CN111051530A - 反刍动物的妊娠的判断方法 - Google Patents
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Abstract
课题：本发明的目的在于实现对于对象动物的侵入少、对胎儿的影响小、能够在饲养现场实施的家畜动物的妊娠判断。解决手段：本发明涉及一种判断反刍动物的妊娠的方法，包括：使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN‑τ而被诱导的分子的表达量的测定工序；以及通过将该表达量与未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中前述分子的表达量进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。根据本发明，能够在交配、人工授精或受精卵移植后且在新的排卵周期开始前迅速进行妊娠判断。
Description
技术领域
本发明涉及判断反刍动物的妊娠的方法。
背景技术
近年来，不管是肉用、乳用还是其他用途，家牛、绵羊、山羊等家畜动物的繁殖几乎都是通过人工授精或受精卵移植进行。然而，人工授精、受精卵移植带来的受孕率不高，例如乳用牛的受孕率低于50％。低受孕率给畜牧业者带来了人工授精或受精卵移植次数的増加、未妊娠的空胎时期和分娩间隔的延长等导致的生产成本增加等严重的经济负担。
家畜动物发情征兆的弱化、遗传改良对繁殖性状的负面影响、或者大规模经营导致的多头化饲养等被指为低受孕率的原因，但根本原因还不明了，虽然也在进行提高受孕率的研究，但也没有发现改善的迹象。因此，强烈需要提早对进行了人工授精或受精卵移植的家畜动物进行妊娠判断、缩短空胎时期和分娩间隔。
家牛的妊娠判断主流是通过直肠检测法和超声波诊断法进行。虽然任一方法的判断结果可靠性都很高，但是必须在受精后过一个月以上再实施。假设家牛的排卵周期为21天，这意味着上述一个月以上的等待会在确定未受孕前的时期失去一次或两次进行新的人工授精或受精卵移植的机会。在作为其结果而产生的空胎时期不会获得生产收入，产生了饲养所需的损失金额。
这种情况下，如果能够在人工授精或受精卵移植后、经过排卵周期前迅速进行妊娠判断，则能够根据下一排卵周期对未受孕牛进行人工授精或受精卵移植，可期待事实上的受孕率提高。
反刍动物中，作为一种I型干扰素的干扰素-τ(IFN-τ)与受精胚的着床相关。列举家牛为例，受精后一边重复卵裂一边进入子宫内的胚胎进入分化出将来可成为胎儿的内部细胞团和形成胎盘的滋养膜细胞这2种细胞群的囊胚期。IFN-τ从该滋养膜细胞产生，由此，母体识别胚胎的存在，调整为适合着床的子宫内环境。
来自反刍动物滋养膜细胞的IFN-τ产生量曲线中，已知不管反刍动物的种类如何，都有下述大体共通的模式：从卵裂至囊胚形成的产生量少，在孵化(hatching)后即从容纳到达子宫的胚胎的糖蛋白囊即透明带脱出后急速増加，着床前迎来峰值，然后经过着床而急速减少。此外还已知，在母体内膜组织中，由于从滋养膜细胞产生的IFN-τ的刺激，ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1等IFN-τ诱导性因子(干扰素刺激基因，interferon stimulated genes，ISGs)的表达被诱导。另一方面，卵子未受精的情况下或虽然受精但受精胚不存在于子宫内的情况下，妊娠不成功，确认不到IFN-τ的产生和IFN-τ诱导性因子的表达，开始新的排卵周期。
从以上机制出发，子宫腔内的胚胎导致的IFN-τ的产生或子宫内膜组织中IFN-τ诱导性因子的表达可期待成为反刍动物的妊娠的早期判断指标。以子宫内部的组织为对象的待测物采集中，对于对象动物的侵入、对于胎儿的影响令人担忧，因此，代替该采集方法，开发了以母体的血液待测物为对象的通过检测IFN-τ诱导性因子的表达而进行的妊娠判断方法(专利文献1)。可是，血液诊断中，每个个体的基因表达量存在波动等，判断结果的可靠性不一定高。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2004-534224号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于实现对于对象动物的侵入少、对胎儿的影响小、能够在饲养现场实施的家畜动物的妊娠判断。
用于解决课题的方法
本发明人等发现，在妊娠的家牛的作为子宫外组织的子宫颈管和外子宫口周边阴道壁的粘膜中IFN-τ诱导性因子是表达的，进一步发现在阴道前庭的粘膜中同一因子也是表达的，从而完成了下述各发明。
(1)一种判断反刍动物的妊娠的方法，包括：使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的测定工序；以及通过将该表达量与未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中前述分子的表达量进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。
(2)根据(1)所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样是从阴道至阴门的生殖器采集。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样是从生殖器的表面低侵入性或非侵入性地采集。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样实质上不含血液。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因组成的组的至少1种基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由ISG15、OAS-1X、Mx1和Mx2基因组成的组的至少1个基因转录的mRNA。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量通过定量PCR法或LAMP(环介导等温扩增)法测定。
(8)根据(1)～(7)中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量是在不进行来自粘膜上皮细胞的RNA的分离纯化处理的情况下测定。
(9)根据(1)～(8)中任一项所述的方法，反刍动物选自由家牛、绵羊、山羊、水牛、牦牛和鹿组成的组。
(10)一种用于判断反刍动物的妊娠的试剂盒，包括用于测定待测反刍动物粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的试剂，以及用于采集含有前述细胞的试样的器具。
(11)根据(10)所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因组成的组的至少1种基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白。
(12)根据(10)或(11)所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由ISG15、OAS-1X、Mx1和Mx2基因组成的组的至少1个基因转录的mRNA。
(13)根据(10)～(12)中任一项所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为mRNA，用于测定前述分子的表达量的试剂为用于核酸扩增法的试剂。
(14)根据(10)～(13)中任一项所述的试剂盒，用于采集含有前述细胞的试样的器具为用于低侵入性或非侵入性地采集试样的器具。
发明的效果
根据本发明，能够在交配、人工授精或受精卵移植后且在新的排卵周期开始前迅速进行妊娠判断。通过在未受孕时根据下一排卵周期进行交配、人工授精或受精卵移植，能够缩短空胎时期和分娩间隔，能够实质上实现受孕率的提高。
附图说明
图1为显示妊娠牛和非妊娠牛的子宫颈管的粘膜中ISG15、Mx1、Mx2和OAS-1X的相对基因表达量的图表。
图2为显示妊娠牛和非妊娠牛的外子宫口周边部的粘膜中ISG15、Mx1和Mx2的相对基因表达量的图表。
图3为显示妊娠牛的子宫颈管、外子宫口周边部和阴道前庭以及非妊娠牛的子宫颈管的粘膜中ISG15的相对基因表达量的图表。
图4为显示通过RTLAMP法定量测定妊娠牛和非妊娠牛的子宫颈管的粘膜中ISG15的基因表达量的结果(浊度的经时性演变)的图表。
图5为显示通过RTLAMP法定量测定妊娠牛和非妊娠牛的子宫颈管的粘膜中ISG15的基因表达量的结果(LAMP反应开始后30分钟时的浊度)的图表。
具体实施方式
本发明的第1方式涉及一种判断反刍动物的妊娠的方法，包括：使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的测定工序；以及通过将该表达量与未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中前述分子的表达量进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。
本发明的第1方式包括使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的测定工序。
本发明的第1方式适用于处于相当于妊娠初期时期的反刍动物。处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物是预先进行了交配、人工授精或受精卵移植的反刍动物。交配尤其是指通过作为所谓与父本交尾的自然交配来进行，但也可以是人为交配。此外，人工授精和受精卵移植也可以通过本领域技术人员公知的任一方法来进行，本发明的适用不受这些具体手段或方法等的限制。
作为本发明的适用对象的反刍动物只要是进行反刍的哺乳动物则没有特别限制，可以列举家牛、绵羊、山羊、牦牛、水牛和鹿作为优选例。家牛、绵羊、山羊、水牛是更优选的适用对象，特别是更优选家牛、水牛、牦牛。家牛为肉牛、乳牛中的任一种均可。水牛为沼泽型、河川型中的任一种均可。
相当于妊娠初期的时期是指相当于从受精胚开始产生IFN-τ的妊娠识别开始时至着床的时期。关于相当于妊娠初期的时期，家牛为受精后14～20天，绵羊为14～20天，山羊为16～20天，牦牛为14～19天，水牛为14～20天，鹿为14～20天。本发明特别优选适用于处于上述相当于妊娠初期的时期中IFN-τ的产生量接近峰值的时期的反刍动物。
在进行了交配或人工授精的反刍动物中适用本发明的情况下，相当于妊娠初期的时期是将进行交配或人工授精的那一天作为受精后0天计算。此外，在进行了受精卵移植的反刍动物中适用本发明的情况下，相当于妊娠初期的时期是将移植的受精卵发生受精的那一天作为受精后0天计算。例如在将从进行供卵牛的人工授精日起7天后采集的受精后第7天的受精卵移植入受胚牛时，该受胚牛中相当于妊娠初期的时期是受精后14～20天、即受精卵移植后7～13天。
子宫颈管至阴门的生殖器是反刍动物雌性生殖器中从子宫颈管至阴门的部分，典型地是指子宫颈管、阴道、阴道前庭和阴门。阴道深部、即子宫颈管的阴道侧的管口的周边部也称为外子宫口周边部。
含有粘膜上皮细胞的试样可以是从子宫颈管至阴门的生殖器中的至少1个部位采集的试样。试样可以通过下述方法采集：直接或者根据需要用阴道镜等将阴道扩张后，将匙、棉签、耳扒、海绵及其他对于低侵入性或非侵入性地采集试样而言合适的器具插入至期望的采集部位，对各部位的表面进行刮取或擦拭，从而进行采集。采集的含有粘膜上皮细胞的试样只要含有粘膜上皮细胞即可，可以含有粘液、粘膜固有层或粘膜肌层的细胞。含有粘膜上皮细胞的试样优选从阴道至阴门的生殖器采集。此外含有粘膜上皮细胞的试样优选从生殖器表面低侵入性或非侵入性地采集。特别优选的实施方式中，含有粘膜上皮细胞的试样从阴道至阴门的生殖器表面非侵入性地采集、并且实质上不含血液。这里“实质上不含血液”的意思是，不含有在使用该试样测定应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量时会对测定结果产生影响那样的量的血液。典型地，“实质上不含血液”的试样所含的细胞中，其大多数、例如90％以上、优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上为粘膜上皮细胞。
含有粘膜上皮细胞的试样可以以从待测反刍动物采集后的状态直接用于测定，或者也可以分离其中所含的细胞用于测定，或者也可以将它们的匀浆物用于测定，或者也可以从它们分离作为测定对象的mRNA或者蛋白等成分而用于测定。此外，还可以在冷藏、冷冻或干燥后、或者用福尔马林固定等一般的保存方法处理后用于测定。
不分离测定对象的成分而直接对组织或细胞进行测定的情况下，为了容易地检测存在于组织或细胞内部的该成分，也可以进行提高细胞膜透过性的处理，促进用于检测mRNA或蛋白的试剂向细胞内的浸透。
作为应答IFN-τ而被诱导的分子，可以列举从IFN-τ诱导性因子的基因转录的mRNA和/或该基因编码的蛋白。作为IFN-τ诱导性因子，已知有ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1、OAS-2、LOC100139670、USP18、RSAD2、UBA7、GBP4、GBP5、TNFSF10、JAK1、STAT2和PLAC8等。此外，应答IFN-τ而被诱导的分子也可以通过下述方法来确定：从由作为对象的反刍动物摘下的子宫颈管至阴门的生殖器中的至少1个部位分离粘膜上皮细胞，在IFN-τ存在下和不存在下分别进行培养，对此时的基因表达曲线进行比较，从而确定。这样的基因表达分析可以通过使用DNA芯片、基因(Gene)芯片、微芯片、微珠阵列等本领域技术人员公知的方法来进行。
作为应答IFN-τ而被诱导的分子的优选例，可以列举从选自由LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因组成的组的至少1种基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白。
从家牛(Bos taurus)的LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因转录的mRNA的碱基序列、和它们编码的蛋白的氨基酸序列在GenBank中分别登记于表1所示登录号。
[表1]
mRNA表达量的测定可以通过下述方法来进行：使用了以作为对象的mRNA的碱基序列为基础设计的包含适当碱基序列的引物核酸的定量PCR法或LAMP(环介导等温扩增)法等核酸扩增法、使用了包含能够在严格条件下与mRNA的碱基序列杂交的碱基序列的探针核酸的杂交法、使用了包含能够与mRNA的碱基序列杂交的碱基序列的核酸被固定化的DNA芯片、Gene芯片、微芯片、微珠阵列等的微阵列法、其他能够测定mRNA的表达量的公知方法。前述核酸可以根据所使用的方法用荧光物质、放射性同位素、酶、生物素、链霉亲和素及其他标记化合物标记。特别是在饲养反刍动物的现场的测定、即所谓原位测定优选通过定量PCR法或LAMP法来进行。
蛋白表达量的测定可以使用对于作为对象的蛋白而言的特异性抗体通过直接竞争法、间接竞争法、三明治法等ELISA法、RIA法、原位杂交、免疫印迹分析、蛋白质印迹分析和组织阵列分析等公知方法来进行。这种情况下，特异抗体不受来源动物物种的限制，此外可以为多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种，也可以为包含免疫球蛋白全长的抗体或Fab片段或者F(ab’)2片段等部分片段等。
特异抗体可以用荧光物质(例如FITC、罗丹明、鬼笔环肽等)、金等胶体粒子、Luminex(注册商标，Luminex公司)等荧光微珠、重金属(例如金、铂等)、色素蛋白(例如藻红蛋白、藻蓝蛋白等)、放射性同位素(例如3H、14C、32P、35S、125I、131I等)、酶等(例如过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、生物素、链霉亲和素及其他标记化合物标记。
本发明的第1方式包括通过将前述测定工序中测得的应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量与未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中前述分子的表达量进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。
未妊娠的同种反刍动物是指未进行交配、人工授精或受精卵移植的、与待测反刍动物同种的雌性反刍动物。此外，未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞是指从未妊娠的同种反刍动物的、与待测反刍动物的粘膜上皮细胞的采集部位相同的部位采集的粘膜上皮细胞，例如待测反刍动物的粘膜上皮细胞为从子宫颈管采集的细胞的情况下，未妊娠的同种反刍动物的相应粘膜上皮细胞是从未妊娠的同种反刍动物的子宫颈管采集的细胞。
未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中前述分子的表达量作为相对于待测反刍动物中前述分子的表达量的对照使用。因此，例如测定受精后第18天的乳牛的子宫颈管粘膜上皮细胞中ISG15基因的mRNA的表达量的情况下，处于相同排卵周期的非妊娠乳牛的子宫颈管粘膜上皮细胞中ISG15基因的mRNA的表达量是对照。对照也可以通过预先测定非妊娠的反刍动物在相当于妊娠初期的时期应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量来准备。对照中的反刍动物种类、粘膜上皮细胞的采集部位、采集时期、作为测定对象的分子、测定方法等条件如在测定工序中说明，优选使用与待测反刍动物相同的条件。
应答IFN-τ而被诱导的前述分子的表达量的比较可以根据测定方法适当进行。例如利用实时PCR法测定的情况下，可以使用待测反刍动物和非妊娠的反刍动物各自的含有粘膜上皮细胞的试样，测定目标基因(前述分子的基因)的Ct值和参照基因(持家基因等)的Ct值，通过比较Ct法，算出待测反刍动物中前述分子的表达量为对照中前述分子的表达量的多少倍，从而进行比较。例如通过实时PCR法或LAMP法测得的待测反刍动物中前述分子的ΔCt值或ΔTt值大于对照的ΔCt值或ΔTt值的2倍时、优选大于3倍时、更优选大于5倍时、特别优选大于10倍时，可以判断待测反刍动物是妊娠的。
判断工序中的判断也可以通过分别测定待测反刍动物和非妊娠的反刍动物中的表达量并直接将其进行比较来进行，也可以通过下述方法来进行：将测定条件设定为来自妊娠动物的待测物中为阳性而来自非妊娠动物的待测物中为阴性，观察来自待测反刍动物的待测物显示阳性阴性中的哪个测定结果。例如通过PCR法、LAMP法等核酸扩增法测定前述分子的表达量的情况下，也可以通过下述方法进行判断：以来自妊娠动物的待测物中扩增产物被检测到而来自非妊娠动物的待测物中扩增产物的量在检测灵敏度以下或规定值以下的方式，适当地对待测物进行稀释、或适当调整扩增反应的循环数或者反应时间，以此进行核酸扩增反应，观察扩增产物的有无或将扩增产物的量与前述规定值进行比较，从而判断。
第1方式中的判断工序也可以替换为通过将前述测定工序中测得的应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量与截止值进行比较从而判断待测反刍动物的妊娠的其他判断工序。因此，本发明的另一方式涉及一种判断反刍动物的妊娠的方法，包括：使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的测定工序；以及通过将该表达量与截止值进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。
截止值是根据试样的采集部位、测定对象的前述分子，使用ROC曲线等适当设定。如果待测反刍动物中分子的表达量大于截止值则可以判断待测反刍动物是妊娠的，如果小于截止值则可以判断待测反刍动物是未妊娠的。
基于上述判断基准判断为非妊娠的待测反刍动物可以根据即将到来的排卵周期用于再次交配、人工授精或受精卵移植。
本发明的另一方式涉及一种用于基于本发明的第1方式来判断妊娠的试剂盒。试剂盒包括用于测定粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的试剂，具体地包括用于上面列举的各种测定方法的试剂。作为这些试剂，例如可以列举用于核酸扩增法或ELISA法的试剂，典型地可以列举引物核酸或探针核酸、dNTP、特异抗体、二抗、酶、缓冲液、显色试剂等。试剂盒可以进一步包括用于测定前述分子的表达量的装置，用于从待测反刍动物采集含有粘膜上皮细胞的试样的器具、例如匙、耳扒、棉签或海绵等，用于保持前述试样的容器或支撑体等。优选地试剂盒可以进一步包括有关基于应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量来判断待测反刍动物的妊娠的说明书。
通过以下的实施例进一步详细地对本发明进行说明，但本发明不受这些例子的限定。
实施例
实施例1.妊娠牛和非妊娠牛的子宫外组织(子宫颈管和外子宫口周边部)中干扰
素诱导性因子的表达分析
1)粘膜的采集
在北海道大学北方生物圈野外科学中心生物生产研究农场乳制品生产研究设施饲养的黑白花牛(holstein)品种挤奶牛中，分别选择通过后面的妊娠鉴定确定了妊娠的人工授精后经过了18天的家牛和未进行人工授精的家牛，用逆化皂水溶液擦拭外阴部。直接或者使用阴道镜将阴道前庭打开，插入市售的量匙，分别从子宫颈管和外子宫口周边部刮取采集粘膜。采集的试样的目测观察中未确认到血液的混入，此外在显微镜观察中确认到试样所含的细胞大多数(95％以上)为粘膜上皮细胞。将试样迅速回收至分装了500μLISOGEN II(Nippon Gene)并且进行了冰冷却的1.5mL管中，-80℃冷冻保存。
2)总RNA的提取
使冷冻的粘膜融化，加入500μL ISOGEN II并混和。加入200μL无RNase H2O(Nippon Gene)，将管充分振荡15秒。室温静置15分钟后，在4℃、12,000g离心15分钟，将其上清回收在1.5mL管中。加入与回收的上清等量的2-丙醇(Wako)，颠倒混和后，在-30℃静置10分钟。静置后，在4℃、12,000g离心10分钟，去掉上清。在各管中加入500μL 75％乙醇，颠倒混和，在4℃、15,000g离心5分钟。重复以上操作，去掉上清后真空干燥10分钟，加入30μL无RNase H2O，得到总RNA。测定RNA浓度后，在使用前保存于-80℃。
3)通过逆转录反应进行的cDNA合成
使用带有gDNA去除剂的ReverTra Ace(注册商标)q-PCR RT Master Mix(TOYOBO)，进行从总RNA的cDNA逆转录。该反应所需的加热和冷却处理全部使用ASTECProgramTemp Control System PC-815进行。对得到的总RNA和无RNase H2O以总RNA浓度为100ng/12μL的方式进行制备，在65℃进行5分钟热变性处理，迅速在冰上冷却。然后，为了消化来自基因组的DNA，在各管中加入4μL将4×DN Master Mix和gDNA去除剂按50:1混合而得的试剂，在37℃加热5分钟，迅速在冰上冷却。然后在各管中添加4μL 5×RT Master MixII，在37℃加热15分钟、在50℃加热15分钟进行逆转录反应后，在98℃加热5分钟，从而进行酶失活反应，合成cDNA。得到的cDNA加入80μL灭菌水稀释5倍，在使用之前保存于-30℃。
4)实时PCR
选择ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1X作为用于评价子宫外组织的妊娠应答性的目标基因，选择H2AFZ作为内参基因。参照数据库(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公开的各基因的碱基序列，以得到包含外显子-内含子边界区域的150bp左右的扩增产物的方式设计、合成正向引物和反向引物(表2)。
[表2]
PCR反应液是，添加THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(TOYOBO)5μL、上述正向引物和反向引物各0.5μL、作为模板的前述cDNA溶液4μL，制成10μL。使用LightCyclerNano(RocheDiagnostics)进行实时PCR，95℃30秒进行1个循环，95℃10秒、55℃15秒、72℃30秒进行45个循环，60℃20秒、95℃20秒分别进行1个循环。将子宫颈管中ISG15、Mx1、Mx2和OAS-1X的相对基因表达量示于图1，将外子宫口周边部中ISG15、Mx1和Mx2的相对基因表达量示于图2。
确认到，与非妊娠牛的子宫颈管和外子宫口周边部粘膜中各基因的表达量相比，确定妊娠的牛的子宫颈管粘膜中ISG15的表达量增强122倍、Mx1增强31倍、Mx2增强66倍、并且OAS-1X增强7倍，此外，外子宫口周边部粘膜中ISG15的表达量增强14倍、Mx1增强10倍、并且Mx2增强12倍。由此，在确定妊娠的牛的人工授精操作后第18天的子宫颈管和外子宫口周边部的粘膜中，确认到IFN-τ的增敏作用。
实施例2.妊娠牛和非妊娠牛的子宫外组织(子宫颈管、外子宫口周边部和阴道前
庭)中干扰素诱导性因子的表达分析
使用棉签代替量匙作为采集器具，除了这一点以外，与实施例1同样地操作，分别从妊娠牛的子宫颈管、外子宫口周边部和阴道前庭、并从非妊娠牛的子宫颈管采集粘膜。将采集后的棉签浸渍于分装有500μL ISOGEN II(Nippon Gene)并且进行了冰冷却的1.5mL管中，回收粘膜中的细胞，与实施例1同样地操作，进行总RNA的提取、通过逆转录反应进行的cDNA合成和实时PCR。
将ISG15的相对基因表达量的结果示于图3。妊娠时的子宫颈管、外子宫口周边部(阴道深部)、阴部(阴道前庭)的粘膜中均观察到ISG15的表达。基因表达量随离子宫的距离增加而减少，但与非妊娠牛的子宫颈管粘膜中的表达量相比，确认到20-150倍以上的表达增强。
实施例3.利用定量RTLAMP法进行的妊娠牛和非妊娠牛的子宫外组织(子宫颈管)
中干扰素诱导性因子的表达分析
对于通过与实施例1的1)和2)同样的方法采集和制备的来自妊娠牛和非妊娠牛的子宫颈管粘膜的RNA样品，分别将总RNA量调至100ng后进行DNase处理，将混入的DNA消化。使用经DNase处理的来自妊娠牛和非妊娠牛子宫颈管粘膜的RNA样品各100ng、未经DNase处理的来自妊娠牛和非妊娠牛子宫颈管粘膜的RNA样品各100ng、以及未经DNase处理的来自非妊娠牛子宫颈管粘膜的RNA样品1000ng，直接进行RTLAMP反应。
反应条件如下。每次反应加入灭菌蒸馏水2.9μl、反应溶液12.5μl、酶溶液1μl、以扩增ISG15的方式设计的LAMP引物FIP(序列号13)40pmol(0.8μl)、BIP(序列号14)40pmol(0.8μl)、F3(序列号11)5pmol(1μl)、B3(序列号12)5pmol(1μl)，加入5μl样品RNA溶液，最终制成25μl，在65℃反应30分钟以上，通过经时吸光度，测量因目标基因的扩增造成的反应物的浊度。
将结果示于图4和图5。即使在以RNA为模板的情况下也能够进行ISG15表达量的测定。根据反应开始后30分钟时的浊度的比较，妊娠牛的子宫颈管粘膜中的ISG15表达量高达非妊娠牛的子宫颈管粘膜中的ISG15表达量的大约4倍。此外，DNase处理的有无对于定量结果没有大的影响，此外，使总RNA量增至10倍的情况下，浊度的演变也未确认到大的变化，因而确认到即使在混合存在有基因组DNA的情况下也能够进行妊娠的判断。
Claims (14)
1.一种判断反刍动物的妊娠的方法，包括：使用从处于相当于妊娠初期时期的待测反刍动物的子宫颈管至阴门的生殖器采集的含有粘膜上皮细胞的试样，测定该粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的测定工序；以及通过将该表达量与未妊娠的同种反刍动物的相应的粘膜上皮细胞中所述分子的表达量进行比较来判断待测反刍动物的妊娠的判断工序。
2.根据权利要求1所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样是从阴道至阴门的生殖器采集。
3.根据权利要求1或2所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样是从生殖器的表面低侵入性或非侵入性地采集。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，含有粘膜上皮细胞的试样实质上不含血液。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因组成的组的至少1种基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由ISG15、OAS-1X、Mx1和Mx2基因组成的组的至少1个基因转录的mRNA。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量通过定量PCR法或LAMP即环介导等温扩增法测定。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量是在不进行来自粘膜上皮细胞的RNA的分离纯化处理的情况下测定。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，反刍动物选自由家牛、绵羊、山羊、水牛、牦牛和鹿组成的组。
10.一种用于判断反刍动物的妊娠的试剂盒，包括用于测定待测反刍动物的粘膜上皮细胞中应答IFN-τ而被诱导的分子的表达量的试剂，以及用于采集含有所述细胞的试样的器具。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由LOC100139670、ISG15、OAS-1X、OAS-1Y、OAS-1Z、OAS-2、UBA7、USP18、Mx1、Mx2、RSAD2、GBP4、GBP5、TNFSF10、STAT1、STAT2和PLAC8基因组成的组的至少1种基因转录的mRNA或该基因编码的蛋白。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为从选自由ISG15、OAS-1X、Mx1和Mx2基因组成的组的至少1个基因转录的mRNA。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的试剂盒，应答IFN-τ而被诱导的分子为mRNA，用于测定所述分子的表达量的试剂为用于核酸扩增法的试剂。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的试剂盒，用于采集含有所述细胞的试样的器具为用于低侵入性或非侵入性地采集试样的器具。
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