RU2770204C1 - Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени - Google Patents
Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2770204C1 RU2770204C1 RU2021121657A RU2021121657A RU2770204C1 RU 2770204 C1 RU2770204 C1 RU 2770204C1 RU 2021121657 A RU2021121657 A RU 2021121657A RU 2021121657 A RU2021121657 A RU 2021121657A RU 2770204 C1 RU2770204 C1 RU 2770204C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ureaplasma
- udv
- diversum
- dna
- detection
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для выявления микроорганизма Ureaplasma diversum в различном биологическом материале. Способ включает подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена 16 S рибосомальной РНК Ureaplasma diversum, содержащего прямой (Udv_F5'-CATTTACTTGCATGAGTGAATG-3') и обратный (Udv_R5'-AGCTACGCGTCAATGAC-3') праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (Udv_Z5'-(ROX)-TGGATGAGGGTGCGACGTATCATCC-(BHQ)-3'), и реакционную смеси. Амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 55°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на канале ROX/Orange). Результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии Ureaplasma diversum. Изобретение позволяет выявить ДНК Ureaplasma diversum в спермопродукции, предназначенной для искусственного осеменения крупного рогатого скота, с высокой специфичностью и чувствительностью. 1 табл., 1 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для выявления микроорганизма Ureaplasma diversion в различном биологическом материале, в том числе в сперме быков, используемой для искусственного осеменения.
Ureaplasma diversion - уреаплазма крупного рогатого скота, впервые выделенная в 1969 году. Первоначально этот микроорганизм был определен как непатогенный, но было показано, что он вызывает повреждение клеток и тканей крупного рогатого скота. U. diversion часто встречается в половых путях крупного рогатого скота и ассоциируется с основными расстройствами репродуктивной системы у этих животных. У коров, инфицированных U. diversion, наблюдается бесплодие, плацентит, альвеолит плода, аборты или рождение слабых телят. У быков U. diversion может вызывать снижение подвижности сперматозоидов, семенной везикулит и эпидидимит. U. diversion может обнаруживаться внутри клеток или прикрепляться к их поверхностям. Считается, что U. diversion обладает способностью как активировать, так и ингибировать апоптотические сигнальные пути, влияя на запрограммированную гибель клеток-хозяев. Инвазия U. diversion в сперматозоиды крупного рогатого скота приводит к низкой жизнеспособности сперматозоидов. Выделение U. diversion от больных животных происходит с молоком, мочой, влагалищными выделениями. Также есть данные о передаче микроорганизма как при естественном, так и при искусственном осеменении зараженной спермой. Таким образом важной задачей является исследование спермы на наличие U. diversion перед осеменением.
Лабораторный способ идентификации U. diversum чрезвычайно необходим, поскольку отсутствие явных клинических симптомов не позволяет идентифицировать возбудитель и провести его дифференциацию от других представителей Mollicutes, а значит принять своевременные меры по ограничению распространения заболевания.
В настоящее время для детекции Ureaplasma diversum в основном используются культуральные методы. Однако методы, основанные на использовании полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» являются более быстрыми и чувствительными, а также позволяют проводить специфичную идентификацию U. diversum даже в присутствии других патогенных бактерий. В России разработаны два диагностикума для выявления U. diversum на основе ПЦР: тест-система «Уреаплазмоз (Ureaplasma spp.)» (ООО «Фрактал Био», Россия) и диагностическая система «Ureaplasma diversum Amp» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера). Однако система «Уреаплазмоз (Ureaplasma spp.)» (ООО «Фрактал Био», Россия) не позволяет определять вид микроорганизма Ureaplasma spp. Ближайшим аналогом является ПЦР-тест-система «Ureaplasma diversum Amp» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера), она предназначена для анализа смывов и органов КРС, но не пригодна для детекции Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения достоверной диагностики уреаплазмоза на основе выявления ДНК бактерии-возбудителя Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
Технический результат - выявление ДНК Ureaplasma diversum в спермопродукции, предназначенной для искусственного осеменения крупного рогатого скота с высокой специфичностью и чувствительностью. Достигается разработкой методики обработки спермы и выделения из нее ДНК, а также использованием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда для идентификации ДНК Ureaplasma diversum при применении метода ПНР в режиме реального времени. Аналитическая чувствительность методики идентификации и детекции ДНК U. diversum составляет 3,45×103 коп/см3 в образцах спермы КРС. Специфичность способа идентификации и детекции ДНК U. diversum при исследовании бактериальных культур контрольной панели составляет 100%.
Был проведен сбор и анализ нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов семейства Mycoplasmataceae, представленных в базе данных GenBank. В качестве гена-мишени был выбран ген 16S рРНК. При подборе праймеров и зонда рассчитывали температуру отжига, возможность формирования димеров и вторичной структуры олигонуклеотидов. Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментом гена 16S рРНК U. diversum и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей семейства Mycoplasmataceae, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Udv_F 5'-CATTTACTTGCATGAGTGAATG-3'
Udv_R 5'-AGCTACGCGTCAATGAC-3';
Udv_Z 5'-(ROX)-TGGATGAGGGTGCGACGTATCATCC-(BHQ)-3'
Оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зонда, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.
Идентификацию ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота осуществляют следующим способом:
Поверхность соломины спермодозы крупного рогатого скота тщательно протирают обеззараживающим раствором 0,015% САНИВАП-Р, затем - раствором 70% этанола. Соломину опускают нижним концом в одноразовую пробирку-эппендорф и стерильными ножницами обрезают верхний конец, после чего соломину переворачивают и опять опускают в пробирку. Обрезают конец и, таким образом, переливают сперму в пробирку.
Полученный образец смешивают в соотношении 1:3 по объему с раствором натрия хлорида изотонического 0,9%. Перемешивают на вортексе. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 полученной смеси.
Выделение ДНК проводят с использованием приципитационного метода (наборы «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Проводят ПЦР в конечном объеме 25 мм3 со следующим составом реакционной смеси: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль специфических праймеров Udv_F и Udv_R, 3 пмоль специфического зонда Udv_Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
Выявление ДНК U. diversum проводится на приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 60 С, 10 с при 72 С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 55 С, 10 с при 72 С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Детектирование результата амплификации ДНК U. diversum проводится на канале ROX/Orange. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.
Пример 1. Проверка специфичности способа детекции ДНК бактерии Ureaplasma diversum.
С целью подтверждения специфичности ПНР, реакцию проводили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания КРС, а также геномной ДНК крупного рогатого скота (табл. 1).
Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки, т.к. набор выбранных праймеров амплифицирует только фрагмент генома микроорганизмов Ureaplasma diversum и не амплифицирует фрагменты генома других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК крупного рогатого скота.
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота
Для определения аналитической чувствительности способа идентификации ДНК Ureaplasma diversum в сперме КРС использовали положительный контрольный образец (ПКО) - рекомбинантную плазмиду, представляющую собой плазмиду pAL2-TA, содержащую целевую вставку с фрагментом гена 16S рРНК Ureaplasma diversum. Структуру положительного контрольного образца подтверждали методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye v. 1.1 («Applied Biosystems», USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.
Определение аналитической чувствительности ПЦР проводили способом последовательного разбавления ПКО U. diversum с известной концентрацией плазмидной ДНК (3,45×105 копий/см3). Использовали серии десятикратных разведений ПКО U. diversum в отрицательных образцах спермы КРС с концентрациями от 3,45×105 копий/см3 до 3,45×102 копий/см3. Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг. 1.
Фиг. 1. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота.
За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР (значения Ct<30).
Аналитическая чувствительность способа идентификации и детекции ДНК Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота составляет 3,45×103 коп/см3.
