CN110546260A - 用于早期胚胎活力的生物标志物及其方法 - Google Patents

用于早期胚胎活力的生物标志物及其方法 Download PDF

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Abstract

一种用于测定雌性牛早期胚胎死亡(EM)的方法，该方法包括测定在妊娠期约15天至约30天获得的血清的细胞外囊泡来源的微核糖核酸表达谱(血清EV miRNA)。该血清EV miRNA表达谱与至少一个参考血清EV miRNA表达谱进行比较，以确定指示早期EM的血清EV miRNA表达谱(EM EV miRNA表达谱)。与至少一个参考血清EV miRNA表达谱相比，所述EM EV miRNA表达谱可由miR‑25、miR‑16a/b或miR‑3596中至少一个的增加的量组成。本申请提供代表性的EM EV miRNA表达谱和用于测定EM EV miRNA表达谱的试剂盒。

Description

用于早期胚胎活力的生物标志物及其方法
该发明专利申请要求2016年11月11日提交的用于早期胚胎活力的生物标志物及其方法的美国临时专利申请(序列号62/420,670)的优先权的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
电子提交的序列表
将本申请的序列表以名为1101-018SequenceListing.txt的ASCII文本文件进行电子提交，该序列表在2017年6月11日创建并且具有2542字节的大小，通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及早期胚胎死亡(EM)的标志物。特别的，本发明公开涉及循环细胞外囊泡(EV)微核糖核酸(miRNA)作为测定EM的标志物的用途。
背景技术
接受单次人工授精(AI)的肉用牛中约85％至95％成功受精。然而，在牛中存在相对高比率的早期胚胎死亡(EM)，并且仅有约60％的受精卵母细胞到第30天导致妊娠。除该初始EM外，在妊娠期第30天至第45天之间(其对应于在牛中形成绒膜尿囊子叶胎盘的时间)还存在第二个阶段的EM。在牛中，从最早第25天开始在整个妊娠期间，可以使用实时超声检查来诊断妊娠。利用超声和牛妊娠相关糖蛋白(PAG)，我们开发了研究在妊娠期第30天至第45天之间晚期胚胎死亡(EM)潜在的一些机制的动物模型。然而，这些来自PAG和超声的数据没有提供关于受精至第25天之间早期胚胎丧失的信息，最可能是由于鉴定早期胚胎丧失的方法有限。已经在白细胞中对额外的标志物如IFN刺激的基因(ISG)转录本丰度进行了评估，以研究该早期胚胎丧失。然而，由于ISG可以在接触病毒的动物中升高(即使在无症状时)，ISG的升高不一定表明存在有活孕体，但可以是非妊娠动物的良好标志物。
近年来，人们一直关注微RNA(miRNA)作为新的生物标志物。MiRNA是有吸引力的生物标志物，因为它们可以以非侵入性方式测定，具有预测性、特异性、灵敏性和稳健性。MiRNA增加的半衰期被认为部分是由于它们在血清/血浆的细胞外囊泡(EV)中广泛分布的结果。细胞外囊泡主要包含两种主要形式：外泌体(多泡体内的腔内囊泡)和来自质膜起泡的微囊泡。一旦释放到体液中，该原始物(外泌体或微囊泡)不容易被检测到，因此用EV总体描述这些细胞分泌的囊泡。有证据表明，EV来源的miRNA可以在细胞与细胞的通讯和整体生物功能中发挥特定的作用。细胞外囊泡来源的miRNA已经成为许多生理和疾病状态的有吸引力的生物标志物。具体而言，在癌症筛查和诊断中，已经有超过八种类型的癌症(包括肺癌、乳腺癌和卵巢癌)具有被表征为潜在筛选靶标的特异性EV来源的miRNA。关于生殖方面，已显示胎盘特异性miRNA在女性妊娠期间在母体循环中被释放并且可被检测到。因此，我们测试了这样的假设：即在早期妊娠期间(<30天)，特异性循环EV来源的miRNA可以区别妊娠牛与EM牛和对照牛。本研究的目的是确定在妊娠期第17天和第24天，妊娠牛与EM牛外周循环中EV来源的miRNA是否存在差异丰度，并确定这些miRNA是否可为研究胚胎死亡或妊娠维持提供可靠的生物标志物。
发明内容概述
根据本领域确定的上述需求，一方面提供了用于测定雌性牛的早期胚胎死亡(EM)的方法，包括在妊娠期约15天至约30天从雌性牛中获得的血液样品中分离血清，并确定血清的细胞外囊泡来源的微核糖核酸表达谱(血清EV miRNA)。将血清EV miRNA表达谱与至少一个参考血清EV miRNA表达谱进行比较。通过该比较，确定指示雌性牛早期EM的血清EVmiRNA表达谱(EM EV miRNA表达谱)。
在一些实施方案中，从以下一者或两者中测定至少一个参考血清EV miRNA表达谱：(i)在妊娠期约15天至约30天从一头或多头参考妊娠雌性牛中获得的血液样品，和(ii)从一头或多头参考非妊娠雌性牛中获得的血液样品。在其他实施方案中，在妊娠期约15天至约30天从参考妊娠雌性牛获得的血液样品测定至少一个参考血清EV miRNA表达谱。该方法进一步包括从该血清中分离EV以提供分离的EV样品，和从该分离的EV中提取核糖核酸。通过高通量测序和逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)扩增和定量该EV miRNA，以提供血清EVmiRNA谱和至少一个参考血清EV miRNA谱。
在一些实施方案中，EM EV miRNA表达谱由与至少一个参考血清EV miRNA表达谱相比miR-25、miR-16a/b或miR-3596中至少一个的增加的量组成。在其他实施方案中，EM EVmiRNA表达谱由与至少一个参考血清EV miRNA表达谱相比miR-25、miR-16a/b和miR-3596的增加的量组成。在一些实施方案中，使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组成的组的引物扩增EV miRNA。该方法可以包括通过将有效的miRNA读段计数归一化至一些每百万读段计数(cpm)(normalizing effective miRNA read counts to a numberof count per million reads)并且仅保留cpm大于或等于10的基因座，来标准化EM EVmiRNA表达谱和至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
另一方面，本公开提供雌性牛中在妊娠期约15天至约30天指示胚胎死亡的细胞外囊泡来源的微核糖核酸表达谱(EM EV miRNA表达谱)，其包括与至少一个参考血清EVmiRNA表达谱中miR-25、miR-16a/b和miR-359的量相比，雌性牛的血清EV miRNA表达谱中miR-25、miR-16a/b和miR-359量的增加。
在一些实施方案中，通过高通量测序和逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)测定miR-25、miR-16a/b和miR-3596的量。在表达谱中，使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11组成的组的引物扩增miR-25、miR-16a/b和miR-3596。
在一些实施方案中，从以下一者或两者中获得至少一个参考血清EV miRNA表达谱：(i)在妊娠期约15天至约30天从一头或多头参考妊娠雌性牛中获得的血液样品，和(ii)从一头或多头参考非妊娠雌性牛中获得的血液样品。在其他实施方案中，在妊娠期约15天至约30天从一头或多头参考妊娠雌性牛中获得的血液样品中获得至少一个参考血清EVmiRNA表达谱。通过有效的miRNA读段归一化为一些每百万读段的计数(cpm)并且仅保留cpm大于或等于10的基因座，来标准化EM EV miRNA表达谱和至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
在本公开的另一方面，提供了用于测定雌性牛早期胚胎死亡(EM)的试剂盒，其包含引物阵列，所述引物阵列包括用于测定指示所述EM的一个或多个细胞外囊泡微核糖核酸(EV miRNA)的表达水平的引物序列。任选地，该试剂盒可包括用于提取EV miRNA的试剂和用于对该提取的EV miRNA进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒引物阵列包括用于测定从细胞外囊泡微-RNA(EVmiRNA)提取的miR-25、miR-16a/b和miR-3596中的一个或多个的表达水平的引物序列。该引物阵列可包括如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物序列。在一些实施方案中，引物阵列由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的引物序列组成。
在以下描述中，显示并描述了一些用于测定早期EM选择的公开的方法和试剂盒的实施方案。应认识到，该方法和试剂盒能够适用于其他的、不同的实施方案，并且它们的若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些都不脱离接下来的权利要求中所示和所述的方案和方法。因此，附图和发明内容应被视为在本质上是说明性的而非限制性的。
附图说明
并入本文并形成说明书的一部分的附图说明了本公开的若干方面，并且与发明内容一起用于解释其某些原理。在附图中：
图1说明本研究的实验设计；
图2A显示在妊娠期第0天和第17天，在妊娠牛或经历胚胎死亡的牛中ISG-15的PCR产物的凝胶电泳；
图2B显示蛋白质印迹，其显示在分配给妊娠组的牛的血清来源的EV中存在CD81，所述CD81是一种充分表征的EV标志物。在来自妊娠组、胚胎死亡组和对照组的所有EV样品中检测到类似的条带；
图3A显示从妊娠牛获得的EV中提取的小RNA的图谱；
图3B显示从胚胎死亡牛获得的EV中提取的小RNA的图谱；
图3C显示从对照牛获得的EV中提取的小RNA的图谱；
图4显示从循环EV中获得的小RNA的相对百分比；
图5显示跨所有处理组的第17天EV来源的循环微RNA；
图6说明在妊娠牛(cow)和经历胚胎死亡牛中通过RT-qPCR检测已知的EV来源的miRNA。使用RT-qPCR检测总4个miRNA。在妊娠期第17天，使用RT-qPCR确认了3个miRNA(miRNA 16b、25和3596)。miR-100基于RT-qPCR未得到验证(数据未显示)。
图7A说明了对29个已知的miRNA进行的生物学功能分析，所述miRNA在EM组和妊娠组之间存在丰度差异，在妊娠期第17天在EM组和妊娠组之间丰度差异的miRNA中有12个功能显著上调；和
图7B说明对在EM组和妊娠组之间存在丰度差异的29个已知miRNA的生物学功能分析，导致显著击中靶标PTGS2、SLC38A1、IGF-1R、Akt、TRMT1、SNAI1、Cg、CAMTA1、MAP2K1/2、BCL6和TP53。
现在将详细描述所公开主题的实施方案，参考附图来说明实施例。
发明内容详述
本申请包括的或提及的任何引用、基因序列、登录号和参考序列形成本公开的一部分并通过引用其整体并入本文。应理解，本专利申请显示和描述的实施方案是最适合实施本发明的模式之一的示例。本发明能够适用于其他不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本发明。因此，本文提供的附图和描述将被视为本质上是说明性的而非限制性的。本公开的方法和组分的不同实施方案将通过下述实施例进行说明。
材料和方法
处理：所有实验程序均由密苏里大学机构动物和护理和使用委员会(Universityof Missouri Institutional Animal and Care and Use Committee)批准(ACUC方案8444)。对来自密苏里大学牛肉研究和教学农场(the University of Missouri BeefResearch and Teaching Farm)的产后乳肉牛(n＝36)的发情周期用7天CO-synch CIDR同步方案(在第-9天GnRH(100μg，以肌肉注射2mL Cystorelin(Merial)以及Eazi-Breed CIDR插入[1.38g黄体酮；Zoetis]，在第-2天前列腺素F2α[PG；25mg，肌肉注射5mL Lutalyse，Pfizer Animal Health]并去除CIDR，在PG后66小时第二次注射GnRH[100μg，以肌肉注射2mL Cystorelin,Merial])同步化，并在第0天AI。用同一雄性亲畜牛与所有牛授精，36头牛用活精子授精，8头对照牛用死精子授精。对照牛接受来自同一雄性亲畜牛的死精液(不再具有活力)，以确保所有动物都接触相同的精浆和精子，因为两者都已知含有miRNA。对照牛在第17天还要接受CIDR以从第17至第30天维持与确定妊娠的牛相似的黄体酮水平(妊娠诊断)。在第30天妊娠诊断后，将活精子AI组中的那些牛分为两组：妊娠确定并维持至第30天(妊娠组；n＝17)和妊娠确定但不维持至第30天(胚胎死亡组，EM；n＝19)。通过检测与第0天相比在第17天增加的ISG表达(ISG15、Mx2和OAS1；Green等人，2010)，但在第30天不存在胚胎，区分胚胎死亡和未能受孕。例如，如果与第0天相比第17天的ISG转录本丰度更高(通过胚胎产生IFN-tau的证据)并且在第30天未检测到胚胎，则认为动物已经失去胚胎并被分配到“胚胎死亡(EM)组”。相比之下，如果与第0天相比第17天的ISG转录本丰度更高并且在第30天检测到胚胎，则通过经直肠超声和胎儿心跳的可视化确定牛已经受孕并维持妊娠(分配到'妊娠'组)。此外，实验中涉及的对照牛表现出从妊娠期第0天至第17天ISG转录本丰度减少或没有变化。使用对照组来比较以下牛循环中的EV miRNA：可能还没有受孕的牛与已经确定并维持妊娠的牛(妊娠组)或者没有维持妊娠的牛(EM组)。
图1示例了本实验使用的发情期同步方案和样品采集时间表。用Cosynch+CIDR方案对哺乳肉牛(n＝44)进行同步处理：在第-9天施用促性腺激素释放激素(GnRH)和CIDR，在第-2天施用前列腺素F2α(PGF)，并且在第0天进行定时人工授精和施用GnRH。牛分成两组，一组为用活精子人工授精的那些牛(n＝36)，其余的为接受死精子授精的牛(n＝8)。对照牛从妊娠期第17天直到第24天接受CIDR，以维持升高的黄体酮循环浓度。在第0天、第17天和第24天采集血液。在第0天和第17天评估干扰素刺激基因活性(IFN-T)。在妊娠期第30天和第56天通过经直肠超声检查来测定妊娠状态。
血液采集：在AI(第0天)、第17天和第24天的时候对所有牛进行放血。通过静脉穿刺分别收集血清和血浆至10-ml的真空采血管(BD Vacutainer，Becton，Dickinson和Company，New Jersey)和10-ml EDTA处理的真空采血管(BD Vacutainer，Becton，Dickinson和Company，New Jersey)中。使血清管在室温下凝结1小时，然后在4℃冰箱放置约24小时。离心后，收集血清并在-80℃储存直到在第0天、第17天和第24天测定黄体酮或在第17天和第24天提取EV。将血浆样品立即置于冰上，在此保持直到离心。倒出血浆并通过血沉棕黄层提取(buffy coat extraction)来收集白血细胞，如Stevenson等人.(2007)所述。在第0天和第17天收集白血细胞。
白血细胞RNA提取和cDNA合成：根据制造商的推荐，使用Trizol试剂(LifeTechnologies)来提取白血细胞血沉棕黄层的RNA。根据制造商的推荐，使用来自Takara生物公司的PrimeScriptTM第一链cDNA合成试剂盒(目录编号：6110A；批号：AK3101)，以2μgRNA来合成互补DNA。
干扰素刺激基因(ISG)表达的PCR：制备白细胞RNA用于使用AccuPrimeTM Taq进行的PCR。2.5μl的AccuPrimeTM缓冲液，0.5μl的60ng/μl正向和反向引物(参见表1中的ISG15、MX2和OAS1和RPL7),0.5μl AccuPrimeTM Taq DNA聚合酶，21μl的水和0.5μl的cDNA，如Green等人，2010所前述。在95℃持续2分钟，40个循环的95℃持续30秒、54℃持续20秒和68℃持续4分钟，进行PCR反应。然后将样品冷却至4℃。在含有1μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，以使产物可视化。然后通过凝胶上产物条带的存在或不存在来确定干扰素刺激的基因表达(ISG15、MX2和OAS1)。RPL7用作所有样品的阳性对照。
细胞外囊泡分离：按照之前已经过验证的EV收集的修改方案[24、25]，在第17天和第24天从每头牛的2mL血清中分离EV。单独处理样品且绝不能混合。将每个2mL样品以300×g离心10分钟以除去任何细胞碎片。将澄清的上清液加入至超离心管(Beckman Coulter347357)中，并向每个样品中加入另外2.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)。随后将样品在4℃下以2000×g快速旋转20分钟。将上清液再次转移至新鲜的超离心管中，并在4℃下以18，000×g快速旋转45分钟。在此快速旋转后，用5mL胰岛素注射器使上清过滤通过Millex GP 0.22μm过滤器进入新的超离心管中。用PBS冲洗过滤器并用PBS平衡管。将样品在4℃下以110，000×g离心3小时。3小时快速旋转后，可以在每个管中的样品中看到可见的白色沉淀。用PBS冲洗沉淀并在110，000×g下再快速旋转90分钟。将沉淀悬浮于50μl PBS中，保存5μl用于蛋白质印迹分析和纳米颗粒追踪，而剩余的45μl则用于如下所述的RNA提取。
蛋白质印迹分析：将纯化的EV在室温下在管旋转器中悬浮于40μl含有HALT蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Scientific)的M-PER(Thermo Scientific)中15分钟。将裂解物与Laemmli样品缓冲液(31.5mM Tris-HCl，pH 6.8；10％甘油；5％β-巯基乙醇；1％SDS；0.01％溴酚蓝)混合，在95℃下变性5分钟，并在1×电泳缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％SDS)中在150V恒定电压下通过SDS-PAGE电泳分离约60分钟。将蛋白质在Towbin转移缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇)中在100V下转移至0.45μm Protran BA85硝酸纤维素膜(GE Healthcare，Buckinghamshire，英国)60分钟。在室温下将膜置于封闭缓冲液(TBS，5％脱脂乳，0.1％吐温20)中1小时。在封闭缓冲液中以1：20，000稀释一抗[CD81；SantaCruz Biotechnology；[26]]，并在4℃下与印迹孵育1小时。用含有0.1％吐温20的TBS(TBST)洗涤膜，然后在室温下用以1:10，000稀释的山羊抗兔辣根过氧化物(HRP)轭合的第二抗体孵育1小时。膜用过量TBST洗涤，并与SuperSignal West Pico化学发光底物(ThermoScientific)孵育3分钟，然后用ChemiDoc MP系统和Image Lab 4.1软件(BioRad，Hercules，加拿大)成像。
纳米粒子跟踪分析：用与Navakanitworakul等人[27]报道的方法类似的方法进行纳米粒子(EV)的定量。简而言之，所有纳米粒子定量均在NanoSight LM-10HS(MalvernInstruments Ltd，Worcestershire，英国)上进行。在定量之前，将等分样品稀释至约1-8×108/毫米以进行分析。为了定量目的，记录3个视频60秒，然后使用Nanosight NTA 2.4软件(Malvern Instruments Ltd，Worcestershire，英国)进行分析。所有样品一式三份定量。然后使用SAS 9.4PROC GLM包分析数据。
MiRNA提取：基于制造商的建议，用Trizol试剂进行RNA的提取。为了测定小RNA的数量和质量，根据制造商的建议，使用Agilent2100生物分析仪，用RNA Labchip试剂盒(Agilent Technologies)评估样品。
MiRNA测序：所有miRNA测序均在堪萨斯大学医学中心-基因组学核心(theUniversity of Kansas Medical Center-Genomics Core)(堪萨斯城，堪萨斯州)的Illumina HiSeq2500系统上进行。使用细胞外囊泡RNA(范围从1.8ng-100ng)来启动TruSeq小RNA文库制备方案(Illumina#RS200-0012试剂盒A)。将EV RNA与3'和5'RNA适配子连接，然后进行改良的逆转录反应和改良的PCR扩增。由于EV RNA的起始量低，通过进行含有6μl3'/5'RNA连接的RNA的两个重复反应，来改良RNA适配子连接的样品的逆转录。将每个重复逆转录反应的12.5μl产物进行汇集以获得25μl均质cDNA。通过用8.5μl汇集的反转录cDNA(总共21μl cDNA)替换PCR主混合物中的8.5μl超纯水，来改良随后的PCR扩增(具有指数适配子引入)。改良的PCR反应进行用15个扩增循环。
在Pippin Prep大小分级系统(Sage Science)上，使用3％标记物H凝胶盒进行cDNA文库的大小选择和纯化。将Agilent 2100生物分析仪与高灵敏度DNA试剂盒(Agilent#5067-4626)或DNA1000试剂盒(Agilent#5067-1504)一起使用，以验证纯化的文库。
使用KAPA SYBR Universal Library Quant试剂盒-Illumina(KAPA BiosystemsKK4824)在Illumina ECO实时PCR系统中定量文库。定量后，将文库调整至2nM浓度并汇集用于多重测序。使文库变性并稀释至合适的pM浓度(基于qPCR结果)，然后使用TruSeq快速单读取(SR)聚类试剂盒-HS(Illumina GD402-4001)克隆聚类至测序流动槽上。使用自动Illumina cBOT Cluster Station进行克隆聚类程序。使用TruSeq Rapid SBS试剂盒-HS(Illumina FC402-4002)，在Illumina HiSeq 2500测序系统上以具有1×50循环读段和标签读段(1×50cycle read and index read)的快速读取模式，对聚类流动槽进行测序。进行测序以获得两个时间点(第17天和第24天)处三组(对照、EM和妊娠)的小RNA的无偏全部图谱(unbiased global profile)。以生物学一式四份共共24个样品，分析这些组。以50bp的单端分辨率(single-end resolution)进行高通量测序。收集后，将序列数据从.bcl文件格式转换为FASTQ文件，并根据存在的用于进一步下游分析的特定索引序列进行分类。
小RNA处理：先前已详细描述了所使用的已知和新的miRNA的作图和鉴定[27]。除去3'适配子(adapter)后，使用Bowtie2软件[28]以局部敏感模式将测序读段作图至牛基因组(装配UMD3.1)上。如下所示进一步处理作图的读段。将来自所有24个样品的读段合并并且扫描定义为连续区域的高密度区域，该区域在每个碱基处的读段计数不小于基因座的最高碱基读段计数的20％。这些高密度区域形成了基因座的有效区域，并且其长度是其有效长度。保留有效长度大于或等于18的基因座。每个样品中作图至有效区域的读段的数目形成了有效的读段计数。基因座在其归一化有效读段计数(归一化为每百万读段的计数(cpm)数量)上进一步筛选，仅保留6个生物条件中至少一个的所有4个重复样品中cpm大于或等于10的那些基因座。表2显示这些基因座(miRNA)在不同生物条件下的分布。这些基因座用于下游分析。有效区域用来自牛(版本70)和miRBase(版本21)的Ensemble基因注释文件的基因组特征注释。
首先鉴定作图至注释的牛成熟miRNA的有效区域，将其余的有效区域与在miRBase(版本21)中发现的牛和其他物种这两者中已知的miRNA进行比较。如果其通过以下标准，则可通过同源性将区域标记为miRNA：有效区域与成熟参考miRNA的无间隙比对在核心最多具有2个错配，在5’和3’引物末端(prime end)最多1个缺口/错配，并且参考发夹序列与基因组中扩展的基因座区域的比对有小于10％的错配。基于扩展的有效区域应具有预期的pre-miRNA样发夹结构[29](有效区域落入具有至少80％配对的茎区)，对新的计算机鉴定的miRNA进行验证。
使用来自edgeR软件包[30]的为多组实验开发的广义线性模型(GLM)来确定不同条件之间显著差异表达的miRNA。为了差异表达分析，miRNA必须在所比较的两组中的至少一组中的所有4个重复样品中具有大于或等于10的cpm。该edgeR包采用先进的经验贝叶斯方法来评估最小生物复制水平下的miRNA特异性生物学变异。使用M值的修剪平均值(TMM)方法在edgeR中对每个样品中的RNA组成进行归一化。通过Benjamini和Hochberg方法针对多重假设检验(FDR)校正了相关p值[31]。FDR小于或等于0.1的大于或等于1.5的绝对表达差异被认为是显著的。
生物学功能分析：使用Ingenuity Systems IPA(ingenuity.com)软件，获得第17天妊娠样品相比EM样品中与差异表达的miRNA相关的生物学功能。IPA由包括miRNA在内的已知分子相互作用的综合知识库组成。利用该信息，IPA基于上传的基因来计算不同生物学功能的富集分数。通过使用右尾Fisher精确检验计算的靶miRNA与相关生物功能中基因的重叠的可能性计算的P值，推测miRNA组的富集生物学功能。由于IPA的知识库仅限于人类、小鼠或大鼠的基因和基因产物信息，因此在上传至IPA之前将牛miRNA参考物转换为其最佳匹配的人或小鼠的同源物。
定量PCR：将如上所述分离的并之前用于Illumina测序的小RNA多聚腺苷酸化，然后根据制造商的建议，使用具有3’简并锚和5’通用标签的poly-T引物(Exiqon miRCURYLNATM System)合成cDNA。然后使用miRNA特异性(参见表1)和LNATM-增强的正向和反向引物SYBR Green检测产物在ABI7300实时PCR仪中扩增cDNA模板。使用Exiqon LNA miRNA引物组扩增miRNA序列(目录号204306、2114063、204361、206037)。不含模板的PCR反应用作阴性对照。将阈值测量设置在基线上方的扩增曲线的线性区域中，并且基于阈值线与扩增线相交的循环数确定定量循环(Ct)。LNA特异性对照引物U6 snRNA(#203907)和SNORD 49A(#203904)是用作所有反应中的参考基因，用于数据归一化。使用对照样品中U6和SNORD 49A参考值的平均值(2-△△Ct)计算丰度值，其被认为是基线和靶miRNA基因Ct值的平均值。
表1：在PCR和qPCR期间所扩增的某些miRNA的引物序列(5’至3’)
测试：如前所述，用Coat-a-Count RIA试剂盒(Diagnostic ProductsCorporation，Los Angeles，加拿大)通过RIA定量血清孕酮浓度[32]。黄体酮RIA的测试内部的变异系数为4.82％，测试的灵敏度为0.08ng/mL。使用SAS9.4PROC GLM包分析血清浓度。
结果
测量所有动物在妊娠期第0天和第17天白细胞中IFN刺激基因(ISG)的表达(图2)。进行ISG15、Mx2和OAS1的这些定性测量，以将受精动物分配到适当的实验组。在第17天，被认为妊娠的动物必须在3个特定ISG中至少有2个增加。基于PCR和凝胶电泳，分配给妊娠组和胚胎死亡组的牛分别在妊娠期第0天和第17天具有低的和增加的IFN-t刺激基因的表达；而对照牛在这两天都有不可检测的或低的IFN-t刺激基因的表达。(+符号表示阳性对照样品)。所有进行深度测序的动物在研究的第17天和第24天都具有针对CD81(一种充分表征的EV蛋白标记)的阳性血清EV免疫反应性(图2)。基于纳米颗粒分析，所有测序动物的EV的总平均直径为109nm±42(平均值±SD)。跨所有样品的颗粒的总数平均值为7.3×107±1.07×107/mL血清(平均值±SD)。在组之间检测的针对特定组计算的颗粒总数或颗粒尺寸没有显著差异。在妊娠动物、EM动物和对照(第17天CIDR植入的)动物之间，第17天或第24天的孕酮循环浓度也没有差异。
在Agilent 2100生物分析仪上使用小RNA Labchip收集来自妊娠组、EM组和对照组的纯化的EV的小RNA谱(图3)。y轴表示量[FU]，x轴表示碱基对大小[nt]。注意在所有牛组中低于60个碱基对的RNA种类的聚类说明小RNA丰度的增加。这些数据显示，在所有组中，循环EV主要包括长度小于60bp的小RNA种类。这些结果还表明，提取的EV包含除miRNA之外的其他小RNA。
小RNA测序证实了这些发现，其揭示了在样品中检测到多种类型的小RNA(图4)，其中百分比(38％)最高的是miRNA。在miRNA之后，小核仁RNA(snoRNA)占群体的21％，核糖体RNA(rRNA)占12％，小核(snRNA)占10％。其他RNA占群体的8％，其余11％被归类为假基因和Mt-RNA。这些数据代表所有牛的集合并且是基于作图标准。
总的来说，小RNA的深度测序的结果是每个样品有750万和920万个读段，其中有500-700万个读段作图至基因组。对第17天和第24天样品的比对和作图后，跨所有组中鉴定到总共214个miRNA，其中40个是潜在的新miRNA(表3)。在表3中总结的214个已知的和新的miRNA是从系统性过滤方法中鉴定的，该方法从长度过滤开始，其将基因座过滤至有效长度为18个至30个碱基之间的那些。在总共鉴定的214个miRNA中，发现大多数(即129个)在所有样品中都有代表，在6个组中有5个组中有代表的增加到166个miRNA，在6个组中有4个组中有代表的增加到178个miRNA(表3)。非常少的miRNA被发现仅在1个组中存在，14个miRNA符合该类别，并且发现其中8个miRNA特异于第24天妊娠组。然而，这些特异性miRNA在这些特定样品中的丰度相当低。
表2：对于在PCR和qPCR期间扩增的基因，基因、基因库号、引物序列(正向和反向引物，5’至3’)以及引物在基因库序列内的位置
表3：在第17天和第24天跨所有处理组的miRNA测序总结
√＝miRNA存在于该特定组中
×＝miRNA不存在于该特定组中
设定miRNA的差异丰度参数(标准化，即在所比较的两个样品中至少一个中的所有4个重复样品中，miRNA必须具有大于或等于10的cpm)后，我们鉴定了32个差异表达的基因座，这代表27个差异表达的成熟miRNA。与妊娠牛相比，在第17天EM牛中大多数(27)差异表达的miRNA增加(图5；表4)。具体地，在第17天，与妊娠牛组相比，在胚胎死亡组中已知的miRNA中有27个miRNA丰度显著更高，并且在其余组中没有miRNA显著升高。
表4：在第17天和24天牛中具有差异丰度的细胞外囊泡来源的miRNA*
此外，与妊娠牛相比而在第17天EM牛中增加的一种新的miRNA也在与妊娠组相比时在对照组中显著增加(表4)。在妊娠期第24天，一个miRNA在EM组和对照组之间显著增加(表4)，但没有检测到其他差异。在测序表征后，在妊娠期第17天使用RT-qPCR检测4种成熟miRNA的差异丰度(miR-16a/b、miR-25、miR-100、miR-3596)。妊娠牛与那些EM牛相比，在妊娠期第17天用RT-qPCR确认4个miRNA中有3个(miR-16a/b、25和3596)减少(图6)。
由于在EM组和妊娠组之间存在最大差异，我们将独创途径分析(IPA)集中在27个已知的miRNA上。与妊娠组相比在EM组中丰度更大的microRNA与相关的网络功能IPA分类(前五大网络功能有癌症、结缔组织疾病、有机体损伤和异常、生殖系统疾病和内分泌疾病)相关联。这些包括与炎症、细胞增殖、子宫内膜异位、细胞周期进展、收缩、感染、迟发性先兆子痫、细胞凋亡、分化、子宫平滑肌瘤、卵巢子宫内膜异位和细胞活力相关的miRNA(图7A)。还鉴定了特异性基因网络，例如PTGS2、SLC38A1、IGF-1R、Akt、TRMT1、SNAI1、Cg、CAMTA1、MAP2K1/2、BCL6和TP53(图7B)。
讨论
在妊娠早期，有充分证据表明牛胚胎在约第15天开始伸长成丝状孕体[33]。这个时期也是孕体产生大量干扰素-τau(IFNT；[34])的时期。在此期间产生的IFNT对于维持或挽救CL免于退化并且延长对妊娠建立至关重要的黄体酮的黄体浓度至关重要[35，36]。有许多受IFNT调节的基因[33]。多组已经表明，与未妊娠牛相比，到妊娠期第16至第20天，妊娠牛中的外周白细胞(白血细胞)中ISG的转录本往往增加[12，13，37]。ISG在白血细胞中的表达可以提供早孕检测的标志；然而，这些测试平台的整体准确性受限于IFNT的病毒响应性质。在目前的研究中，我们选择仅使用在妊娠期第0天和第17天之间具有特异性ISG响应的妊娠牛、未妊娠牛和对照牛。为了纳入分析，与第0天相比，妊娠牛和EM牛必须在第17天具有增加的ISG，这表明妊娠动物和EM动物在妊娠期第17天均存在能够分泌IFNT的胚胎。类似地，与第0天相比在第17天对照动物中需要保持低的或降低的ISG，这表明在妊娠期第17天没有胚胎存在。我们相信，基于这些特定图谱来选择动物对于从该实验获得结果是重要的，并且允许在第17天在妊娠动物和EM动物之间进行更直接的比较。
循环miRNA是一种长度约为22碱基对的小非编码RNA，它已被证明是许多人类疾病的准确生物标志物(Reid等人.综述[38])。此外，在妊娠期间从孕妇收集的血清和血浆中也已检测到特异性miRNA[14]。在人妊娠期间出现的那些miRNA(例如miRNA 512-3p、517A、517B、518B和519A)是人绒毛滋养层的产物，其在EV内或与EV相关的母体血液中循环[23、39、40]。在马妊娠期间，也描述了在母体血清中具有妊娠特异性的EV相关的miRNA[41]。此外，据报道，早在妊娠期第16天，从全血中提取的miRNA在妊娠和未妊娠小母牛之间是不同的；然而，前述miRNA是否来自EV尚不清楚[42]。Burns等人[43]报道了在第14天后妊娠母羊和循环母羊之间子宫冲洗物的微囊泡中miRNA和蛋白的差异丰度。来自绵羊子宫冲洗的前述微囊泡在该研究中未特别指定为EV；然而，根据它们的大小和蛋白特性，它们有可能被表征为EV。对上述研究的后续研究提供了证据表明，EV是由妊娠母羊的滋养外胚层和子宫上皮细胞产生的，并参与细胞间通讯[44]。
循环EV来源的miRNA在妊娠牛和EM牛之间存在丰度差异。在妊娠期第17天和第24天，共有194个和211个miRNA成功拼贴至参考基因组中。具体而言，与第17天妊娠动物相比，无论对照牛还是EM牛均有显著数量的miRNA的丰度增加。有趣的是，Burns等人[43]报道了27个循环(非妊娠)母羊特异性miRNA，与之相比第14天妊娠母羊子宫冲洗物中有一种独特的miRNA，这与我们在循环中观察到的相关。此外，在羊的子宫冲洗物中仅鉴定到1个妊娠特异性miRNA，这与我们目前的研究中没有鉴定到妊娠特异性miRNA相似。有趣的是，在牛中妊娠相关糖蛋白(PAG)在妊娠期第24天显著增加，从而证明早在第24天就有可能在母体循环中检测胎盘产物或妊娠特异性产物[9，11]。因此，我们假设在第24天我们可以在循环中检测到妊娠特异性miRNA；但是，我们无法在第17天或第24天检测任何物质。重要的是要指出，用于妊娠或EM检测的新的miRNA实际上被下调或可能被摄取而不是增加丰度。这些数据还提供证据表明，EV来源的miRNA确实存在于牛循环中。
EV介导的miRNA转移的经典模型是基于EV作为细胞间miRNA转运载体而发挥作用[17，45]。Chevillet等人[46]的报告表明，平均而言，大多数EV实际上携带少于单拷贝的miRNA(0.00825±0.02；miRNA/分子)。如果正确的话，这一观察结果表明，需要多个具有相同miRNA荷载的EV来影响靶细胞的生物学功能。有关携带功能性miRNA、mRNA和蛋白的生物学活性EV的若干报道已经癌症生物学和与病毒抗性有关的胎盘生物学中得到证实[47-49]。在本研究中，我们未展示差异丰度的miRNA的任何生物学相关性。然而，如果每个EV确实携带少于单个miRNA，则妊娠样品、EM样品和对照样品之间miRNA的巨大差异表明这些特定miRNA可能具有生物学/功能相关性。与妊娠组和对照组两者相比，在第17天EM组中有三个miRNA(miR-25、-16a/b和3596)具有增加的丰度。具体而言，已显示miR-25在胎儿组织中高度表达[50]，因此表明miR-25可由发育中的孕体产生并分泌到母体循环中以发挥特定作用。IPA分析进一步表明，与妊娠动物相比EM动物中增加的特异性miRNA导致包括PTGS2的途径的上调，这是前列腺素产生的限速步骤[51]。因此可能表明，这些EM特异性miRNA是PG产生增加而导致CL退化的信号。总的来说，很明显，需要仔细研究EV如何在整个生物系统中进行包装和穿梭的一般假设，以便了解EV介导的miRNA转移及其生物学意义。
小RNA(即miRNA、Piwi相互作用RNA和小调节RNA)在以下方面是类似的，即它们作为调节RNA发挥作用，能够引导蛋白与特定核苷酸碱基结合，在转录水平、染色质水平或转录后发挥调节作用[52-54]。基于RNA图谱，很明显来自每个实验组的收获的EV含有大量的小RNA种类(<200bp)，并且这些图谱似乎在跨所有处理组中相当一致。同样，基于人中证明同步滋养细胞产生含有可在母体循环中发现的miRNA的EV[23]，以及来自绵羊子宫冲洗物的类似报告[43]，这些数据并不令人惊讶。基于Burns等人[43]的微囊泡图谱以及该研究，很明显miRNA不是存在于EV或微囊泡中的唯一小RNA群。其他小RNA如piwi-相互作用RNA、小干扰RNA和重复相关RNA(全部均长度<200bp)已被证明与精子发生有关，并在早期胚胎发育中发挥作用[55，56]。然而，在本部分讨论的所有小RNA中，miRNA在生物系统中的作用在这一点上已经被最明确地定义—特别是在基因转录的表观遗传修饰方面[57-59]。已知微RNA在物种间高度保守，并且关于miRNA在一个物种中的功能作用的信息通常可以应用于另一物种[60]。尽管本研究鉴定了在妊娠组和未妊娠组之间丰度存在差异的特异性miRNA，但这些特异性miRNA的确切功能和/或来源仍不清楚。
结论
该研究的结果支持这样的观点，即EV来源的miRNA可以为生殖相关领域提供有用的生物标志物。此外，需要完成通过RT-PCR在较大动物队列中对特异性miRNA的验证，以确定生物标志物的稳健性，并将该技术转化为可用于成功诊断早孕的高通量方法。如果这些特异性miRNA的验证允许检测妊娠动物和EM动物之间的个体miRNA差异，这将允许对妊娠建立和胚胎死亡的体内模型进行深入调查。
尽管本文使用的术语被认为是本领域普通技术人员充分理解的，但是还是提供了定义以便于解释某些当前公开的主题。
根据长期存在的专利法惯例，术语“a”、“an”和“the”在本申请(包括权利要求)中使用时指的是“一个或多个”。因此，例如，术语“a cell”包括多个这样的细胞，等等。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质如反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以依据目前公开的主题寻求获得的所需性质而变化。
如本文所用，当提及数值或组合物的量、剂量、序列同一性(例如，当比较两个或多个核苷酸或氨基酸序列时)、质量、重量、温度、时间、体积、浓度、百分比等，术语“约”意指包括从特定量起，在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％和在一些实施方案中±0.1％的变化，因为这些变化适合于实施所公开的方法或使用所公开的组合物。
与“包括”，其同义词“含有”、“包含”或“特征在于”，是包含性的或开放式的并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的该领域术语，意指所指定的元素是必要的，但是可以添加其他元素并且仍然形成权利要求范围内的构造。
如本文所用，短语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当短语“由...组成”出现在权利要求正文的一个从句中，而不是紧接在前言之后时，它仅限制该从句中所示的要素；作为整体，其他要素不排除在权利要求之外。
如本文所用，短语“基本由...组成”将权利要求的范围限定到指定的材料或步骤，加上那些实质上不影响权利要求保护主题的基本的和新颖的特征。关于术语“包含”、“由......组成”和“基本由......组成”，当本文使用这三个术语中的一个时，当前公开的和权利要求保护的主题可包括使用其他两个术语中的任何一个。
如本文所用，术语“和/或”当在实体列表的上下文中使用时，是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、S、C和/或O”包括单独的A、S、C和O，但也包括A、S、C和O的任何组合和所有组合和子组合。
为了示例和描述的目的，已经呈现了前述优选实施方案的描述。这并非旨在穷举或限制本发明于所公开的精确形式。鉴于上述教导的明显修改或变化是可能的。选择和描述实施例是为了提供所公开主题的原理及其实际应用的最佳示例，从而使得本领域普通技术人员能够在各种实施方案中利用本发明并且进行适合于预期的特定用途的各种修改。当依据它们公平、合法和公正地授权的宽度进行解释时，所有这些修改和变化都在由权利要求所确定的本发明的范围内。
参考文献
1.Maurer R,Chenault J.Fertilization failure and embryonic mortalityin parous and nonparous beef cattle.J.Anim.Sci.1983；56:1186-1189.
2.Ahmad N,Schrick FN,Butcher RL,Inskeep EK.Effect of persistentfollicles on early embryonic losses in beef cows.Biol.Reprod.1995；52:1129-1135.
3.Dunne L,Diskin M,Sreenan J.Embryo and foetal loss in beef heifersbetween day 14of gestation and full term.Anim.Reprod.Sci.2000；58:39-44.
4.Diskin MG,Morris DG.Embryonic and early foetal losses in cattle andother ruminants.Reprod.Domest.Anim.2008；43Suppl 2:260-267.
5.Diskin MG,Murphy JJ,Sreenan JM.Embryo survival in dairy cowsmanaged under pastoral conditions.Anim.Reprod.Sci.2006；96:297-311.
6.Wiltbank MC,Baez GM,Garcia-Guerra A,Toledo MZ,Monteiro PL,Melo LF,Ochoa JC,Santos JE,Sartori R.Pivotal periods for pregnancy loss during thefirst trimester of gestation in lactating dairy cows.Theriogenology 2016；86:239-253.
7.Fricke P.Scanning the future—Ultrasonography as a reproductivemanagement tool for dairy cattle.J.Dairy Sci.2002；85:1918-1926.
8.Perry GA,Smith MF,Lucy MC,Green JA,Parks TE,MacNeil MD,Roberts AJ,Geary TW.Relationship between follicle size at insemination and pregnancysuccess.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2005；102:5268-5273.
9.Pohler K,Geary T,Johnson C,Atkins J,Jinks E,Busch D,Green J,MacNeilM,Smith M.Circulating bovine pregnancy associated glycoproteins areassociated with late embryonic/fetal survival but not ovulatory follicle sizein suckled beef cows.J.Anim.Sci.2013；91:4158-4167.
10.Pohler KG,Green JA,Geary TW,Peres RF,Pereira MH,Vasconcelos JL,Smith MF.Predicting Embryo Presence and Viability.Adv.Anat.Embryol.CellBiol.2015；216:253-270.
11.Pohler K,Pereira M,Lopes F,Lawrence J,Keisler D,Smith M,Vasconcelos J,Green J.Circulating concentrations of bovine pregnancy-associated glycoproteins and late embryonic mortality in lactating dairyherds.J.Dairy Sci.2016；99:1584-1594.
12.Gifford C,Racicot K,Clark D,Austin K,Hansen T,Lucy M,Davies C,OttT.Regulation of interferon-stimulated genes in peripheral blood leukocytes inpregnant and bred,nonpregnant dairy cows.J.Dairy Sci.2007；90:274-280.
13.Green J,Okamura C,Poock S,Lucy M.Measurement of interferon-tau(IFN-τ)stimulated gene expression in blood leukocytes for pregnancy diagnosiswithin18-20d after insemination in dairy cattle.Anim.Reprod.Sci.2010；121:24-33.
14.Gilad S,Meiri E,Yogev Y,Benjamin S,Lebanony D,Yerushalmi N,Benjamin H,Kushnir M,Cholakh H,Melamed N.Serum microRNAs are promising novelbiomarkers.PLoS One 2008；3:e3148.
15.Etheridge A,Lee I,Hood L,Galas D,Wang K.Extracellular microRNA:anew source of biomarkers.Mutat.Res.2011；717:85-90.
16.Gallo A,Tandon M,Alevizos I,Illei GG.The Majority of MicroRNAsDetectable in Serum and Saliva Is Concentrated in Exosomes.PLoS ONE 2012；7.
17.Valadi H,Ekstrom K,Bossios A,Sjostrand M,Lee JJ,LotvallJO.Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism ofgenetic exchange between cells.Nat.Cell Biol.2007；9:654-U672.
18.Gould SJ,Raposo G.As we wait:coping with an imperfect nomenclaturefor extracellular vesicles.J.Extracell.Vesicles 2013；2.
19.Wang K,Zhang S,Weber J,Baxter D,Galas DJ.Export of microRNAs andmicroRNA-protective protein by mammalian cells.Nucleic Acids Res.2010:gkq601.
20.Iguchi H,Kosaka N,Ochiya T.Secretory microRNAs as a versatilecommunication tool.Commun.Integr.Biol.2010；3:478-481.
21.Camussi G,Deregibus MC,Bruno S,Cantaluppi V,Biancone L.Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.Kidney Int.2010；78:838-848.
22.Thind A,Wilson C.Exosomal miRNAs as cancer biomarkers andtherapeutic targets.J.Extracell.Vesicles 2016；5.
23.Luo S-S,Ishibashi O,Ishikawa G,Ishikawa T,Katayama A,Mishima T,Takizawa T,Shigihara T,Goto T,Izumi A.Human villous trophoblasts express andsecrete placenta-specific microRNAs into maternal circulation viaexosomes.Biol.Reprod.2009；81:717-729.
24.Thery C,Amigorena S,Raposo G,Clayton A.Isolation andcharacterization of exosomes from cell culture supernatants and biologicalfluids.Curr.Protoc.Cell Biol.2006:3.22.21-23.22.29.
25.Hung ME,Leonard JN.Stabilization of exo some-targeting peptidesvia engineered glycosylation.J.Biol.Chem.2015；290:8166-8172.
26.Mathivanan S,Lim JW,Tauro BJ,Ji H,Moritz RL,Simpson RJ.Proteomicsanalysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the humancolon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific proteinsignature.Mol.Cell.Proteomics 2010；9:197-208.
27.Navakanitworakul R,Hung W-T,Gunewardena S,Davis JS,Chotigeat W,Christenson LK.Characterization and Small RNA Content of ExtracellularVesicles in Follicular Fluid of Developing Bovine AntralFollicles.Sci.Rep.2016；6.
28.Langmead B,Salzberg SL.Fast gapped-read alignment with Bowtie2.Nat Methods 2012；9:357-359.
29.Jiang P,Wu H,Wang W,Ma W,Sun X,Lu Z.MiPred:classification of realand pseudo microRNA precursors using random forest prediction model withcombined features.Nucleic Acids Res.2007；35:W339-344.
30.Robinson MD,McCarthy DJ,Smyth GK.edgeR:a Bioconductor package fordifferential expression analysis of digital gene expressiondata.Bioinformatics2010；26:139-140.
31.Benjamini Y,Hochberg Y.Controlling the false discovery rate:apractical and powerful approach to multiple testing.Journal of the RoyalStatistical Society.Series B(Methodological)1995:289-300.
32.Kirby CJ,Wilson SJ,Lucy MC.Response of dairy cows treated withbovine somatotropin to a luteolytic dose of prostaglandin F 2a.J.DairySci.1997；80:286-294.
33.Spencer TE,Sandra O,Wolf E.Genes involved in conceptus-endometrialinteractions in ruminants:insights from reductionism and thoughts on holisticapproaches.Reproduction 2008；135:165-179.
34.Robinson RS,Hammond AJ,Wathes DC,Hunter MG,Mann GE.Corpus luteum-endometrium-embryo interactions in the dairy cow:Underlying mechanisms andclinical relevance.Reprod.Domest.Anim.2008；43:104-112.
35.Godkin J,Bazer F,Thatcher W,Roberts R.Proteins released bycultured day15-16 conceptuses prolong luteal maintenance when introduced intothe uterine lumen of cyclic ewes.J.Reprod.Fertil.1984；71:57-64.
36.Roberts R,Imakawa K,Niwano Y,Kazemi M,Malathy P-V,Hansen T,GlassA,Kronenberg L.Interferon production by the preimplantation sheepembryo.J.Interferon Res.1989；9:175-187.
37.Stevenson J,Dalton J,Ott T,Racicot K,Chebel R.Correlation betweenreproductive status and steady-state messenger ribonucleic acid levels of theresistance gene,MX2,in peripheral blood leukocytes of dairyheifers.J.Anim.Sci.2007；85:2163-2172.
38.Reid G,Kirschner MB,van Zandwijk N.Circulating microRNAs:Association with disease and potential use as biomarkers.Crit.Rev.Oncol.Hematol.2011；80:193-208.
39.Miura K,Miura S,Yamasaki K,Higashijima A,Kinoshita A,Yoshiura K-i,Masuzaki H.Identification of pregnancy-associated microRNAs in maternalplasma.Clin.Chem.2010；56:1767-1771.
40.Kotlabova K,Doucha J,Hromadnikova I.Placental-specific microRNA inmaternal circulation-identification of appropriate pregnancy-associatedmicroRNAs with diagnostic potential.J.Reprod.Immunol.2011；89:185-191.
41.Cameron A,da Silveira J,Bouma G,Bruemmer J.Evaluation of exosomescontaining miRNA as an indicator of pregnancy status in the mare.J.EquineVet.Sci.2011；31:314-315.
42.Ioannidis J,Donadeu FX.Circulating miRNA signatures of earlypregnancy in cattle.BMC Genomics 2016；17:1.
43.Burns G,Brooks K,Wildung M,Navakanitworakul R,Christenson LK,Spencer TE.Extracellular Vesicles in Luminal Fluid of the Ovine Uterus.PLoSOne.2014；9:1-11.
44.Burns GW,Brooks KE,Spencer TE.Extracellular Vesicles Originatefrom the Conceptus and Uterus During Early Pregnancy inSheep.Biol.Reprod.2016:biolreprod.115.134973.
45.Raposo G,Stoorvogel W.Extracellular vesicles:exosomes,microvesicles,and friends.J.Cell Biol.2013；200:373-383.
46.Chevillet JR,Kang Q,Ruf IK,Briggs HA,Vojtech LN,Hughes SM,ChengHH,Arroyo JD,Meredith EK,Gallichotte EN.Quantitative and stoichiometricanalysis of the microRNA content of exosomes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2014；111:14888-14893.
47.Skog J,Wiirdinger T,van Rijn S,Meijer DH,Gainche L,Curry WT,CarterBS,Krichevsky AM,Breakefield XO.Glioblastoma microvesicles transport RNA andproteins that promote tumour growth and provide diagnosticbiomarkers.Nat.Cell Biol.2008；10:1470-1476.
48.Delorme-Axford E,Donker RB,Mouillet J-F,Chu T,Bayer A,Ouyang Y,Wang T,Stolz DB,Sarkar SN,Morelli AE.Human placental trophoblasts conferviral resistance to recipient cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2013；110:12048-12053.
49.Morello M,Minciacchi V,de Candia P,Yang J,Posadas E,Kim H,Griffiths D,Bhowmick N,Chung L,Gandellini P.Large oncosomes mediateintercellular transfer of functional microRNA.Cell cycle 2013；12:3526-3536.
50.Coutinho LL,Matukumalli LK,Sonstegard TS,Van Tassell CP,GasbarreLC,Capuco AV,Smith TP.Discovery and profiling of bovine microRNAs fromimmune-related and embryonic tissues.Physiol.Genomics 2007；29:35-43.
51.Bazer FW.Pregnancy recognition signaling mechanisms in ruminantsand pigs.J.Anim.Sci.Biotechnol.2013；4:1.
52.Carthew RW.A new RNA dimension to genome control.Science 2006；313:305-306.
53.Pillai RS.MicroRNA function:multiple mechanisms for a tiny RNA？RNA2005；11:1753-1761.
54.Ambros V,Chen X.The regulation of genes and genomes by smallRNAs.Development 2007；134:1635-1641.
55.He Z,Kokkinaki M,Pant D,Gallicano GI,Dym M.Small RNA molecules inthe regulation of spermatogenesis.Reproduction 2009；137:901-911.
56.Krawetz SA,Kruger A,Lalancette C,Tagett R,Anton E,Draghici S,Diamond MP.A survey of small RNAs in human sperm.Hum.Reprod.2011:der329.
57.Kim DH,Saetrom P,Sn0ve O,Rossi JJ.MicroRNA-directedtranscriptional gene silencing in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2008；105:16230-16235.
58.Valeri N,Vannini I,Fanini F,Calore F,Adair B,Fabbri M.Epigenetics,miRNAs,and human cancer:a new chapter in human gene regulation.Mamm.Genome2009；20:573-580.
59.Khraiwesh B,Arif MA,Seumel GI,Ossowski S,Weigel D,Reski R,FrankW.Transcriptional control of gene expression by microRNAs.Cell 2010；140:111-122.
60.Massirer KB,Pasquinelli AE.The evolving role of microRNAs inanimal gene expression.Bioessays 2006；28:449-452.
