置き換えることもできる。したがって、本発明の別の態様は、妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量とカットオフ値とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法に関する。
　カットオフ値は、試料の採取部位や測定対象の前記分子に応じて、ROC曲線等を用いて適宜設定される。被験反芻動物における分子の発現量がカットオフ値より大きければ被験反芻動物は妊娠しており、カットオフ値より小さければ被験反芻動物は妊娠していないと判定することができる。
　上記の判定基準に基づいて非妊娠と判定された被験反芻動物は、直近に到来する排卵周期に応じて再度交配、人工授精又は受精卵移植に供すればよい。
　本発明の別の態様は、本発明の第１の態様に基づいて妊娠を判定するためのキットに関する。キットは、粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、具体的には上で挙げた種々の測定方法のための試薬を含む。これらの試薬としては、例えば核酸増幅法又はELISA法のための試薬、典型的にはプライマー核酸又はプローブ核酸、dNTP、特異抗体、二次抗体、酵素、緩衝液、発色試薬等を挙げることができる。キットは、前記分子の発現量を測定するための装置、被験反芻動物から粘膜上皮細胞を含む試料を採取するための器具、例えばスプーン、耳かき、綿棒又はスポンジ等、前記試料を保持するための容器又は支持体等をさらに含んでいてもよい。好ましくは、キットは、IFN-τに応答して誘導される分子の発現量に基づいて被験反芻動物の妊娠を判定することについての指示書をさらに含んでいてもよい。
　以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１．妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管及び外子宮口周辺部）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
１）粘膜の採取
　北海道大学北方生物圏フィールド科学センター生物生産研究農場酪農生産研究施設で飼育されているホルスタイン種搾乳牛のうち、後の妊娠鑑定で妊娠が確定した人工授精後18日が経過したウシ及び人工授精を行っていないウシをそれぞれ選び、外陰部を逆性石鹸水溶液で拭いた。直接、あるいは腟鏡を用いて腟前庭を開口し、市販されている計量スプーンを挿入して、子宮頸管及び外子宮口周辺部それぞれから粘膜を掻き取って採取した。採取した試料の目視観察では血液の混入は確認されず、また顕微鏡観察では試料に含まれる細胞の大多数（95％以上）が粘膜上皮細胞であることが確認された。試料を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに速やかに回収し、-80℃にて凍結保存した。
２）total RNAの抽出
　凍結した粘膜を融解し、ISOGEN IIを500μL加えて混和した。RNase free H2O（Nippon Gene）を200μL加え、15秒間チューブをよく振った。15分間の室温静置の後、4℃、12,000gで15分間遠心し、その上清を1.5 mLチューブに回収した。回収した上清と等量の2-プロパノール（Wako）を加えて転倒混和した後、-30℃で10分間静置した。静置後、4℃、12,000gで10分間遠心し、上清を取り除いた。75％エタノールを各チューブに500μL加えて転倒混和し、4℃、15,000gで5分間遠心した。以上の作業を反復し、上清を取り除いた後10分間真空乾燥し、RNase free H2Oを30μL加えて、total RNAを得た。RNA濃度を測定後、使用時まで-80℃で保存した。
３）逆転写反応によるcDNA合成
　ReverTra Ace（登録商標） q-PCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いて、total RNAからのcDNA逆転写を行った。この反応に要する加熱および冷却の処理はすべてASTEC ProgramTemp Control System PC-815を用いて行った。得られたtotal RNAとRNase free H2Oを、total RNA濃度が100 ng/12μLとなるように調製し、65℃で5分間熱変性処理を加え、速やかに氷上で冷却した。その後、ゲノム由来のDNAを消化するため、それぞれのチューブに4×DN Master MixとgDNA removerを50:1で混合したものを4μL加え、37℃で5分間加熱し、速やかに氷上で冷却した。次に、それぞれのチューブに5 ×RT Master Mix IIを4μL添加し、37℃15分間、50℃で15分間加熱して逆転写反応を行った後、98℃5分間加熱することで酵素失活反応を行い、cDNAを合成した。得られたcDNAは80μLの滅菌水を加えることで5倍希釈し、使用時まで-30℃で保存した。
４）リアルタイムPCR
　子宮外組織における妊娠応答性を評価するための目的遺伝子としてISG15、Mx1、Mx2、OAS-1X及び内部標準遺伝子としてH2AFZをそれぞれ選択した。データベース（NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で公開されている各遺伝子の塩基配列を参照して、exon-intron境界領域を含む150bp前後の増幅産物が得られるようにForward及びReverseプライマー（表２）を設計、合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　PCR反応液はTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）を5μL、上述のForward及びReverseプライマーをそれぞれ0.5μLずつ、鋳型としての前記cDNA溶液を4μL添加して10μLとした。LightCyclerNano（Roche Diagnostics）を用い、95℃, 30秒を1サイクル、95℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒を45サイクル、60℃20秒、95℃20秒をそれぞれ1サイクルとしたリアルタイムPCRを行った。子宮頸管におけるISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1Xの相対的遺伝子発現量を図１に、外子宮口周辺部におけるISG15、Mx1及びMx2の相対的遺伝子発現量を図２に、それぞれ示す。
　非妊娠牛の子宮頸管及び外子宮口周辺部粘膜における各遺伝子の発現量と比べて、妊娠確定牛の子宮頸管粘膜におけるISG15の発現量は122倍、Mx1は31倍、Mx2は66倍、及びOAS-1Xは7倍に、また外子宮口周辺部粘膜におけるISG15の発現量は14倍、Mx1は10倍、及びMx2は12倍に、それぞれ亢進していることが確認された。このことから、妊娠確定牛の人工授精作業から18日目の子宮頸管及び外子宮口周辺部の粘膜において、IFN-τによる感作作用が確認された。
実施例２．妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
　採取器具として計量スプーンに代えて綿棒を用いた点以外は実施例１と同様にして、妊娠牛の子宮頸管、外子宮口周辺部及び腟前庭それぞれから、並びに非妊娠牛の子宮頸管から粘膜を採取した。採取後の綿棒を、ISOGEN II（Nippon Gene）500μLを分注して氷冷した1.5 mLチューブに浸漬して粘膜中の細胞を回収し、実施例１と同様にしてtotal RNAの抽出、逆転写反応によるcDNA合成及びリアルタイムPCRを行った。
　ISG15の相対的遺伝子発現量の結果を図３に示す。妊娠時の子宮頸管、外子宮口周辺部（腟深部）、陰部（腟前庭）のいずれの粘膜においてもISG15の発現が観察された。遺伝子発現量は子宮からの距離が離れるに従って減少したものの、非妊娠牛の子宮頸管粘膜における発現量と比べると20－150倍以上の発現の亢進が確認された。
実施例３．定量的RTLAMP法による妊娠牛及び非妊娠牛の子宮外組織（子宮頸管）におけるインターフェロン誘導性因子の発現解析
　実施例１の１）及び２）と同様の方法で採取及び調製した妊娠牛及び非妊娠牛の子宮頸管粘膜由来RNAサンプルについて、total RNA量をそれぞれ100ngに合わせた後にDNase処理を行い、混入DNAを消化した。DNase処理した妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、DNase未処理の妊娠牛及び非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル各100ng、並びにDNase未処理の非妊娠牛子宮頸管粘膜由来RNAサンプル1000ngを用いて、直接RTLAMP反応を行った。
　反応条件は以下のとおりである。一反応につき滅菌蒸留水2.9μl、反応溶液12.5μl、酵素溶液1μl、ISG15を増幅するように設計されたLAMPプライマーFIP（配列番号13）: 40 pmol (0.8μl)、BIP（配列番号14）: 40 pmol (0.8μl)、F3（配列番号11）: 5 pmol (1μl)、B3（配列番号12）: 5 pmol (1μl)を加え、サンプルRNA溶液を5μl加えて最終25μlとし、65℃にて30分以上反応し、ターゲット遺伝子の増幅によって生じた反応物の濁度を継時的な吸光度によって計測した。
　結果を図４及び５に示す。RNAを鋳型とした場合であってもISG15発現量の測定は可能であった。反応開始後30分時の濁度の比較によると、妊娠牛の子宮頸管粘膜におけるISG15発現量は、非妊娠牛の子宮頸管粘膜におけるISG15発現量の約４倍高かった。またDNase処理の有無は定量結果に大きな影響を与えず、またTotal RNA量を10倍に増やした場合にも濁度の推移に大きな変化は認められなかったことから、ゲノムDNA混在下であっても妊娠の判定が可能であることが確認された。
 

Claims (14)

  1. 　妊娠初期に相当する期間にある被験反芻動物の子宮頸管から陰門までの生殖器から採取された粘膜上皮細胞を含む試料を用いて、当該粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定する測定工程、及び当該発現量と妊娠していない同種の反芻動物の対応する粘膜上皮細胞における前記分子の発現量とを比較することで被験反芻動物の妊娠を判定する判定工程を含む、反芻動物の妊娠を判定する方法。
  2. 　粘膜上皮細胞を含む試料が、腟から陰門までの生殖器から採取される、請求項１に記載の方法。
  3. 　粘膜上皮細胞を含む試料が、生殖器の表面から低侵襲的又は非侵襲的に採取される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　粘膜上皮細胞を含む試料が、実質的に血液を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、定量PCR法又はLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法により測定される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　IFN-τに応答して誘導される分子の発現量が、粘膜上皮細胞からのRNAの分離精製処理を行わずに測定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　反芻動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ヤク及びシカよりなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　被験反芻動物の粘膜上皮細胞におけるIFN-τに応答して誘導される分子の発現量を測定するための試薬、及び前記細胞を含む試料を採取するための器具を含む、反芻動物の妊娠を判定するためのキット。
  11. 　IFN-τに応答して誘導される分子が、LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2及びPLAC8遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNA又は当該遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項１０に記載のキット。
  12. 　IFN-τに応答して誘導される分子が、ISG15、OAS-1X、Mx1及びMx2遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１の遺伝子から転写されるmRNAである、請求項１０又は１１に記載のキット。
  13. 　IFN-τに応答して誘導される分子がmRNAであり、前記分子の発現量を測定するための試薬が核酸増幅法のための試薬である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. 　前記細胞を含む試料を採取するための器具が、低侵襲的又は非侵襲的に試料を採取するための器具である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のキット。

     
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