Claims (1)
- Способ идентификации и детекции ДНК бактерии Ureaplasma diversion в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР, включающий подготовку образца, выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием набора олигонуклеотидов, комплементарных области гена 16 S рибосомальной РНК Ureaplasma diversion, содержащего прямой (Udv_F5'-CATTTACTTGCATGAGTGAATG-3') и обратный (Udv_R5'-AGCTACGCGTCAATGAC-3') праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (Udv_Z5'-(ROX)-TGGATGAGGGTGCGACGTATCATCC-(BHQ)-3'), и реакционной смеси следующего состава: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (6 пмоль специфических праймеров и 3 пмоль специфического зонда, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора); амплификация проводится по следующей программе: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 55°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала на канале ROX/Orange); результаты амплификации оценивают с помощью программного обеспечения амплификатора, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией и диагностируют наличие генома бактерии Ureaplasma diversum.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021121657A RU2770204C1 (ru) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021121657A RU2770204C1 (ru) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2770204C1 true RU2770204C1 (ru) | 2022-04-14 |
Family
ID=81212589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021121657A RU2770204C1 (ru) | 2021-07-21 | 2021-07-21 | Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2770204C1 (ru) |
-
2021
- 2021-07-21 RU RU2021121657A patent/RU2770204C1/ru active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 7/ATT-PRINT-2018-1. SMITH A. Polymerase chain reaction fordetection of Ureaplasma diversum from urogenital swabs in cattle in Australia. Aust Vet J. 2012. 90(7), p.275-276. DOIG P.A. et al. The role of Ureaplasma infection in bovine reproductive disease. Compend Contin Educ. 1981. (3), p.324-330. * |
| DOIG P.A. et al. The role of Ureaplasma infection in bovine reproductive disease. Compend Contin Educ. 1981. (3), p.324-330. * |
| SMITH A. Polymerase chain reaction fordetection of Ureaplasma diversum from urogenital swabs in cattle in Australia. Aust Vet J. 2012. 90(7), p.275-276. * |
| КОЗЛОВА А.Д. и др. Выявление Ureaplasma diversum в образцах биологического материала крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени. Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, том 80, N1, 2018, с. 223-228, * |
| КОЗЛОВА А.Д. и др. Выявление Ureaplasma diversum в образцах биологического материала крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени. Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, том 80, N1, 2018, с. 223-228, DOI 10.30917/ATT-PRINT-2018-1. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2680094C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя лептоспироза (Leptospira spp.) у сельскохозяйственных животных | |
| RU2645263C1 (ru) | Тест-система для обнаружения ДНК вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| CN109609665B (zh) | 检测宠物源性人兽共患病的多重pcr引物探针及试剂盒 | |
| Clothier et al. | Effects of bacterial contamination of media on the diagnosis of Tritrichomonas foetus by culture and real-time PCR | |
| Oyhenart | Direct detection of Tritrichomonas foetus in cattle genital fluid trough loop mediated isothermal amplification of elongation factor 1 alpha 1 | |
| CN111471781A (zh) | 淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用 | |
| Alobaidii et al. | Detection of Trichomoniasis in cattle in Nineveh province | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| Calvani et al. | Not gone but forgotten: Tritrichomonas foetus in extensively-managed bulls from Australia’s Northern Territory | |
| RU2761496C2 (ru) | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени | |
| RU2770204C1 (ru) | Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени | |
| Lonkar et al. | Detection of Brucella melitensis in milk and serum samples of goats by serological and molecular techniques | |
| Gregg et al. | Risk and prevention of bovine viral diarrhea virus (BVDV) transmission through embryo production via somatic cell nuclear transfer (SCNT) using oocytes from persistently infected donors | |
| RU2726242C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Wilson et al. | Field-deployable real-time polymerase chain reaction detection of bluetongue and epizootic haemorrhagic disease viral ribonucleic acid | |
| RU2752893C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ | |
| CN111778343A (zh) | 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用 | |
| Arnauld et al. | Development of a PCR-based method coupled with a microplate colorimetric assay for the detection of porcine parvovirus and application to diagnosis in piglet tissues and human plasma | |
| RU2828887C1 (ru) | Набор высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зондов для детекции и дифференциации вирусов ачс, кчс и вд | |
| RU2700750C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса крупного рогатого скота 4-го типа (BHV-4) в пробах биоматериала | |
| RU2726432C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле | |
| RU2787048C1 (ru) | Способ детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени | |
| RU2814548C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| Singh et al. | Development and Standardization of Visual Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Specific Diagnosis of Johne's Disease | |
| RU2785381C1 (ru) | Тест-система для выявления ДНК возбудителя криптоспоридиоза (Cryptosporidiosis) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени |