CN104487567A - 用于收集、洗涤、冷冻保存、回收并且将脂肪抽出物返回给医师进行自体脂肪转移手术的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明详述了一种冷冻保护剂和用于制备生物组织的方法以及相关商业方法和系统。本发明是针对用于收集、洗涤、冷冻保存、回收并且将脂肪抽出物返回给医师以在患者体内进行自体脂肪组织转移手术的方法。在一个实施例中，本发明是针对一种用于冷冻保存生物组织的冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液基本为多元醇和类晶体。

Description

用于收集、洗涤、冷冻保存、回收并且将脂肪抽出物返回给医师进行自体脂肪转移手术的组合物及方法
发明领域
本发明是针对用于收集、洗涤、冷冻保存、回收并且将脂肪抽出物返回给医师以在患者体内进行自体脂肪组织转移手术的方法。
发明背景
现今，对一种用于将抽出的脂肪组织以一种在解冻后适于重新注射进患者体内的形式进行冷冻保存的方法仍存在需要。虽然医师已经进行自体脂肪组织转移手术数十年，但是这些手术未被标准化，并且结果通常是次优的。这导致对重复手术的需要，并且医师有时冷冻过量的脂肪抽出物用于后续使用。然而，在没有冷冻保护剂和适当的储存过程和温度的情况下，此类组织的活力丧失(里戴劳斯特(Lidagoster)等人，2000；乌尔曼(Ullman)等人，2004；摩斯卡特罗(Moscatello)等人，2005；沃尔特(Wolter)等人，2005)。虽然已经针对冷冻的脂肪组织测试了多种冷冻保存液和方法(例如二甲亚砜(DMSO)和胎牛血清(FBS))，但是没有一种已经使用了适于在人类中用于直接临床使用的试剂(Pu(卜)等人，2007；Cui(崔)等人，2007；卜等人，2010)。
发明概述
在第一个实施例中，本发明是针对一种用于冷冻保存基本为多元醇和类晶体的生物组织的冷冻保护剂溶液。
在另一个实施例中，本发明是针对一种用于冷冻保存生物组织的系统，该系统包括一种冷冻保护剂溶液和一种塑料基容器，该冷冻保护剂溶液不会导致从塑料基容器中浸出。
在另一个实施例中，本发明是针对一种用于收集、洗涤、冷冻保存、回收并且将脂肪抽出物返回给医师进行自体脂肪组织转移手术的方法。根据美国药典(United States Pharmacopea)(USP)，所有试剂都适于临床使用，并且使用的配件都具有美国食品与药品管理局(U.S.Food andDrug Administration)(FDA)用于临床使用的批准。该方法被设计成在冷冻保存并解冻脂肪组织后获得高百分比活力的脂肪细胞，包括获得脂肪组织样本和用洗涤液(包括乳酸林格氏溶液)洗涤该脂肪组织的步骤。
在一个另外的实施例中，本发明是针对一种冷冻保存脂肪组织的方法，包括获得脂肪组织样本和用类晶体溶液的洗涤液洗涤该脂肪组织的步骤。移除该洗涤，其中添加一种冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液包括等于有待保存的脂肪组织的体积的多元醇和类晶体。分离并移除下层溶液。测试下层溶液的微生物污染。将冷冻保护的脂肪组织放置于多个容器中；并且将冷冻保护的脂肪组织以定义的速率冷冻保存。将冷冻保存的脂肪组织储存在低于-150摄氏度的温度下。
在又另一个实施例中，本发明是针对一种用于收集、深冷储存并分配自体生物样品材料的商业方法。
附图简要说明
图1是本发明的基本冷冻保存方法的流程图。
发明详细说明
在此使用某些术语仅为方便并且不应被当作对本发明的限制。术语包括具体提及的词语，其衍生物以及具有类似含义的词语。在此讨论的实施例并不旨在是穷尽性的或旨在将本发明局限于披露的精确形式。选择并描述这些实施例以最好地解释本发明的原理及其应用和实践用途，并且以使得本领域的其他技术人员可以最好地利用本发明。
在第一个实施例中，本发明是针对一种用于冷冻保存生物组织的冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液基本为多元醇和类晶体。在一个优选实施例中，该多元醇是甘油并且该类晶体是乳酸林格氏溶液。不限制本发明的概念，在此实施例中选择该多元醇和该类晶体是用于其与一种生物组织(例如脂肪组织)的相互作用。
该甘油和乳酸林格氏溶液对应地处于约1比10的比例。此溶液在与脂肪组织合并后20分钟内建立平衡。平衡意指在细胞内和细胞外获得稳态浓度的时间相等。本实施例中的对应地处于约1比10的比例的甘油和乳酸林格氏溶液的组合提供了一种高度有效的冷冻保护剂，该冷冻保护剂可以直接注射进患者体内用于在美容或手术程序中使用。本领域的普通技术人员将意识到，处于1比20与1比10之间的比例的甘油和乳酸林格氏溶液的组合在脂肪组织的冷冻保存中未被认为显著不同，但是可接受的最低比例为1比40(2.5％)。另外，本发明的冷冻保护剂溶液不需要本实施例的脂肪组织进行任何类型的消化。因此，本发明的冷冻保护剂的使用为目前可用的冷冻保护剂提供了一种安全、有效且具有成本效益的替代方案。
在另一个实施例中，本发明是针对一种用于冷冻保存生物组织的系统，该系统包括一种冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液不会导致从塑料基容器中浸出。如在本领域中所已知，DMSO是一种常用冷冻保护剂；还意识到，它具有两种显著不利性。首先，DMSO导致从大多数“塑料”类型袋中“浸出”并且因此，需要具有特殊配方并且昂贵的袋或容器。其次，并且更重要地，DMSO对身体有毒并且不能大量地注射进体内(如在此所讨论)。
本实施例的系统的冷冻保护剂溶液集中于(i)一种多元醇和(ii)一种类晶体。如在先前实施例中所讨论，在本实施例中，该多元醇是甘油并且该类晶体是乳酸林格氏溶液。因此，与包含DMSO的任何溶液形成对照，本实施例的系统提供用于将冷冻保存的脂肪组织直接注射进体内并且也是具有成本效益的。这归因于以下认识，本发明的冷冻保护剂的所有组分都是无毒的并且被食品与药品管理局(FDA)批准用于在患者体内使用；更确切地，乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)是一种美国药典(USP)无菌的、无热原溶液，用于在静脉给药中在单次剂量容器中补充体液和电解质，并且甘油被美国食品与药品管理局(FDA)分类为“公认安全”(GRAS)。柔性容器由具体地设计用于宽范围的肠胃外药物的非乳胶塑料材料制成，这些药物包括需要在由聚烯烃或聚丙烯制成的容器中递送的那些。溶液接触材料不包含PVC、DEHP或其他增塑剂。容器材料的适合性已经通过生物学评价确立，这些生物学评价已经显示该容器通过了用于塑料容器的VI级USP测试。这些测试证实了该容器系统的生物学安全性。具有将“解冻的”冷冻保存的脂肪组织运至可以直接将其注射进患者体内的医师的能力减少了成本，增加手术的有效性并且减少(并且潜在地)消除污染。
该塑料基容器具有至少一个带鲁尔接头(Luer fitting)的管口以及至少一个针孔(spike port)。需要它来完成冷冻保存的脂肪组织(现在解冻的)的直接转移，如在此所讨论。确切地，在收到冷冻保存的脂肪组织(现在解冻的)后，医师简单地经由注射器抽取此组织并且将此组织直接注射进患者的所希望的部位。
在另一个实施例中，本发明是针对一种用于在冷冻保存并解冻脂肪组织后获得高百分比活力的脂肪细胞的方法。该方法包括获得脂肪组织样本和用洗涤液(包括乳酸林格氏溶液)洗涤该脂肪组织的步骤。向洗涤的脂肪组织中添加甘油于乳酸林格氏溶液中的溶液，以在最初的容器和至少一个第二容器中获得甘油冷冻保护的脂肪组织。将甘油冷冻保护的脂肪组织通过以控制速率冷却进行冷冻保存，并且储存在低于-80摄氏度(C)的温度下。在一种优选方法中，在包含液氮的罐的蒸汽相中，将储存温度维持在低于-150摄氏度。
将冷冻保存的甘油冷冻保护的脂肪组织在温度约为35至40摄氏度的液浴中解冻；(在一种优选方法中，为37摄氏度)以形成回收的甘油保护的脂肪组织。将乳酸林格氏溶液以约等于甘油保护的脂肪组织的体积的量添加进该容器中，以形成一种悬浮液。分离该悬浮液，以形成(i)下层物(infranatant)和(ii)脂肪组织；将下层溶液从该容器中移除。将回收的脂肪组织返回该医师，用于在预定的自体脂肪组织转移手术中使用。
如所讨论，本发明的核心是解冻时将一种安全且无毒的冷冻保护剂中的脂肪组织直接注射进患者体内的能力。本实施例的方法的质量控制步骤是通过获得回收的同一冷冻保存的脂肪组织的质量控制等分部分开始，其中将大幅大于脂肪组织的体积的量的乳酸林格氏溶液添加进该质量控制等分部分中。将重新悬浮的回收的脂肪组织离心，以形成(i)下层物洗涤物和(ii)经洗涤的回收的脂肪组织。将经洗涤的回收的脂肪组织的等分部分转移至一个包含胶原酶溶液的试管中。将脂肪组织-胶原酶悬浮液在约37摄氏度下孵育，以将脂肪组织部分地解离为脂肪细胞和基质血管部分细胞。将胶原酶通过向脂肪组织-胶原酶悬浮液中添加生长培养基而中和，并且通过对经消化回收的脂肪组织进行离心来回收脂肪组织，以将漂浮的脂肪细胞与游离的基质血管部分细胞分离。将解离的脂肪细胞的一个样品从回收的脂肪组织转移至一个包含活体染料的试管中，从而基于使用的活体染料，使用能够区分活的脂肪细胞和死的脂肪细胞的仪器确定该样品中的有活力的脂肪细胞的百分比。将活力分析的结果分发给收集医师，该医师最常见地进行将解冻的脂肪组织注射进患者体内的手术。使用此方法，有活力的脂肪组织细胞的百分比典型地大于70.0％。
参考图1，在一个另外的实施例中，本发明是针对一种冷冻保存脂肪组织的方法10，包括获得脂肪组织样本12和用类晶体溶液的洗涤液洗涤该脂肪组织14的步骤。移除该洗涤16，其中添加一种冷冻保护剂溶液18，该冷冻保护剂溶液包括等于有待保存的脂肪组织的体积的多元醇和类晶体。分离并移除下层溶液20。测试下层溶液的微生物污染22。
将冷冻保护的脂肪组织放置于多个容器中24并且将冷冻保护的脂肪组织以定义的速率冷冻保存。26将冷冻保存的脂肪组织储存在低于-150摄氏度的温度下。28
冷冻保存的定义的速率是-1摄氏度/分钟到至少-20摄氏度，并且以-1至-2摄氏度/分钟继续冷却至-80摄氏度。相变(由液体至固体)后的冷却速率临界小于初始冷却速率。如在本发明中所理解，该多元醇是甘油。并且该类晶体是乳酸林格氏溶液。
在又另一个实施例中，本发明是针对一种用于收集、深冷储存并分配自体生物样品材料的商业方法。该方法是通过以下方式起始：收集用于进行生物样品材料的收集、深冷储存和分配的定义的服务费用，并且此后通过(i)支付预定的费用以支持用于收集该生物样品所进行的医师服务并且(ii)提供一种收集系统(该收集系统包括多种用于收集并运送该生物样品的部件)来协调顾客的生物样品的收集。该商业方法的此起始部分不仅对于获得样品而言是重要的，对于开始顾客与商业实体的商业关系而言也是重要的。顾客、医师和商业实体将达成对“大局(big picture)”和此次合作的长期关系的理解，以便理解利益、权利、义务以及成本(如在此所解释)。
医师用于获得生物样品的预定费用将取决于有待处理和冷冻保存的脂肪组织的总体积而变化，但是将最可能受限于与收集系统、至加工设施的运送和冷冻保存有关的成本。然而，该成本将是一种一次性设定费用，该费用将在开始获得该样品的程序之前由客户同意。
该收集系统是被设计用于协调该商业方法的所定义的部件组。该收集系统包括一种用于获得的生物样品的鉴定材料。这最常见地是一个定义组的标准表格，这些标准表格可以包括用于与编码程序一起使用的编码标签(如在此所讨论)。客户样品袋包括用于与该编码程序一起使用的同样的编码标签。这些标签将遵从国家和联邦法规，例如21CFR 11。该收集系统进一步包括一个运送箱，该运送箱可以商业地生产并且与运送承运人(例如联邦快递(FedEx))配合。除关于装运地点的信息之外，运送标记还将包括用于与同一编码程序一起使用的同样的编码标签。协调后，该方法通过从客户获得生物样品并且将该生物样品在收集系统中运至加工设施而继续。
在加工设施处，这些收集系统部件经由登录端口被引入至数据库的处理模块；该模块具有该编码程序。该数据库将是专门设计用于使用专有程序或可商购的程序(例如Microsoft's Access程序)来加工并储存电子保护的健康信息(eProtected health information)。该数据库将包括但不限于，获得自收集系统用于使“客户样品与该客户”配合的信息；例如被包括在客户特异性条形码客户样品袋中的信息。此信息还将被包括在一个标准化表格中。该数据库将被组织在类似于该标准化表格中的组织的模块中，将是可检索的，并且将被编程，以产生与此过程相关的所有不同表格。该数据库包括用于组织并储存关于生物样品的信息并记录信息的编码程序。
该生物样品是通过用一种洗涤液(包括乳酸林格氏溶液)洗涤该脂肪组织而进行加工。向洗涤的脂肪组织中添加甘油于乳酸林格氏溶液中的溶液，以在最初的容器和至少一个第二容器中获得甘油冷冻保护的脂肪组织。将甘油冷冻保护的脂肪组织冷冻保存。
根据要求，将冷冻保存的甘油冷冻保护的脂肪组织在温度约为37摄氏度的液浴中解冻，以形成回收的甘油保护的脂肪组织。将乳酸林格氏溶液以大约等于甘油保护的脂肪组织的体积的量添加进该容器中，以形成一种悬浮液。分离该悬浮液，以形成(i)下层物和(ii)脂肪组织；将下层溶液从该容器中移除。将回收的脂肪组织返回该医师，用于在预定的自体脂肪组织转移手术中使用。
回收同一冷冻保存的脂肪组织的一个质量控制等分部分，并且将大幅大于脂肪组织的体积的量的乳酸林格氏溶液添加进该质量控制等分部分中。将重新悬浮的回收的脂肪组织离心，以形成(i)下层物洗涤物和(ii)经洗涤的回收的脂肪组织。将经洗涤的回收的脂肪组织的等分部分转移至一个包含胶原酶溶液的试管中。将脂肪组织-胶原酶悬浮液在大约37摄氏度下孵育，以将脂肪组织部分地解离为脂肪细胞和基质血管部分细胞。将胶原酶通过向脂肪组织-胶原酶悬浮液中添加生长培养基而中和，并且然后将经消化回收的脂肪组织离心，以将漂浮的脂肪细胞与游离的基质血管部分细胞分离。将解离的脂肪细胞的一个样品从回收的脂肪组织转移至一个包含活体染料的试管中，从而基于使用的活体染料，使用能够区分活的脂肪细胞和死的脂肪细胞的仪器确定该样品中的有活力的脂肪细胞的百分比。活力分析的结果将被报告给收集医师。使用此方法，有活力的脂肪组织细胞的百分比典型地大于70.0％。
将分离的材料分发给自其获得生物样品的顾客；并且基于预定的患者手术，按照请求指示，将包含冷冻保护的脂肪组织的解冻容器在运送系统中进行运送。
脂肪组织的直接冷冻保存的开发
在四种不同冷冻保存条件下评价脂肪组织的冷冻，两种用广泛使用的二甲亚砜(DMSO，在CryoStor CS-5和CS-10中，分别具有5％和10％DMSO)；并且两种用10％甘油(一种较老但仍然有用的冷冻保护剂)，使用和不使用0.2M海藻糖。海藻糖是一种非常稳定的二糖(糖)，它已经被发现可用于各种各样的细胞类型(包括脂肪组织)的冷冻保存。事实上，甘油和海藻糖两者均由某些生物体作为冷冻保护剂而内源地产生。卜(Pu)等人将脂肪抽出物的小样品冰冻于3.3％DMSO+0.2M海藻糖中(2004)，并且随后冰冻于单独的0.2M海藻糖中(2005)，并且发现就脂肪组织的解冻后活力而言，这些表现良好。我们先前测试了10％DMSO、7.5％DMSO+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、10％甘油以及具有10％FBS的10％甘油(2005)，并且发现用DMSO冷冻保存给出优于甘油的结果(摩斯卡特罗(Moscatello)等人，2005)。然而，在那些实验中，我们没有像我们在当前实验中那样在冷冻保存之前，测试脂肪组织与冷冻保护剂的平衡。平衡时间对于甘油而言比对于DMSO而言更可能是一种重要变量，因为DMSO比甘油更加迅速地穿透细胞(江(Jiang)，2008)，但是DMSO在室温或体温下对细胞有毒，而甘油是无毒的。
在进行的实验中，冷冻在甘油和DMSO中的脂肪组织都产生了类似的解冻后脂肪细胞活力(表1)。这通过将冷冻保存的脂肪组织(AT)在37℃水浴中迅速解冻并且用乳酸林格氏溶液洗涤，随后用1mg/mL胶原酶消化而确立。将消化的脂肪组织再次洗涤，并且将漂浮的解离脂肪细胞与等体积的吖啶橙(AO)或碘化丙啶(PI)储备溶液混合。示于表中的AO和PI两个测定的数目是有活力的细胞百分比。在AO测定的情况下，这是％AO阳性(#AO+/#BR细胞x 100％)，并且在PI测定的情况下，这是(#BR+-#PI+)/(#BR细胞)x 100％。换言之，在两个测定中，使用亮场图像确定计数的脂肪细胞的总数。在AO测定中，AO-阳性细胞被认为是有活力的，并且在PI测定中，PI-阳性细胞被认为是无活力的，但是两种情况的目的都是估计活力百分比。软件进行计算，这些计算对正在使用的染料是特异的。
异常值-有差异的结果
表1.将冷冻保存在不同冷冻保护剂中的脂肪组织解冻后的活力。
*系列2包含大量细胞外基质/基质细胞的两种LR样品中的甘油的PI计数，潜在地导致假阳性F1计数。
两个测定表现都相当好，但是PI测定对脂肪制剂中的基质的量(可以大幅变化)更敏感。这是因为，在具有大量基质细胞(其中一些是无活力的)的制剂中，基质细胞的核可能与脂肪细胞重叠，并且因此一些有活力的脂肪细胞在此类情形下被计数为无活力的。本领域的技术人员将意识到，虽然可能充分消化并加工脂肪组织以完全将成熟的脂肪细胞与基质血管部分细胞分离，但是这样的一种程序太严酷以至于不能保留娇弱的脂肪细胞的活力。这些实验说明在QC小瓶中需要比从理论观点看似所需的体积更大的脂肪组织。尽管仅需约100μL的经消化的脂肪组织来染色并装载深孔玻片(例如Cellometer玻片)，但是在QC等分部分中需要至少2mL的脂肪组织，以保证干净的脂肪细胞悬浮液的相等体积。由于成熟脂肪细胞的脆性，获得有活力的脂肪细胞的消化必须比用于分离SVF的消化更温和，所以存在的任何基质材料都未被很好解离。因此必须避免此材料或装载玻片是不可能的，所以我们需要足够体积以获得至少100μL基本无基质的脂肪细胞。
表2.解冻后冷冻保存的脂肪组织活力的时间历程。所有样品都是来自由RZG按照11/17/11等分进OriGen袋中的脂肪抽出物废物。解冻后，移除第0天等分部分，然后向剩余的脂肪组织中添加相等体积的乳酸林格氏溶液并且储存在4℃下。非常高的结缔组织含量难于得到用于计数的‘干净的’脂肪组织。图例：CS0＝无冷冻保护剂；CS5＝CryoStor CS-5；CS10＝CryoStor CS-10；T5＝5min平衡；T15＝15min平衡
表3.将样品储存于最多容纳25mL的Pall袋中。通过在寒冷中以8次摇晃/分钟进行摇晃，将样品在乳酸林格氏溶液中的10％甘油(“甘油”)或乳酸林格氏溶液中的10％甘油+7.6％海藻糖(“Gly+Tre”)中平衡15分钟。标记“移除”的样品在800rpm下离心3分钟，然后在向袋中添加脂肪组织之前移除冷冻保护剂。在用冷冻保护剂平衡后标记“留下”的样品被立即注射进Pall袋中。最终体积是12.5mL脂肪组织和12.5mL冷冻保护剂(“留下”)或20mL的脂肪组织(“移除”)。将所有样品在控制速率的冷冻机Program ASC001上冷冻至-80C并且储存在液氮冷冻罐的汽相中。*NF-无液体；LR-储存在乳酸林格氏溶液中。ND＝AT的体积不足以测试这些条件。注意：与“移除冷冻保护剂”相比，几乎所有“留下冷冻保护剂”的样品具有相当高的量的基质
考虑到示于表1、2和3中的实验结果；将乳酸林格氏溶液中的10％甘油选为最佳冷冻保护剂。有活力的脂肪组织细胞的百分比大于70.0％，如通过吖啶橙(AO)染色所确定(示于表1和3中的解冻的甘油-冷冻保存的脂肪样品的所有AO计数的平均数＝80.1％，范围为46.2％至98.6％)。
虽然基于DMSO的冷冻保护剂表现相当好，但是任何基于DMSO的冷冻保护剂都将需要在回收后洗去；相比之下，这对于本发明的基于甘油的冷冻保护剂而言是非必须的。
实例1
在一个优选实例中，该方法如下：
将使用包含具有广谱抗生素(例如，50μg/mL硫酸庆大霉素)的Ham’s F12(HF12)培养基的无菌容器收集脂肪组织。本领域的技术人员应该清楚的是，将营养培养基(例如最小必需培养基、MCDB 201或类似培养基)或等渗溶液(例如汉克平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solution))考虑为HF12的适合替代物。将对这些容器的空重以及添加收集培养基后的重量进行称量。在从客户的医师处收到收集请求后，将无菌容器标记上客户的姓名以及其他所需信息，并且将其装运至该医师的办公室，用于在预定的脂肪抽吸的前一天接收。装运将是在一个具有适当大小的泡沫隔热箱中，并且将包括患者和收集数据表格和知情同意表并返回装运标签和温度监测器。收集导管的性质和大小将取决于所需的AT体积：
包含50mL具有广谱抗生素(例如，50μg/mL硫酸庆大霉素)的Ham’s F12(HF12)培养基的无菌袋(例如，150mL Sartorius Flexboy袋)将被用于收集小至中等体积的脂肪组织(直到60mL AT)。袋上的中央鲁尔帽将被替换为一个无针接入端口(例如，BD Q-Syte)，用于由医师将注射器直接连接至该袋进行AT注射。
在收集300mL至2L容积的AT的情形下，可以使用一种无菌Filtron脂肪抽出物收集容器。该Filtron收集导管被设计成在脂肪抽吸手术过程中除去血液和肿胀液。在此情形下，将供应一个包含适当体积(针对Filtron 300的100mL直到针对2L Filtron的1L)的具有抗生素的无菌HF12的袋，以在收集AT后将该袋添加至Filtron中。
脂肪抽出物和相关的文书将通过过夜装运而返回至处理实验室。接收时，将检查该样品的容器完整性，并且比较该样品与文件，以保证接收了正确的样品。
接收时以及移除装运培养基后将对该AT样品容器进行称重，这样使得可以对接收的AT的实际量进行定量。
将AT用相等体积的乳酸林格氏溶液洗涤一次。此洗涤物的一个等分部分将被用于无菌度质量控制测试。在移除洗涤物后，AT将与冷冻保护剂平衡并且如下冷冻保存：
a.将一定体积的在乳酸林格氏注射液USP.中的10％甘油USP(等于有待保存的AT的体积)添加至该容器中；
b.将该容器在两个冰袋(预先激冷至2°–8℃)之间‘夹心’，并且以8次摇晃/分钟摇晃15分钟，可替代地，可以将摇晃机放置于冰箱或可进入的冷室中，以维持所需的温度。
c.容纳平衡的AT的该容器将在约4℃下悬挂10分钟，并且然后将移除下层冷冻保护剂液。可替代地，可以将该容器在800rpm下离心3分钟，以分离这些相；
d.然后将移除包括过量的冷冻保护剂液的下层物，并且对该下层物的部分将通过接种进适于需氧和厌氧微生物两者生长的培养基中来测试其中微生物污染的存在；
e.然后，将AT分配进针对所需体积具有适当大小的深冷容器中。能够容纳从低至7毫升至多达100毫升的组织的若干型式的袋是可获得的，这些袋应被证明是无菌的、无热原的，并且被验证可在液氮温度下保留完整性。最常见地，深冷储存袋上的入口管的长度应该不超过10英寸，并且优选长度小于5英寸。该袋应该具有一个多余的鲁尔锁口，用于直接连接至用于添加或移除AT的注射器。在一个优选实施例中，<100mL的AT体积将被分配进能够以不超过1厘米(cm)厚度容纳20–25mL的深冷储存袋中。≥100mL的AT体积将被分配进能够以不超过1cm厚度容纳100mL的所需量的深冷袋中。然后，将这些袋立即放置于具有足够大小的金属盒中，以包含每个袋，同时确保导管中任何点的厚度都不>1cm。袋和盒两者都应该标记有客户特异性条形码标签。在另一个优选实施例中，还将针对每个AT样品冷冻保存一个或多个至少2mL的质量控制样品。
f.然后，将AT冷冻在约-1℃/分钟的控制速率的冷冻机中。在一个优选实施例中，冷冻速率是-1℃/分钟至-20℃，在-20℃下保持0至10分钟，并且然后以约-2℃/分钟冷却至-80℃。相变(由液体至固体)后的冷却速率临界小于初始冷却速率。
g.本领域的普通技术人员将清楚的是，这样的一种冷冻程序的多种变化是可能的；并且
h.将冷冻的AT样品进而转移至液氮深冷储存罐的汽相中的机架上，用于长期储存。温度必须维持在-150℃或以下。最常见地，汽相中的温度应该最优为在-180℃与-190℃之间，并且将对其继续监测。
预定自体脂肪组织转移手术后，医师将向美国CryoStem提交一份指明日期和所需的AT量的请求。在计划日期前一天或两天，实验室人员将按以下方式从深冷储存中检索一个质量控制等分部分连同一个或多个所请求的AT样品。
患者的AT袋将通过从金属盒中移出，随后浸没在温度在35摄氏度与40摄氏度之间的温水浴中而迅速解冻；在一个优选实施例中，水温是约37摄氏度。还将质量控制小瓶按相同方式解冻，但是在两种情况下，端口或帽未被浸没。然后，用70％醇对这些容器喷雾并擦干。
将包含AT的一个或多个袋连同一个温度监测器放置在泡沫隔热箱中的如在此所述的激冷的冰袋之间。还包括一个至鲁尔适配器的无菌针(spike)，用于供医师使用以将脂肪组织从袋中移出。然后将这些过夜(如果在预定的手术之前两天解冻)或优先过夜(如果在预定的手术之前一天解冻)装运至提出请求的医师办公室。
在将脂肪组织传送给医师的当天，对解冻的质量控制等分部分将进行洗涤处理并且用胶原酶温和消化，并且使用活体染料在细胞分析仪器上测试活力。
本领域技术人员将会理解的是，可以在不脱离其宽广的发明构思的情况下对上述实施例作出改变。因此，应当理解的是，本发明不限于所披露的具体实施例，但是旨在涵盖如所附权利要求书限定的处于本发明精神和范围之内的修改。

Claims (22)

1.一种用于冷冻保存生物组织的冷冻保护剂溶液，主要由以下项组成：
a.一种多元醇；以及
b.一种类晶体。
2.如权利要求1所述的冷冻保护剂溶液，其中该多元醇是甘油。
3.如权利要求2所述的冷冻保护剂溶液，其中该类晶体是乳酸林格氏溶液。
4.如权利要求3所述的冷冻保护剂溶液，其中该生物组织是脂肪组织。
5.如权利要求4所述的冷冻保护剂溶液，其中该甘油和乳酸林格氏溶液对应地处于约1比10的比例。
6.如权利要求5所述的冷冻保护剂溶液，其中该溶液在与脂肪组织合并后在30分钟内建立平衡。
7.一种用于冷冻保存生物组织的系统，包括：
a.一种冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液不会导致从塑料基容器中浸出；
b.一种塑料基容器。
8.如权利要求7所述的系统，其中该冷冻保护剂溶液包括(i)一种多元醇和(ii)一种类晶体。
9.如权利要求8所述的系统，其中该多元醇是甘油。
10.如权利要求9所述的系统，其中该类晶体是乳酸林格氏溶液。
11.如权利要求10所述的系统，其中该塑料基容器包括至少一个鲁尔管端口以及至少一个针孔。
12.一种用于在冷冻保存并解冻脂肪组织后获得高百分比活力的脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
a.获得一个脂肪组织样本；
b.用一种包括乳酸林格氏溶液的洗涤液洗涤该脂肪组织；
c.向该洗涤的脂肪组织中添加一种甘油于乳酸林格氏溶液中的溶液，以在最初的容器和至少一个第二容器中获得甘油冷冻保护的脂肪组织；
d.冷冻保存这种甘油冷冻保护的脂肪组织；
e.将这种冷冻保存的甘油冷冻保护的脂肪组织在约37摄氏度温度的液浴中解冻，以形成一种回收的甘油保护的脂肪组织；
f.将乳酸林格氏溶液以约等于甘油保护的脂肪组织的体积的量添加进该容器中，以形成一种悬浮液；
g.分离该悬浮液，以形成(i)下层物和(ii)脂肪组织；
h.将这些下层物从该悬浮液中移除
i.将这种回收的脂肪组织返回到医师，以用于在预定的自体脂肪组织转移手术中使用；
j.回收同一冷冻保存的脂肪组织的一个质量控制等分部分；
k.将大幅大于脂肪组织的体积的量的乳酸林格氏溶液添加进该质量控制等分部分中；
l.将该重新悬浮的回收的脂肪组织离心，以形成(i)下层物洗涤物和(ii)经洗涤的回收的脂肪组织；
m.将这种经洗涤的回收的脂肪组织的一个等分部分转移至一个包含胶原酶溶液的试管中；
n.将该脂肪组织-胶原酶悬浮液在约37摄氏度下孵育，以将该脂肪组织部分地解离为脂肪细胞和基质血管部分细胞；
o.通过向该脂肪组织-胶原酶悬浮液中添加生长培养基而中和该胶原酶；将这种经消化的回收的脂肪组织离心，以将这些漂浮的脂肪细胞与游离的基质血管部分细胞分离；
p.将这些解离的脂肪细胞的一个样品从这种回收的脂肪组织转移至一个包含活体染料的试管中；
q.基于使用的该活体染料，使用一种能够区分活的脂肪细胞和死的脂肪细胞的仪器确定该样品中的有活力的脂肪细胞的百分比；并且
r.将活力分析的结果报告给收集的医师。
13.如权利要求12所述的方法，其中有活力的脂肪组织细胞的百分比大于70.0％，如通过吖啶橙(AO)染色所确定的。
14.如权利要求13所述的方法，其中冷却的定义的速率是-1摄氏度/分钟至至少-20摄氏度，并且以-1至-2摄氏度/分钟继续冷却至-80摄氏度。
15.一种冷冻保存脂肪组织的方法，包括以下步骤：
a.获得一个脂肪组织样本；
b.用一种包括类晶体溶液的洗涤液洗涤该脂肪组织；
c.移除该洗涤；
d.添加一种冷冻保护剂溶液，该冷冻保护剂溶液包括等于有待保存的脂肪组织的体积的一种多元醇和一种类晶体；
e.分离并移除下层溶液；
f.测试该下层溶液的微生物污染；
g.将这种冷冻保护的脂肪组织放置于多个容器中；
h.将这种冷冻保护的脂肪组织以定义的速率冷冻保存；并且
i.将这种冷冻保存的脂肪组织储存在低于-150摄氏度的温度下。
16.如权利要求15所述的方法，其中冷冻保存的该定义的速率是-1摄氏度/分钟至至少-20摄氏度，并且以-1至-2摄氏度/分钟继续冷却至-80摄氏度。[解释]相变(由液体至固体)后的冷却速率临界小于初始冷却速率。
17.如权利要求16所述的方法，其中该多元醇是甘油。
18.如权利要求17所述的方法，其中该类晶体是乳酸林格氏溶液。
19.一种用于在冷冻保存并解冻脂肪组织后获得高百分比活力的脂肪细胞以供运送并在患者手术中使用的商业方法，包括以下步骤：
a.收集针对生物样品材料的收集、运送、深冷储存和分配而定义的服务的费用；
b.协调顾客的生物样品的收集，包括(i)支付预定的费用以支持用于收集该生物样品所进行的医师服务并且(ii)提供一种收集系统，该收集系统包括多种用于收集并运送该生物样品的部件；
c.从该客户获得该生物样品；
d.将在该收集系统中的该生物样品运送至加工设施；
e.将来自这些收集系统部件的信息引入至数据库的处理模块；
f.将该生物样品冷冻保护在一种溶液中，该溶液包括用于冷冻保存的(i)甘油和(ii)乳酸林格氏溶液；
g.针对用于冷冻保存的所分离的材料的质量控制进行测试；
h.冷冻保存这种分离的材料；
i.解冻这种冷冻保存的生物样品；
j.将这种分离的材料分配给自其获得生物样品的顾客；并且
k.按照基于预定的患者手术的要求所指示的，将包含这种冷冻保护的脂肪组织的解冻容器在一个运送系统中进行运送。
20.如权利要求18所述的商业方法，其中该收集系统包括：
a.用于所获得的生物样品的鉴定材料；
b.用于与编码程序一起使用的编码标签；
c.客户样品袋；
d.运送箱；以及
e.运送标记。
21.如权利要求2所述的商业方法，其中这些收集系统部件通过扫描完成的记录信息中的该客户样品袋上的条形码经由登录端口被引入至数据库的处理模块。
22.如权利要求3所述的商业方法，其中这种获得的生物样品是一种脂肪组织样品。
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