RU2752893C1 - НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ - Google Patents
НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2752893C1 RU2752893C1 RU2020124793A RU2020124793A RU2752893C1 RU 2752893 C1 RU2752893 C1 RU 2752893C1 RU 2020124793 A RU2020124793 A RU 2020124793A RU 2020124793 A RU2020124793 A RU 2020124793A RU 2752893 C1 RU2752893 C1 RU 2752893C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hsmn
- dna
- real
- histophilus somni
- detection
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для диагностики гистофилеза крупного рогатого скота. Набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, содержит универсальные прямой (Hsmn_F) и обратный (HsmnR) праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (Hsmn Z) для идентификации бактерии Histophilus somni, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизма Histophilus somni, имеющие заявленный нуклеотидный состав. Способ идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени включает выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni в реакционной смеси. ПЦР в режиме реального времени проводится с использованием установленной программы амплификации. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией. 2 н.п. ф-лы, 2 пр., 1 табл., 1 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и генетической инженерии и может применяться для диагностики гистофилеза крупного рогатого скота.
Histophilus somni - представитель семейства Pasteurellaceae, является распространенной болезнетворной бактерией крупного рогатого скота. Н. somni - микроорганизм, который, как правило, осложняет вирусные инфекции и увеличивает степень заражения животных другими бактериальными агентами. Н. somni может поражать разные системы органов, вызывая мультисистемное заболевание, известное как гистофилез, при этом инфицирование верхних дыхательных путей часто предшествует поражению других систем органов. Дыхательная, генитальная, нервная, кровеносная и костно-мышечная (суставы) системы могут поражаться как индивидуально, так и вместе.
Лабораторный метод идентификации Histophilus somni чрезвычайно необходим, поскольку клинические симптомы не позволяют дифференцировать гистофилез, вызванный Н. somni, от других бактериальных и вирусных инфекций.
Способность Н. somni поражать разные органы животного и проявляться как комплекс мультисистемных заболеваний, создает проблемы для диагностики и контроля. Заболевания, вызванные Н. somni, в значительной степени не диагностируются, особенно миокардиты, так как небольшие фатальные поражения в сердце могут быть пропущены при вскрытии. Использование серологических методов в данном случае недостаточно эффективно как из-за предшествующей инфекции или колонизации, так и из-за перекрестно-реактивных антител. Выделение Н. somni из органов, особенно легких, в присутствии других патогенных микроорганизмов может быть затруднено, учитывая медленный рост и высокие требования к условиям культивирования данного микроорганизма. Поэтому точная идентификация Н. somni является сложной задачей, и необходим надежный метод выявления данной бактерии в клинических образцах. Метод, основанный на использовании полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяет проводить специфичную идентификацию сложнокультивируемых микроорганизмов, в том числе в присутствии других патогенных бактерий. Диагностикумы на основе ПЦР для выявления Н. somni используются в Европе и Америке, но не разработаны в России.
Аналогом является ПЦР-тест-система для выявления Histophilus somni LSI VetMAX™ Histophilus somni, производство Laboratoire Service International (LSI), Франция, а также лабораторные варианты систем [P. Pansri, J. Katholm... Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of pathogens associated with the bovine respiratory disease complex https://doi.org/10.1016/i.tvj 1.2020.105425, Loy J.D... Development of a multiplex real-time PCR assay using two thermocycling platforms for detection of major bacterial pathogens associated with bovine respiratory disease complex from clinical samples doi: 10.1177/1040638718800170]. Настоящая набор олигонуклеотидов в отличие от перечисленных аналогов может применяться для анализа не только образцов от крупного рогатого скота (КРС), но также свиней и мелкого рогатого скота (МРС). Кроме того, данный набор олигонуклеотидов и способ идентификации позволяет детектировать Н. somni не только в образцах назальных и транстрахеальных смывов, легких и бактериальных колоний, но также в сперме и образцах репродуктивных смывов. Также преимуществом данного способа идентификации Н. somni с использованием настоящего набора олигонуклеотидов является более быстрое время получения результата ПЦР (1,5 часа) по сравнению с LSI VetMAX™ Histophilus somni (3 часа).
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения достоверной диагностики гистофилеза на основе выявления ДНК бактерии-возбудителя Histophilus somni.
Технический результат достигается конструированием набора специфичных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда для идентификации ДНК Histophilus somni в биологических образцах методом ПЦР в режиме реального времени. Аналитическая чувствительность методики с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Н. somni составляет 1×104 коп/см3 в образцах легких, смывов из респираторного и репродуктивного трактов, а также сперме КРС, свиней и МРС. Специфичность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Н. Somni при исследовании бактериальных культур контрольной панели составляет 100%.
На первом этапе был проведен сбор и анализ нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов семейства Pasteurellaceae, представленных в базе данных GenBank. В качестве гена-мишени был выбран ген 16S рРНК. При подборе праймеров и зонда рассчитывали температуру отжига, возможность формирования димеров и вторичную структуру олигонуклеотидов. Технический результат достигается высокой степенью гомологии выбранных олигонуклеотидов с фрагментом гена 16S рРНК Η somni и значительным отличием от нуклеотидных последовательностей других представителей семейства Pasteurellaceae, а также отсутствием формирования шпилек с температурой плавления выше комнатной температуры. Выбранные олигонуклеотиды имеют следующую структуру:
Hsmn_F 5'- GGAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3'
Hsmn_R 5'- CCTCACTTAAGTCACCACCT-3'
HsmnZ (ROX)-CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT-(BHQ)
Далее были оптимизированы условия амплификации: концентрации праймеров и зонда, концентрация ионов магния в реакционной смеси, температура отжига праймеров и длительность основных стадий амплификации.
Идентификацию и детекцию ДНК бактерии Histophilus somni осуществляют следующим способом:
Материалом для исследования служат пробы биологического материала сельскохозяйственных животных (образцы назальных и транстрахеальных смывов, репродуктивных смывов, бактериальных колоний, спермы, молока и патологического материала). Отбор материала: пробы отбирают любым пригодным для последующей постановки ПЦР способом. Пробы молока, жидкие культуры микроорганизмов и смывы со слизистых используют без предварительной подготовки. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 образца. Пробы паренхиматозных органов измельчают и готовят 10% суспензию в растворе натрия хлорида изотонического 0,9%. Для экстракции ДНК используют 100 мм3 верхней фракции суспензии.
Выделение ДНК проводят с использованием приципитационного метода (наборы «Рибо-преп», ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Проводят ПЦР в конечном объеме 25 мм3 со следующим составом реакционной смеси: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (3 пмоль специфических праймеров Hsmn F и Hsmn_R, 2 пмоль специфического зонда Hsmn Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3 (Синтол, Россия), деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
Оптимизированный состав Выявление ДНК Н. somni проводится на приборах RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) или RotorGene Q (Qiagen, Германия) по следующему температурному протоколу: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 63°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала). Детектирование результата амплификации ДНК Η somni проводится на канале ROX/Orange. Результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.
Пример 1. Проверка специфичности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni.
С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, реакцию ставили с ДНК/кДНК различных микроорганизмов и вирусов, вызывающих инфекционные заболевания КРС, а также геномной ДНК крупного рогатого скота (табл. 1).
Данный пример демонстрирует высокую специфичность (100%) настоящей разработки (набор выбранных праймеров амплифицирует только фрагмент генома микроорганизмов Histophilus somni и не амплифицирует ДНК/кДНК других микроорганизмов, вирусов и геномную ДНК крупного рогатого скота).
Пример 2. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Histophilus somni.
Для определения аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов использовали положительный контрольный образец (ПКО) - рекомбинантную плазмиду, представляющую собой плазмиду pAL2-ТА, содержащую целевую вставку с фрагментом гена 16S рРНК Histophilus somni. Структуру положительного контрольного образца подтверждали методом секвенирования по Сенгеру. Секвенирование фрагментов амплификации выполняли методом "cycle sequence" с набором ABI PRISM Big Dye v.1.1 («Applied Biosystems», USA), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.
Определение аналитической чувствительности ПЦР проводили способом последовательного разбавления ПКО Н. somni с известной концентрацией плазмидной ДНК (1×106 копий/см3). Использовали серии десятикратных разведений ПКО Н. somni в отрицательных образцах вагинальных смывов, молока, спермы и внутренних органов КРС с концентрациями от 1×105 копий/см3 до 1×102 копий/см3. Амплификацию проводили на приборе Rotor Gene Q (Qiagen, Германия). Эксперимент проводили в разные дни, разные исполнители на разных приборах. Результаты представлены на фиг. 1.
Фиг. 1. Оценка аналитической чувствительности набора олигонуклеотидов и способа идентификации и детекции ДНК Histophilus somni.
За аналитическую чувствительность принимали наименьшую концентрацию ПКО, для которой получен положительный результат ПЦР (значения Ct<30).
Аналитическая чувствительность набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК Histophilus somni в образцах биологического материала составляет 1×104 коп/см3.
Claims (5)
1. Набор олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, содержащий универсальные прямой (Hsmn_F) и обратный (Hsmn_R) праймеры и флуоресцентно-меченый зонд (HsmnZ) для идентификации бактерии Histophilus somni, комплементарные области гена 16 S рибосомальной РНК микроорганизма Histophilus somni, имеющие следующий нуклеотидный состав:
Hsmn_F 5'- GGAAGGCGATTAGTTTAAGAG-3'
Hsmn_R 5'- CCTCACTTAAGTCACCACCT-3'
Hsmn Z (ROX)-CACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGT-(BHQ)
2. Способ идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni методом ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из биологического материала, постановку полимеразной цепной реакции с использованием набора олигонуклеотидов для идентификации и детекции ДНК бактерии Histophilus somni (п.1) в реакционной смеси следующего состава: 10 мм3 ДНК-матрицы, 10 мм3 ПЦР-смеси-1 (3 пмоль специфических праймеров Hsmn_F и Hsmn_R, 2 пмоль специфического зонда Hsmn Z, 2,5 мм3 раствора дНТФ с концентрацией каждого нуклеотида 1,76 ммоль/дм3, деионизованная вода), 0,5 мм3 Taq-F полимеразы, 5 мм3 ПЦР-буфера-Flu, а также детектирование флуоресцентного сигнала непосредственно в процессе реакции амплификации на канале ROX/Orange, ПЦР в режиме реального времени проводится с использованием следующей программы амплификации: 15 мин при 95°С; 10 с при 95°С, 20 с при 63°С, 10 с при 72°С (5 циклов без детекции флуоресцентного сигнала); 10 с при 95°С, 20 с при 60°С, 10 с при 72°С (35 циклов с детекцией флуоресцентного сигнала), результаты амплификации в режиме реального времени оценивают с помощью программного обеспечения, при этом результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне 0,05 пороговой линией.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124793A RU2752893C1 (ru) | 2020-07-16 | 2020-07-16 | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124793A RU2752893C1 (ru) | 2020-07-16 | 2020-07-16 | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2752893C1 true RU2752893C1 (ru) | 2021-08-11 |
Family
ID=77349009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020124793A RU2752893C1 (ru) | 2020-07-16 | 2020-07-16 | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2752893C1 (ru) |
-
2020
- 2020-07-16 RU RU2020124793A patent/RU2752893C1/ru active
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| LOY J.D, Development of a multiplex real-time PCR assay using two thermocycling platforms for detection of major bacterial pathogens associated with bovine respiratory disease complex from clinical samples doi: 10.1177/1040638718800170. * |
| PANSRI P, et al. Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of pathogens associated with the bovine respiratory disease complex https://doi.org/10.1016/i.tvj 1.2020.105425. * |
| PANSRI P, et al. Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of pathogens associated with the bovine respiratory disease complex https://doi.org/10.1016/i.tvj 1.2020.105425. LOY J.D, Development of a multiplex real-time PCR assay using two thermocycling platforms for detection of major bacterial pathogens associated with bovine respiratory disease complex from clinical samples doi: 10.1177/1040638718800170. ЛАЗАРЕВА Е.А., Скрининговые исследования спермы быков в ПЦР для выявления патогенов, Ветеринария, N10, 2019, с.42-47, DOI:10.30896/0042-4846.2019.22.10.42-47. КОЗЛОВА А.Д., и др., Разработка методики выявления Histophilus somni на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, Научное обеспечение агропромышленного комплекса, Сборник тезисов по материалам Всероссийской (национальной) конференции, 19.12.2019, с.109-110. * |
| КОЗЛОВА А.Д., и др., Разработка методики выявления Histophilus somni на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, Научное обеспечение агропромышленного комплекса, Сборник тезисов по материалам Всероссийской (национальной) конференции, 19.12.2019, с.109-110. * |
| ЛАЗАРЕВА Е.А., Скрининговые исследования спермы быков в ПЦР для выявления патогенов, Ветеринария, N10, 2019, с.42-47, DOI:10.30896/0042-4846.2019.22.10.42-47. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108384899B (zh) | 一种检测新型鹅星状病毒的荧光定量pcr试剂盒及应用 | |
| CN110878377B (zh) | 非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒 | |
| CN110656187B (zh) | 多重raa以及多重pcr检测病变组织或犬粪便中棘球绦虫的试剂盒及检测方法 | |
| CN111286559B (zh) | 检测非洲猪瘟病毒的引物、探针及试剂盒 | |
| CN110964857A (zh) | 排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用 | |
| CN103725798A (zh) | 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法 | |
| CN112458208B (zh) | 检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法 | |
| RU2681473C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома вируса парагриппа 3 типа у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| CN110607398B (zh) | 一种荧光可视化快速检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp试剂盒 | |
| RU2761496C2 (ru) | Способ идентификации вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе ПЦР в реальном времени | |
| RU2752893C1 (ru) | НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ДНК БАКТЕРИИ Histophilus somni МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ | |
| CN114480726B (zh) | 非洲猪瘟病毒核酸检测的引物探针组、试剂盒及检测方法 | |
| CN115612753A (zh) | 一种阿留申、肠炎、犬瘟热病检测的方法 | |
| CN113502341B (zh) | 梅毒螺旋体16s RNA的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针 | |
| CN114934043A (zh) | 检测犬立克次氏体和犬埃立克体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法 | |
| WO2021255787A1 (ja) | ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用プライマーセット、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検査するための方法、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検査試薬および検査キット | |
| CN111778343A (zh) | 一种检测布鲁氏菌s2疫苗株的引物对、试剂盒及其应用 | |
| RU2698662C1 (ru) | Тест-система для выявления РНК возбудителя вируса артериита у лошадей | |
| CN113388700A (zh) | 一种核酸免提取三重荧光rt-lamp检测fcv、fpv及fhv-1病毒的试剂盒 | |
| RU2770204C1 (ru) | Способ идентификации ДНК бактерии Ureaplasma diversum в сперме крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени | |
| CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 | |
| RU2694499C1 (ru) | Тест-система для обнаружения генома возбудителя коронавирусной инфекции у крупного рогатого скота с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
| CN112941212A (zh) | 用于现场检测布鲁氏杆菌的通用型引物组、试剂盒及方法 | |
| RU2728342C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота | |
| CN111793722A (zh) | 一步法检测2型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒 |