JP2022518223A - 不妊治療成功の予測のための子宮内膜液 - Google Patents

不妊治療成功の予測のための子宮内膜液 Download PDF

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Abstract

本明細書には、体外受精、凍結胚移植、および子宮腔内授精などの補助生殖技術の成功率を改善するための方法、システム、およびキットが提供されている。これらの方法、システム、およびキットは、本明細書で決定された、子宮毒性および胚着床不全と関連しているタンパク質、代謝物、およびｍｉｃｒｏＲＮＡマーカーのレベルに依存する。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、不良な妊娠転帰を予測する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ １１９ （ｅ）に基づき、２０１９年１月２５日に出願された「Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｆｌｕｉｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｃｃｅｓｓ ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」と題する米国仮特許出願第６２／７９６，６９５号明細書、および２０１９年４月３０日に出願された「Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ Ｆｌｕｉｄ ｆｏｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｃｃｅｓｓ ｉｎ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」と題する米国仮特許出願第６２／８４１，００８号明細書に対して優先権を主張し、そのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。適切な範囲で、上記開示出願のそれぞれに対して優先権の主張がなされる。
本発明は、不妊治療の分野に関する。より具体的には、例えば、受精卵を患者の子宮へと着床させた時、妊娠成功率を高めるために子宮の微小環境の評価が使用される。加えて、子宮の微小環境の操作は、自然サイクルおよび人工サイクルの両方で妊娠の可能性を改善する。
ＩＶＦ妊娠率の漸進的な改善にもかかわらず、移植されたヒト胚の大多数は、着床不全という結果をもたらす。例えば、（米国の不妊治療クリニックの約８０％が報告を行う）生殖補助医療学会は、２０１５年のＩＶＦの成功率（患者自身の卵子を使用して生児出生した患者の％）は、３５歳未満の女性では５６．７％、３５～３７歳の女性では４４．４％、３８～４０歳の女性では３０．７％、４１～４２歳の女性では１５．１％、４２歳を超える女性では４．５％と報告している。ドナーの卵子を使用しない場合、明らかに、母体年齢の増加と共に着床成功率は減少する。母体の年齢の進行に関連する胚染色体の異数性、およびホルモン調節に対する子宮内膜反応の障害などの母体因子を含む、様々な因子が着床不全に関連付けられる。
低い着床成功率を克服するために、典型的に、様々なアプローチが講じられる。過去には、また一部のクリニックでは依然として、着床の可能性を改善するために、複数の胚を一回のＩＶＦ手技の間に移植することを実践している。移植のための胚を選択するプロセスには、多くの場合、卵母細胞および胚の質を判定するために、個々の研究室で開発された等級付け方法が関与する。胚の数および質が関与する恣意的な胚スコアは、移植後の妊娠成功の確率を明らかにする場合がある。例えば、胎生学者は、細胞数、細胞質の清澄さ、成長の均等さ、および断片化の程度を含む形態学的質を使用して胚を等級付けする場合がある。多くの場合、これらの一般的な質に対して選択されたいくつかの胚が、妊娠の可能性を改善するために着床される。しかしながら、形態学的質に基づく胚選択は正確ではない。例えば、形態学的評価では、染色体の完全性および胚代謝という胚の生存能力に関する二つの因子の評価に失敗する。胚の形態学的スクリーニングを行うクリニックでは、移植する胚の数は、利用可能な生存胚の数、女性の年齢、およびその他の健康および診断因子に依存する。
しかしながら、複数の胚の移植は、多くの場合ＩＶＦの主要な合併症である多胎妊娠をもたらす。一般的に、多胎妊娠、特に三つ子以上の妊娠は、母体および胎児に対してリスクがある。例えば、多胎出産は、妊娠損失、新生児の病的状態、分娩合併症、および長期損傷の可能性がある早産のリスクの増加と関連付けられる。品胎以上（例えば、三つ子以上）の多胎妊娠のリスクを低減するために、一部の国は移植胚の数に厳格な制限を実施しており、また米国生殖医学会は、移植する胚の数について独自のガイドラインを定めている。しかしながら、これらの制限は、広く順守されている、または受け入れられているわけではない。
胚および患者の両方が同時に胚移植の準備が整うように、胚の準備と並行して、女性患者のホルモン操作によって胚（複数可）の受け入れのために子宮の環境が準備される。ホルモン操作には、典型的な月１回のサイクルの終わりに近い正常な女性におけるエストロゲンおよびプロゲステロンの循環血中レベルを模倣または超えるために必要なレベルで、エストロゲンおよびプロゲステロンを投与することを伴う。
商業的な子宮内膜着床能検査が、不妊症患者に対して胚移植の３０～９０日前に試験するように提供されているが、結果は、必ずしも胚移植時の子宮の環境を示すものではない。子宮内膜の厚さが、凍結胚移植直前に超音波で測定され、そして血中生殖ホルモンがモニターされるが、現在のところ、現在のサイクルで女性の子宮が受け入れ可能になるかどうかを検査する方法はない。不妊治療の成功率を改善し、かつ子宮内膜性不妊症の女性を支援するために、患者の受け入れ可能な子宮内膜を特定する方法が必要である。
本明細書には、不妊治療の成功率の改善と関連付けられたデータを取得、使用、および／または分析するための方法、システム、およびキットが提供されている。一部の態様では、データは、現在の治療サイクル、すなわち、予定された手技の数か月前のサイクルではなく、予定された胚移植または子宮腔内授精と一致するサイクルに対して、患者の子宮の微小環境を非侵襲的にサンプリングすることによって取得される。
このように、本明細書では、不妊治療の不良な妊娠転帰を予測する方法が提供されている。一部の実施形態では、方法は、（ａ）患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、（ｂ）適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物セクレトームプロファイルを決定することとを含む。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、不良な妊娠転帰を予測する。
本明細書では、タンパク質、代謝物、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーまたは少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットが提供されている。キットは、免疫吸着アッセイ、アッセイの実施方法についての使用説明書、アッセイから取得されたデータを分類するためのモデル、および／または成功した妊娠転帰と関連付けられた子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを含むことができる。
また本明細書には、不妊治療の妊娠成功率を向上させるためのシステムも提供されている。一部の実施形態では、システムは、凍結胚移植または子宮腔内授精の前に、不妊治療を受けている患者の不良な妊娠転帰を予測する工程を含む。予測する工程は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、患者の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することを含む。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰と関連付けられた子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、患者の不良な妊娠転帰を予測する。
一部の態様では、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定する工程は、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することとを含む。
本明細書には、凍結胚移植または子宮腔内授精の前に、不妊患者をスクリーニングするインビトロ方法が提供されている。一部の実施形態では、方法は、（ａ）患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、（ｂ）適さない子宮内膜の環境関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物セクレトームプロファイルを決定することとを含む。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、不良な妊娠転帰を予測する。
一部の実施形態では、候補胚の着床不全を予測する方法が提供されている。方法は、（ａ）患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、（ｂ）適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物セクレトームプロファイルを決定することとを含む。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、胚の着床不全を予測する。
一部の態様では、マーカーはタンパク質である。一部の実施形態では、タンパク質は、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択され、タンパク質の発現の増加は適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択され、タンパク質の発現の減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の実施形態では、マーカーはアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーはｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択され、存在の減少は適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択され、存在の増加は適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーは代謝物である。一部の実施形態では、代謝物は、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、プトレシン、プロリン、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択され、代謝物の存在の減少は適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。一部の実施形態では、代謝物は、尿酸塩、クエン酸塩、オルトリン酸塩、およびヘプタン酸からなる群から選択され、代謝物の存在の増加は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
さらに他の態様では、患者の子宮の微小環境が観察され、胚移植の２４時間前に不良な着床転帰が評価される。移植失敗を経験することが予測される子宮の微小環境からの吸引液において、いくつかの生物学的プロセスの相互作用が明白である可能性があり、特に、１３個の転写物の減少、７個の母体のｍｉＲＮＡの増加、１２個のアミノ酸の減少、および１６個のタンパク質の存在量の変化が明白である可能性がある。一部の態様では、エイコサノイド経路を調節し、それによってＰＧＥ２のようなプロスタグランジンの下流合成に影響を与えるＰＬＡ２Ｇ４Ｄの発現の減少は、移植の失敗を予測する可能性がある。一部の態様では、ＤＮＡメチル化に必要なエピジェネティック調節因子であるＴＥＴ１の発現の減少は、移植失敗を予測する可能性がある。一部の態様では、着床成功に必要とされるＶＥＧＦＡの既知の負の調節因子であるｍｉＲ－１７のレベルの増加は、移植失敗を予測する可能性がある。一部の態様では、胚盤胞の活性化および栄養外胚葉の運動性に必須であるアルギニンの量の減少は、移植失敗を予測する可能性がある。最後に、炎症と関連付けられたタンパク質であり、補体活性化を調節する、ＳＥＲＰＩＮＧ１の存在量の増加は、移植失敗を予測する可能性がある。
一実施形態では、不妊患者の妊娠成功率を高めるためのシステムが提供されている。システムは、子宮毒性に関係があるとされるマーカーを定量化することによって、セクレトームプロファイルとして子宮内膜のセクレトームデータを収集するように構成された電子システムを含む。モデルが、このセクレトームプロファイルに基づいて、胚の着床または子宮腔内授精の実施の推奨における使用のために提供されている。セクレトームデータは、例えば、質量分析、ｑＰＣＲ、またはＥＬＩＳＡ測定の使用によって取得されてもよい。
システムの一態様によれば、子宮のセクレトームプロファイルは、着床成功の可能性の変化と関連している場合がある子宮内膜分泌物中のマーカー、例えば、マイクロＲＮＡ、代謝物、およびタンパク質を特定することによって提供されてもよい。
一実施形態では、不妊治療の方法は、子宮毒性に関係があるとされるマーカーを測定することによってプロファイルが作成される場合、不妊患者の子宮内膜のセクレトームプロファイルを決定することを必然的に伴う。これは、これらのマーカーのうちの一つ以上を、胚着床の成功または失敗の可能性の変化と関連付けるモデルに提出されてもよいデータを提供する。次に、胚の着床または子宮腔内授精に対する推奨が、モデリングの転帰に基づいて提供されてもよい。胚は、推奨に基づいて条件付きで移植されてもよい。
一実施形態では、試料中のタンパク質含有量の定量化のために複数のマイクロウェルを有する、改善されたＥＬＩＳＡキットがある。マイクロウェルは、子宮毒性に関係があるとされる複数のタンパク質について定量化するように構築され、かつ配置されている。
図１は、それらの代謝物プロファイルに関して、良好な子宮の試料と不良な子宮の試料を分離するＰＣＡプロットを示す。 図２は、異なるように発現した代謝物を特定する。 図３は、それぞれの異なるように発現した個別の代謝物の箱ひげ図を提供している。 図４は、それぞれの異なるように発現した個別の代謝物の箱ひげ図を提供している。 図５は、それぞれの異なるように発現した個別の代謝物の箱ひげ図を提供している。 図６は、異なるように発現した（分析された３０個のうちの）３個のサイトカインを示す。
以下の定義は、本明細書で使用される特定の用語の理解を容易にするために提供されており、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
「不良な妊娠転帰」という語句は、女性の子宮内に胚を着床させられなかったこと、または胚の生命を維持するのに十分なほど胚を着床させられなかったことを指す。この語句は、「着床不全」という語句と同じ意味で使用することができる。
「着床不全」は、そうでなければ好ましい胚を着床させられなかった時に起こり、そうでなければ好ましい胚が数回のＩＶＦ治療試行後に着床させられなかった時は、反復着床不全と指定される場合がある。
「適さない子宮内膜の環境」という語句は、胚の着床を損なう子宮内の環境を指す。具体的には、胚が着床する子宮内膜の微小環境が、着床する胚のための適切な支持システムを欠いている可能性があり、その結果、胚の着床が最終的に失敗し、結果として不良な妊娠転帰をもたらす。子宮の適さない子宮内膜の環境は、例えば、自己免疫の結果としての炎症、または外部からの炎症入力に関連する可能性があり、または酸化ストレス、もしくは酸化ストレスに対処する身体の能力の欠如に関連する可能性もある。
排卵後６～１０日目に自然に発生する着床の好機は、子宮内膜着床能の期間である。これは短く、子宮内膜上のエストロゲンおよびプロゲステロンのプログラムされた配列の結果である。これは、胚と子宮内膜とが互いに出会い、初めて分子の対話を交わす重要な時点である。子宮内膜の構造内では、胚盤胞の接着、ならびに周囲の微小環境におけるシグナル伝達経路の厳密な制御を可能にするために、接着において特定の特性変化が起こる必要がある。胚と受け入れ可能な子宮内膜との間の分子交換の成功は、着床の初期段階の間に発生する必要がある。着床は、子宮内膜層、および多数のビタミンおよびステロイド依存性タンパク質を含む栄養素の分泌の構造的および機能的変化によって特徴付けられる。この分子交換がなければ、受け入れ可能な子宮への胚盤胞の接着は失敗することになる。
移植カテーテルを使用した胚移植時の子宮内膜の吸引は、子宮の局所区域における子宮内膜の微小環境をサンプリングするための効果的で低侵襲性の手段である。胚移植の２４時間前に採取された子宮内膜の吸引液は、着床の成功と相関した特定のプロスタグランジンレベルを含んでおり、また吸引液の採取自体は妊娠転帰に悪影響を及ぼさなかった（Ｖｉｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ，２０１３）。着床の好機に関する洞察を提供する他の商業的に利用可能な技術は、子宮内膜生検からの組織に依存する。しかしながら、これらの試料は、現在のサイクルの分子状態を表していない場合がある以前のサイクルから取得される。
本明細書には、移植された胚が遭遇することになる微小環境を垣間見るまれな機会を可能にする方法、キット、およびシステムが提供されている。このサンプリング技法により、胚盤胞着床を成功させるために追加的な医学的介入を必要とする場合がある患者の病因の特定が可能となる。
ＡＲＴで治療することがより困難な患者集団のうちの一つは、反復着床不全を呈する患者である。反復着床不全は、女性が、正倍数体胚での胚移植試行に３回以上失敗した場合と定義される。免疫因子および子宮内膜機能障害などの母体因子に加えて、遺伝的異常を含む胚因子を含む、着床不全に寄与する場合がある数多くの既知の因子がある。
しかしながら、既知の母体因子に対してすでにスクリーニングされ、かつ適切に処置された正倍数体胚を有する患者集団では、子宮内膜機能障害の明確な原因がないサブセットが依然として存在する。これらの患者については、その子宮内膜の微小環境に影響を及ぼす分子因子が、所与のサイクルにおける胚移植の成功または失敗を予測する。子宮内膜吸引は、ＯＭＩＣＳ技術と組み合わせた場合、着床の好機の間の受け入れ可能な状態に関する洞察を提供し、また不妊症に潜在的に関与する因子の特定を可能にする。
胚盤胞着床の理想的な環境を発現するには、免疫系と内分泌系の間の相互作用が必要であると考えられる。受け入れ可能な子宮内膜は、胚盤胞の侵入および胎盤の急速な成長を可能にする一方で、子宮細胞の脱落膜細胞への形質転換を支持する。これは、子宮内に既に存在する免疫細胞、それらの免疫細胞によって分泌されるサイトカイン、およびホルモン変化によって促進することができる。
最も集中的に研究されている子宮の微小環境の態様は、子宮免疫細胞：母体ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、子宮ナチュラルキラー細胞（ｕＮＫ細胞）、子宮樹状細胞（ｕＤＣ）、子宮マスト細胞（ｕＭＣ）、および子宮マクロファージである。しかしながら、胚盤胞の着床の成功に寄与する子宮の微小環境の残りの部分については、ほとんど知られていない。
本明細書には、例えば、胚移植もしくは子宮腔内授精、または排卵の調節もしくは排卵の誘発を含む不妊治療における妊娠成功率を向上させるための方法、システム、およびキットが提供されている。また本明細書には、（ａ）患者の子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルを確認することと、（ｂ）成功した妊娠転帰を示すｍｉＲ－１７プロファイルと比較して、子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルが増加している患者を、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａで治療することと、（ｃ）凍結胚移植または子宮腔内授精を実施することと、を含む、女性の不妊症を治療する方法も提供されている。一部の態様では、（ａ）は、（ｃ）の少なくとも２４時間前に実施される。子宮のマーカーが確認され、減少している場合、タンパク質、アミノ酸などを、着床に適切な子宮内膜の環境を提供するためにレベルを増加させるのに十分な量で患者に投与することができる、治療の追加的な方法が企図されている。
一部の実施形態では、不妊治療の不良な妊娠転帰を予測する方法が提供されている。この方法の適用により、医療従事者は、凍結胚移植または子宮腔内授精を行う前に、不妊患者の受け入れ可能ではない子宮を特定することができる。一部の態様では、方法は、（ａ）患者の子宮内膜分泌物を、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、（ｂ）適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物セクレトームプロファイルを決定することとを含む。患者の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルは、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較して、毒性の子宮の環境を示すことができる。患者の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルは、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較して、着床の成功または不良な妊娠転帰を予測することができる。
適さない子宮内膜の環境に関連する炎症マーカーには、炎症促進性／抗炎症性メディエーター、補体調節因子、および／または走化性に関与するタンパク質が含まれる。一部の態様では、子宮内膜分泌物は、増加したレベルのＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＨＦ、および／またはＣＰのうちのいずれか一つ以上を含有してもよい。
適さない子宮内膜の環境に関連する酸化ストレスのマーカーには、酸化促進効果／抗酸化効果、抗酸化物質の喪失、および活性酸素種に対処する身体の能力の喪失が含まれる。一部の態様では、子宮内膜分泌物は、増加したレベルのＧＧＴ１、ＬＴＦ、またはＣＦＨのうちのいずれか一つ以上を含有する場合がある。一部の態様では、子宮内膜分泌物は、減少したレベルのＳＯＤ１および／またはＰＲＤＸ６を含有する場合がある。
適さない子宮内膜の環境に関連した着床に関与するマーカーには、ＴＦＦＢ隔離、栄養膜細胞浸潤、ＥＣＭリモデリング、および子宮の受け入れ可能性が含まれる。一部の態様では、子宮内膜分泌物は、増加したレベルのＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、ＩＴＩＨ４、およびＰＬＧのうちのいずれか一つ以上を含有する場合がある。一部の態様では、子宮内膜分泌物は、減少したレベルのＳＯＤ１および／またはＰＲＤＸ６を含有する場合がある。
一部の態様では、患者の子宮内膜分泌物は、移植のために胚を解凍する前に取得される。例えば、子宮内膜分泌物を、予定された移植の４８時間以内、または予定された移植の３６時間以内、または予定された移植の２４時間以内、または予定された移植の１８時間以内、または予定された移植の１２時間以内に取得することができる。典型的には、胚は胚移植の１時間前に解凍され、またセクレトームプロファイルのデータは、解凍前の任意の時間に取得することができる。子宮内膜分泌物の試料は、非侵襲的に取得され、すなわち、生検は不要である。一部の態様では、試料はカテーテルによって取得される。
胚の解凍前に患者の子宮の微小環境の健康を確認することによって、胚移植手技を後のサイクルに延期する決定をすることができる。これにより、胚を解凍サイクルから保全し、生存胚を後で移植するために保存し、本明細書に提供される方法およびシステムに利益をもたらす。このプロセスの別の利益は、患者の子宮の微小環境が、予定された移植の数か月前のサイクルではなく、現在のサイクルについて評価されることである。これは、不妊患者の子宮内膜の状態はサイクルごとに変化する可能性があるため、重要である。
不良な妊娠転帰と関連付けられた様々なマーカーが本明細書に提供されている。一部の態様では、マーカーは、サイトカイン、例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦである。一部の態様では、マーカーは、ムチンタンパク質、例えば、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、またはムチン５ＡＣである。一部の態様では、マーカーは、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、またはシスタチン－Ｃ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択される。各事例において、タンパク質の発現の増加は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーは、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、タンパク質の発現の減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーはアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーは、ホスホリパーゼＡ２酵素ファミリーのメンバーであるＰＬＡ２Ｇ４Ｄである。このタンパク質は、ｓｎ－２位置でグリセロリン脂質の加水分解を触媒し、遊離脂肪酸およびリゾリン脂質を遊離させる。ＰＬＡ２Ｇ４Ｄは、エイコサノイド経路を調節し、Ｗｎｔシグナル伝達活性化を担当するプロスタグランジンの下流合成に影響を与える。ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ発現の減少は、適さない子宮内膜の環境を示す。
一部の態様では、マーカーはＴＥＴ１である。ＴＥＴ１は、細胞分化を定義する多数の遺伝子を調節する。エピブラスト細胞では、ＴＥＴ１は、ヒドロキシメチル化によって遺伝子プロモーターを脱メチル化し、かつテロメア安定性を維持する。ＴＥＴ１発現の減少は、子宮内膜の腫瘍の進行とも相関している。ＴＥＴ１発現の減少は、適さない子宮内膜の環境を示す。
ＭｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、短い非コード調節ＲＮＡであり、タンパク質発現の調節において不可欠な構成要素である。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、子宮内膜と胚とのクロストークに寄与し、着床の成功に不可欠である。一部の態様では、マーカーは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、またはｈｓａ－ｍｉＲ－３６５である。ｍｉｃｒｏＲＮＡの存在の減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。他の態様では、ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、またはｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃである。マーカーの存在の増加は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
ｍｉＲ－１７／９２クラスターは、数千個の遺伝子を集合的に標的とし、また成体生物体および発生中の胚の両方の多数の細胞プロセスに関与する。ｈａｓ－ｍｉＲ－１７－５ｐ遺伝子の標的遺伝子は、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、および細胞恒常性を含む、多くの細胞プロセスに関与する。ｍｉＲ－１７はＶＥＧＦＡを阻害し、細胞増殖、遊走、および接着の減少を引き起こす。組換えＶＥＧＦ－Ａは、子宮内膜の上皮細胞接着を有意に増加させる。ＶＥＧＦ－Ａタンパク質は、内皮細胞に特異的に作用し、また血管透過性の媒介、血管新生、細胞増殖、細胞遊走、およびアポトーシスの阻害を含む様々な効果を有する。一部の態様では、ｍｉＲ－１７の２倍を超える増加は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
一部の態様では、マーカーはアミノ酸、例えばアルギニンである。アルギニンは、着床前後の期間中の受胎産物の生存、成長、および発達に必要である。胚では、アルギニンは細胞増殖のために重要である。過大な炎症反応および血管機能障害に関与するアルギニン発現の変化は、子宮内膜着床能の低下および反復性自然流産に関連付けられる。子宮の環境におけるアルギニンの減少は、運動性の欠如のため着床に影響を与える場合がある。また、アルギニン発現の変化は、反復性自然流産を経験する女性の子宮内膜着床能の低下に関連付けられた過大な炎症反応および血管機能障害の機序にも関与する場合がある（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
興味深いことに、子宮の環境内のアルギニンの減少は、接着の欠如ではなく、むしろ運動性の欠如のため、着床にさらに影響を与える場合があり（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１２）、適切な着床部位に胚盤胞が着床するのを防ぐ。
一部の態様では、マーカーは、代謝物、例えば、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンである。マーカーの存在の減少は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられる。
本明細書に提供される方法、システム、およびキットに従い、マーカーは単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、方法、システム、またはキットは、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチン－Ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、ｈｓａ－ｍｉＲ－３６５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、またはｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃ、アルギニン、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンのうちのいずれか一つ以上を、子宮のセクレトームプロファイルの生成において利用してもよいことが本明細書で企図されている。
一部の実施形態では、適さない子宮内膜の環境に関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットが提供されている。マーカーは、タンパク質、代謝物、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択することができる。一部の態様では、キットは、免疫吸着アッセイ、ｑＰＣＲアッセイ、アッセイの実施方法についての使用説明書、アッセイから取得されたデータを分類するためのモデル、および／または成功した妊娠転帰と関連付けられた子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを含む。
一部の実施形態では、不妊治療の妊娠成功率を向上させるためのシステムが提供されている。一部の態様では、システムは、凍結胚移植または子宮腔内授精の前に、不妊治療を受けている患者の不良な妊娠転帰を予測することを含む。予測する工程は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、患者の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することを含むことができる。成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較して、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の増加または減少は、患者の不良な妊娠転帰を予測する。
一部の態様では、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定する工程は、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することとを含む。
セクレトームプロファイルは、タンパク質、代謝物、またはｍｉｃｒｏＲＮＡを特定するために当業者に公知の任意の方法から取得されたデータによって生成することができる。例えば、データは、質量分析法、免疫吸着アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ））、またはｑＰＣＲによって取得することができる。
凍結胚移植または子宮腔内授精の前に、不妊患者をスクリーニングするインビトロ方法も本明細書に提供されている。一部の態様では、方法は、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることを含む。方法は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することをさらに含む。成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較して、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の増加または減少は、不妊患者の不良な妊娠転帰を予測する。不良な妊娠転帰の予測により、介護者は、凍結胚移植手技または子宮腔内授精を見合わせることを勧めることができる。その特定の患者の適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカー（複数可）に対処する治療を含む、適さない子宮内膜の環境を減少させるための措置を取ることができる。例えば、患者の子宮内膜分泌物のＶＥＧＦタンパク質発現が、成功した妊娠転帰を示すＶＥＧＦ発現プロファイルと比較して減少している場合、患者は組換えＶＥＧＦ－Ａで治療されてもよい。同様に、患者の子宮内膜分泌物のｍｉＲ－１７レベルが、成功した妊娠転帰を示すｍｉＲ－１７レベルと比較して、増加している場合、患者は、組換えＶＥＧＦ－Ａで治療されてもよい。
本明細書には、女性の不妊症を治療する方法が提供されている。一部の態様では、方法は、（ａ）患者の子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルを確認することと、（ｂ）成功した妊娠転帰を示すｍｉＲ－１７プロファイルと比較して、子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルが増加している患者を組換えヒトＶＥＧＦ－Ａで治療することと、（ｃ）凍結胚移植または子宮腔内授精を実施することと、を含む。一部の態様では、工程（ａ）は、工程（ｃ）の少なくとも２４時間前に実施される。
候補胚の着床不全を予測する方法が本明細書に提供されている。一部の実施形態では、方法は、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることを含む。方法は、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することをさらに含む。適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した増加または減少は、胚の着床不全を予測する。
実施例１：凍結胚移植の２４時間前の母体の子宮内膜分泌物は、着床の転帰を予測する
目的：着床の成功は、能力のある胚と受け入れ可能な子宮内膜との間の複雑な対話に依存する可能性がある。母体側では、胚盤胞の接着のためには特定の生物学的変化が接着について起こる必要があるが、侵入する胚にはシグナル伝達経路の厳密な制御が重要である。この研究の目的は、正倍数体胚移植の２４時間前および正倍数体胚移植時の着床の転帰に関連付けられた、子宮の流体環境を調べることであった。
材料および方法：正倍数体胚盤胞を用いたエストラジオール／プロゲステロン補充凍結胚移植（ＦＥＴ）の前に、ＩＲＢの同意を得て、不妊症患者（ｎ＝４８）を採用した。子宮の分泌物は、ＦＥＴの２４時間前、またはＦＥＴ時点のいずれかで、穏やかな吸引で採取された（約２～５ｕｌ）。簡潔に述べると、典型的には、胚移植の前に実施される模擬移植プロトコルを使用して、子宮頸部粘液汚染を避けるために保護鞘で覆われた空の胚移植カテーテルの先端を、胚移植を引き起こすことになる部位の近くに位置させた。潜在的な着床部位を乱さないように、部位からわずかに引き離した後、少量の子宮の粘液を１０ｍＬルアーロックシリンジに吸引した（約５～１０ｕｌの子宮粘液）。その後、依然として子宮頸部粘液汚染を回避するように注意しながら、カテーテルを抜いた。吸引液を含有するカテーテルの先端を、２ｍＬドルフィンノーズマイクロチューブに挿入し、滅菌はさみを使用して、先端をチューブの中に切り落とし、液体窒素中で急速凍結した。試料は、さらなる分析まで－８０℃で保存した。
子宮のセクレトーム分析は、ｍｉＲＮＡ分析用にｑＰＣＲ（ｎ＝１２）、ならびに代謝物分析（ＵＨＰＬＳ－ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）およびタンパク質分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）用に質量分析法（ｎ＝３６）を使用し、着床の転帰を盲検化して実施した。ｍｉＲＮＡプロファイルは、ＲＥＳＴ（著作権）統計ソフトウェアによって分析した。ＭＳデータをＭａｓｓＭａｔｒｉｘで変換し、Ｍａｖｅｎ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖ）で処理した。ＭＳ／ＭＳデータを、Ｍａｓｃｏｔ（商標）（ｖ２．２）およびＳｃａｆｆｏｌｄ（ｖ２．０６）を使用して調べた。標的遺伝子の検証は、患者の同意を得て提供された子宮内膜の生検（ｎ＝１４）および過剰凍結保存胚盤胞（ｎ＝１４）についてｑＰＣＲを使用して実施された。
結果：ｍｉＲＮＡ、代謝物、およびタンパク質の顕著な子宮のセクレトームプロファイルが、胚移植の２４時間前および胚移植時の両方で、不良かつ有毒な環境と有意に関連付けられた（Ｐ＜０．０５、＞２倍の変化）。
具体的には、いくつかの母体のｍｉＲＮＡが、不良な着床で発現の減少を示し、またｍｉＲ－１７を含むいくつかのｍｉＲＮＡは、不良な着床で発現の増加を示した（Ｐ＜０．０５）。表１および表２を参照されたい。負の調節を介したｍｉＲ－１７の公知の標的遺伝子は、ＶＥＧＦＡであり、これは着床に必須なシグナルタンパク質であり、移植胚だけでなく、受け入れる子宮内膜によっても分泌される。ＶＥＧＦＡ発現の検証を、上皮子宮内膜細胞および個々の胚盤胞で確認した。
Figure 2022518223000002
Figure 2022518223000003
合計１７個の代謝物が、不良な着床に関連付けられた子宮のセクレトームにおいて有意な減少を示し（Ｐ＜０．０５、＞２倍の変化）、これには、胚盤胞の活性化および栄養外胚葉の運動性に不可欠であるアルギニン、ならびに尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンが含まれる。図１～図５を参照されたい。
試験した３０個のうち３個のサイトカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６およびＩＬ－８は、不良な着床と関連付けられた。図６を参照されたい。サイトカインはＥＬＩＳＡによって同定した。
合計４６９個のタンパク質をＬＣ－ＭＳ／ＭＳでスクリーニングした。７つのタンパク質は、不良な妊娠転帰と関連付けられた発現が増加していた（Ｐ＜０．０５）：ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、およびシステイン－Ｃ。ムチンは子宮内膜の機能に相当な効果を有するグリコシル化上皮細胞表面タンパク質であり、着床の障壁を作り出す。ムチンタンパク質の過剰発現は、受け入れ可能ではない子宮の表面の維持に関連付けられた。
結論：異常な母体の子宮ｍｉＲＮＡおよび分子分泌物は、ＦＥＴの２４時間前、およびＦＥＴ時点の両方で、着床不全の特徴付けを可能にする。この損なわれた胚・子宮内膜間の対話は、主要なシグナル伝達分子の転写レベルにさらに影響を与え、結果として、着床成功の有意な低下をもたらす。胚移植に先立って母体の分子微小環境を予測することで、患者の手技を微調整することができ、それによって着床の転帰が改善される。
実施例２：胚移植の２４時間前の低侵襲性子宮吸引が、損なわれたＲＩＦ子宮の微小環境を特徴付け、生殖の転帰を予測する
目的：反復着床不全（ＲＩＦ）は、特に治療が難しく、子宮内膜の適切な準備が確立され、かつ高いグレードの正倍数体胚盤胞を用いて移植が実施される場合であっても、成功は限られている。この研究の目的は、胚移植に先立って、母体の分子成分の調査を通して、ＲＩＦの複雑さを解読するための学際的アプローチを利用することであった。
材料および方法：正倍数体胚盤胞を用いた予定された凍結胚移植（ＦＥＴ）の２４時間前に、ＩＲＢの同意を得て、患者を採用した。子宮の分泌物を、超音波誘導下、穏やかな吸引で採取し（約２～５μｌ）、生殖結果：失敗した正倍数体ＦＥＴ（ＲＩＦ患者、以前にＩＶＦに３回以上失敗）および良好な生児出生ＦＥＴ（母親の年齢が適合した患者、平均３６．６±３．８歳）に従ってグループ分けした。ＮｏｖａＳＥＱ ６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定するために、全ＲＮＡおよび小さいＲＮＡ（ｎ＝２２）を単離した。ＧＳＮＡＰを使用してリードをｈｇ３８に整列させ、ｅｄｇｅＲを用いて分析した（ＦＤＲカットオフ５％、Ｐ＜０．０１）。代謝物分析（ｎ＝２０）を、ＭａｓｓＭａｔｒｉｘおよびＭａｖｅｎ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｕｎｉｖ．）を使用して、ＵＨＰＬＳ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）によって実施した。プロテオミクス解析（ｎ＝６）は、ＦＡＳＰ消化およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳを含み、タンパク質特定は、Ｍａｓｃｏｔ（ｖ２．６）およびＳｃａｆｆｏｌｄ（ｖ４．８．９）によって生成された（０．０５のα、倍率変化＞１．５または＜０．５）。
結果：ＲＩＦ患者および不良な着床の転帰に対して、胚移植２４時間前に固有の子宮の微小環境が観察された（Ｐ＜０．０５）。１３個の有意に減少した転写物、７個の有意に増加した母体のｍｉＲＮＡ、１２個の有意に減少したアミノ酸、および１６個の存在量が有意に変化したタンパク質に焦点を絞ると、いくつかの生物学的プロセスの相互作用が、ＲＩＦに失敗した吸引液において明らかであった（Ｐ＜０．０５）。表３および表４を参照されたい。具体的な例には、エコサノイド経路を調節し、それによってＰＧＥ２のようなプロスタグランジンの下流合成に影響を与えるＰＬＡ２Ｇ４Ｄの発現の減少（Ｐ＜０．０００１）、ＤＮＡメチル化に必要なエピジェネティック調節因子であるＴＥＴ１の発現の減少（Ｐ＜０．０００１）、着床成功に必要なＶＥＧＦＡの公知の負調節因子ｍｉＲ－１７の発現の増加（Ｐ＜０．０１）、胚盤胞の活性化および栄養外胚葉の運動性に必須であるアルギニンの量の減少（Ｐ＜０．０５）、および補体活性化を調節する、炎症に関連付けられたタンパク質であるＳＥＲＰＩＮＧ１の存在量の増加（Ｐ＜０．０５）が含まれる。
Figure 2022518223000004
Figure 2022518223000005
結論：ＦＥＴの２４時間前の子宮分泌物の分析は、損なわれたＲＩＦの子宮の微小環境の詳細な分子的特徴付けを可能にし、かつ生殖の転帰を予測する。アミノ酸およびタンパク質濃度の変化に加えて、主要なｍｉＲＮＡおよび遺伝子転写レベルに対する負の影響を、不良なＲＩＦの転帰の重要な寄与因子としてすべて特定した。これらの所見は、この困難な特許集団に対するより効果的な臨床的介入を容易にする。

Claims (41)

  1. 不妊治療の不良な妊娠転帰を予測する方法であって、
    患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、
    適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、前記子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することと、を含み、
    成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた前記一つ以上のマーカーの存在の前記増加または減少が、不良な妊娠転帰を予測する、方法。
  2. 前記マーカーが、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記マーカーが、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１に記載の方法。
  4. 前記マーカーがアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１に記載の方法。
  5. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１に記載の方法。
  6. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられた、請求項１に記載の方法。
  7. 前記マーカーが、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択される代謝物であり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１に記載の方法。
  8. タンパク質、代謝物、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択される、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキット。
  9. 前記マーカーが、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  10. 前記マーカーが、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  11. 前記マーカーがアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  12. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  13. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  14. 前記マーカーが、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択される代謝物であり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項８に記載のキット。
  15. 凍結胚移植または子宮腔内授精の前に、不妊治療を受けている患者の不良な妊娠転帰を予測することを含む、不妊治療の妊娠成功率を向上させるためのシステムであって、前記予測することが、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、前記患者の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することを含み、
    成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較して、適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの存在の前記増加または減少が、前記患者の不良な妊娠転帰を予測する、システム。
  16. 子宮内膜分泌物の前記セクレトームプロファイルを決定する前記工程が、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの前記存在の増加または減少を確認するために、前記子宮内膜分泌物の前記セクレトームプロファイルを決定することと、を含む、請求項１５に記載のシステム。
  17. 前記マーカーが、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  18. 前記マーカーが、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  19. 前記マーカーがアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  20. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  21. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの存在の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  22. 前記マーカーが、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択される代謝物であり、前記代謝物の存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項１５に記載のシステム。
  23. 前記セクレトームプロファイルが質量分析によって取得される、請求項１５に記載のシステム。
  24. 前記セクレトームプロファイルが、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって生成されたデータによって取得される、請求項１５に記載のシステム。
  25. 前記セクレトームプロファイルがｑＰＣＲによって取得される、請求項１５に記載のシステム。
  26. 凍結胚移植または子宮腔内授精に不妊患者をスクリーニングするインビトロ方法であって、患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、
    適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの存在の増加または減少を確認するために、前記子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することと、を含み、
    適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの前記存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した、前記増加または減少が、不良な妊娠転帰を予測する、方法。
  27. 前記マーカーが、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記マーカーが、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記マーカーがアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  30. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  31. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  32. 前記マーカーが、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択される代謝物であり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項２６に記載の方法。
  33. 候補胚の着床不全を予測する方法であって、
    患者の子宮内膜分泌物を、タンパク質、代謝物、またはｍｉＲＮＡからなる群から選択される適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上または少なくとも二つのマーカーを特定するように機能化された固体基質を含むキットと接触させることと、
    適さない子宮内膜の環境と関連付けられたマーカーの前記存在の増加または減少を確認するために、前記子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルを決定することと、を含み、
    適さない子宮内膜の環境と関連付けられた一つ以上のマーカーの前記存在の、成功した妊娠転帰の子宮内膜分泌物のセクレトームプロファイルと比較した、前記増加または減少が、胚の着床不全を予測する、方法。
  34. 前記マーカーが、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＶＥＧＦ、ムチン１、ムチン１６、ムチン５Ｂ、ムチン５ＡＣ、ＩｇＧＦｃ結合タンパク質、炭酸脱水酵素１、シスタチンＣ、ＩＴＩＨ４、ＬＴＦ、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＧＣ、ＣＦＨ、ＦＦＴ１、ＴＨＳＤ４、ＡＮＰＥＰ、ＣＯＬ６Ａ１、ＰＲＯＭ１、およびＰＬＧからなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記マーカーが、ＳＯＤ１、ＰＲＤＸ６、ＰＬＡ２Ｇ４Ｄ、およびＴＥＴ１からなる群から選択されるタンパク質であり、前記タンパク質の発現の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記マーカーがアルギニンであり、アルギニンのレベルの減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－８９１ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－５２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９８、およびｈｓａ－ｍｉＲ－３６５からなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記マーカーが、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３５ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０ｂ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１２６、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｍｉＲ－１９ａ、ｈｓａ－ｍｉＲ－１５０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２００ｃ、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１４０、ｈｓａ－ｍｉＲ－２２２、ｈｓａ－ｍｉＲ－３１、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５４、ｈｓａ－ｍｉＲ－１０６ｃからなる群から選択されるｍｉｃｒｏＲＮＡであり、存在の増加が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記マーカーが、尿酸塩、キサンチン、ドコサヘキサエン酸、フマル酸塩、システイン、クエン酸塩、プトレシン、プロリン、オルトリン酸塩、ロイシン／イソロイシン、ヒポキサンチン、ヘプタン酸、アラニン、アデノシン、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－イコサトリエン酸、８ｚ－１１ｚ－１４ｚ－１７ｚ－イコサペンタエン酸、および５－オキソプロリンからなる群から選択される代謝物であり、存在の減少が適さない子宮内膜の環境と関連付けられる、請求項３３に記載の方法。
  40. 女性の不妊症を治療する方法であって、
    （ａ）患者の前記子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルを確認することと、
    （ｂ）成功した妊娠転帰を示すｍｉＲ－１７プロファイルと比較して、前記子宮内膜分泌物中のｍｉＲ－１７レベルが増加している患者を、組換えヒトＶＥＧＦ－Ａで治療することと、
    （ｃ）凍結胚移植または子宮腔内授精を実施することと、を含む方法。
  41. （ａ）が（ｃ）の少なくとも２４時間前に実施される、請求項４０に記載の方法。
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