序列表
<110> 田纳西大学研究基金会（University of Tennessee Research Foundation）
<120> 用于早期胚胎活力的生物标志物及其方法
<130> 1101-015 PCT
<150> US 62/277,180
<151> 2016-01-11
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 7-3正向引物(5' - 3')
<400> 1
uagcagcacg uaaauauugg c 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 7-3反向引物(5' - 3')
<400> 2
cauugcacuu gucucggucu ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 8-2正向引物(5' - 3')
<400> 3
aaccacacaa ccuacuaccu ca 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 8-2反向引物(5' - 3')
<400> 4
cagccaacca gtgtctgcag aga 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 8-3正向引物(5' - 3')
<400> 5
ccaggatgga gatgcagttc tgc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 8-3反向引物(5' - 3')
<400> 6
cttcagagac gcctcagtcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 11正向引物(5' - 3')
<400> 7
tgaagcagcc aggaatagtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 11反向引物(5' - 3')
<400> 8
accctctcca ggaatccagt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 20正向引物(5' - 3')
<400> 9
gattctggtc ccaggtctga 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 20反向引物(5' - 3')
<400> 10
aggatggcac gaaaagccgg t 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> PAG 21-2正向引物(5' - 3')
<400> 11
tcgaaccttt gggctcacac ca 22

Claims (21)

1.一种用于确定雌性牛早期胚胎死亡(EM)的方法，包括：
在大约15至大约30天妊娠期，从所述雌性牛获得的血液样品分离血清；
确定所述血清的细胞外囊泡来源的微核糖核酸表达谱(血清EV miRNA)；
将所述血清EV miRNA表达谱与至少一个参考血清EV miRNA表达谱进行比较；和
通过比较，确定指示所述雌性牛的早期EM的血清EV miRNA表达谱(EM EV miRNA表达谱)。
2.根据权利要求1所述的方法，包括从以下一者或两者确定所述至少一个参考血清EVmiRNA表达谱：(i)在大约15至大约30天妊娠期从一只或多只参考怀孕雌性牛获得的血液样品，和(ii)从一只或多只参考未怀孕雌性牛获得的血液样品。
3.根据权利要求2所述的方法，包括提供在大约15至大约30天妊娠期从所述参考怀孕雌性牛获得的血液样品的所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
4.根据权利要求2所述的方法，进一步包括从所述血清分离EV以提供分离的EV的样品。
5.根据权利要求4所述的方法，进一步包括从分离的EV的所述样品提取核糖核酸，并通过高通量测序和逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)对EV miRNA扩增和定量，以提供所述血清EVmiRNA谱和所述至少一个参考血清EV miRNA谱。
6.根据权利要求5所述的方法，包括与所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱相比，确定所述EM EV miRNA表达谱，所述EM EV miRNA表达谱由miR-25、miR-16a/b或miR-3596中至少一者的量的增加组成。
7.根据权利要求5所述的方法，包括与所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱相比，确定所述EM EV miRNA表达谱，所述EM EV miRNA表达谱由miR-25、miR-16a/b和miR-3596的量的增加组成。
8.根据权利要求6所述的方法，包括使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11组成的组的引物扩增所述EV miRNA。
9.根据权利要求7所述的方法，包括使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:11组成的组的引物扩增所述EV miRNA。
10.根据权利要求6所述的方法，包括通过将有效的miRNA读段计数归一化至一些每百万读段计数(cpm)并且仅保留cpm大于或等于10的基因座，来标准化所述EM EV miRNA表达谱和所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
11.根据权利要求7所述的方法，包括通过归一化至一些有效miRNA读段的每百万读段计数(cpm)并且仅保留cpm大于或等于10的基因座，来标准化所述EM EV miRNA表达谱和所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
12.细胞外囊泡来源的微核糖核酸表达谱，其指示雌性牛在大约15至大约30天妊娠期的胚胎死亡(EM EV miRNA表达谱)，所述表达谱包括与至少一个参考血清EV miRNA表达谱中的miR-25、miR-16a/b和miR-3596的量相比，所述雌性牛的血清EV miRNA表达谱中miR-25、miR-16a/b和miR-3596的量增加。
13.根据权利要求12所述的表达谱，其中通过高通量测序和逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)测定miR-25、miR-16a/b和miR-3596的量。
14.根据权利要求13所述的表达谱，其中使用选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11组成的组的引物扩增miR-25、miR-16a/b和miR-3596。
15.根据权利要求12所述的表达谱，其中从以下一者或两者获得所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱：(i)在大约15至大约30天妊娠期从一个或更多个参考怀孕雌性牛获得的血液样品，和(ii)从一个或更多个参考未怀孕雌性牛获得的血液样品。
16.根据权利要求12所述的表达谱，其中所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱是在大约15至大约30天妊娠期从一个或更多个参考怀孕雌性牛获得的血液样品获得的。
17.根据权利要求12所述的表达谱，其中通过归一化至一些有效miRNA读段的每百万读段计数(cpm)并且仅保留cpm大于或等于10的基因座，来标准化所述EM EV miRNA表达谱和所述至少一个参考血清EV miRNA表达谱。
18.一种用于确定雌性牛早期胚胎死亡(EM)的试剂盒，所述试剂盒包含：
引物阵列，其包含用于测定指示所述EM的一个或更多个细胞外囊泡微核糖核酸(EVmiRNA)的表达水平的引物序列；
任选地，用于提取所述EV miRNA的试剂；和
任选地，用于对所述提取的EV miRNA进行逆转录酶定量PCR(RT-qPCR)的试剂。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述引物阵列包含用于测定从细胞外囊泡micro-RNA(EV miRNA)提取的miR-25、miR-16a/b和miR-3596中一者或多者的表达水平的引物序列。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述引物阵列包含如SEQ ID NO：9、SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示的引物序列。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述引物阵列由如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物序列组成。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111272507A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 昆明医科大学 一种观察检测血细胞的整合性实验方法
CN111455044A (zh) * 2020-06-10 2020-07-28 新疆农垦科学院 一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090131356A1 (en) * 2006-09-19 2009-05-21 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR-31, miR-145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216, miR-331, mmu-miR-292-3P REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20100151480A1 (en) * 2007-07-25 2010-06-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker
US20100291585A1 (en) * 2008-01-27 2010-11-18 Rosetta Genomics Ltd. Methods and compositions for diagnosing complications of pregnancy
US20140296099A1 (en) * 2011-10-12 2014-10-02 University Of Iowa Research Foundation Use of MicroRNA for Assessing Embryos Grown in Vitro and Improving Culture Media

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005013901A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US20060134639A1 (en) * 2004-04-06 2006-06-22 Huffel Christophe V Method for the determination of cellular transcriptional regulation
CN101798594A (zh) * 2009-11-13 2010-08-11 北京命码生科科技有限公司 检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒
WO2012069613A1 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for selecting competent oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome
CN104328202B (zh) * 2014-11-18 2016-05-25 武汉市畜牧兽医科学研究所 奶牛早期妊娠的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090131356A1 (en) * 2006-09-19 2009-05-21 Asuragen, Inc. miR-15, miR-26, miR-31, miR-145, miR-147, miR-188, miR-215, miR-216, miR-331, mmu-miR-292-3P REGULATED GENES AND PATHWAYS AS TARGETS FOR THERAPEUTIC INTERVENTION
US20100151480A1 (en) * 2007-07-25 2010-06-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker
US20100291585A1 (en) * 2008-01-27 2010-11-18 Rosetta Genomics Ltd. Methods and compositions for diagnosing complications of pregnancy
US20140296099A1 (en) * 2011-10-12 2014-10-02 University Of Iowa Research Foundation Use of MicroRNA for Assessing Embryos Grown in Vitro and Improving Culture Media

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENNA KROPP等: "Expression of microRNAs in bovine and human pre-implantation embryo culture media", 《FRONT GENET.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111272507A (zh) * 2020-02-28 2020-06-12 昆明医科大学 一种观察检测血细胞的整合性实验方法
CN111455044A (zh) * 2020-06-10 2020-07-28 新疆农垦科学院 一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用
CN111455044B (zh) * 2020-06-10 2023-05-23 新疆农垦科学院 一种用于母羊早期妊娠诊断的外泌体miRNA标志物及其应用

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