CN111514094A

CN111514094A - 一种精华液及其制备方法

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Publication number: CN111514094A
Application number: CN202010536486.6A
Authority: CN
Inventors: 季子云; 李�杰
Original assignee: Hangzhou Fengzhaohuang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Fengzhaohuang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2020-08-11

Abstract

本发明涉及化妆护肤品技术领域，尤其涉及一种精华液及其制备方法。该精华液包括以下质量百分比的组分：酵母提取物5‑10％，还原型谷胱甘肽0.1‑0.2％，壳聚糖0.05‑0.1％，透明质酸钠0.8‑1％，维生素C 0.01‑0.03％，维生素E 0.01‑0.03％，海藻胶原胶质8‑10％，余量间充质干细胞培养上清液。本发明提供的精华液，对于各种皮肤问题具有安全有效的修复、支持作用，能够有效改善使用者皮肤干涩、敏感、老化等问题，刺激促进皮肤细胞修复和再生，提升皮肤细胞更新能力，减少皱纹，预防皮肤衰老。

Description

一种精华液及其制备方法

技术领域

本发明涉及化妆护肤品技术领域，尤其涉及一种精华液及其制备方法。

背景技术

皮肤老化是一个渐进的生理过程，具体而言，皮肤衰老的形式主要包括自然衰老(即内源性衰老)和光老化(即外源性衰老)。自然衰老主要由机体遗传因素引起，限于全身部位，明显特征为皱纹和松弛，并出现色素沉着等现象。光老化主要是紫外线损害累积所致的皮肤衰老，是自然衰老和紫外线照射共同作用的结果，限于皮肤暴露部位，主要特征为皮肤粗糙无光泽，皱纹加粗加深，色素沉着加深，皮肤微循环变差，弹性组织变形，表皮表现为清除力、胶原蛋白和弹性蛋白合成能力及免疫力下降，真皮厚度变薄、易发生过敏发炎等现象。

精华液，是一种添加有浓缩的高营养成分的护肤品。现有的精华液主要功效在于通过高质量的补水保湿来延缓皮肤的衰老，并不能促进皮肤细胞的更新能力，无法达到预防细胞衰老的功能。因此，有必要改善上述相关技术方案中存在的一个或者多个问题。

需要注意的是，本部分旨在为权利要求书中陈述的本发明的实施方式提供背景或上下文。此处的描述不因为包括在本部分中就承认是现有技术。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种精华液及其制备方法，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的一个或者多个问题。

根据本发明实施例的第一方面，提供一种精华液，该精华液包括以下质量百分比的组分：酵母提取物5-10％，还原型谷胱甘肽0.1-0.2％，壳聚糖0.05-0.1％，透明质酸钠0.8-1％，维生素C 0.01-0.03％，维生素E 0.01-0.03％，海藻胶原胶质8-10％，余量间充质干细胞培养上清液。

本发明的一实施例中，所述间充质干细胞培养上清液中包括浓度比为20％的血清替代物和无血清基础培养基。

根据本发明实施例的第二方面，提供了一种精华液的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

制备间充质干细胞培养上清液；

按照上述实施例精华液的组分比例，取定量的所述间充质干细胞培养上清液，分别加入还原型谷胱甘肽、壳聚糖、透明质酸钠、维生素C、维生素E以及海藻胶原胶质，充分混匀后，在3-6℃的环境中静置1.5-3小时。

本发明的一实施例中，所述制备间充质干细胞培养上清液的步骤包括：

脐带的取样及处理；

间充质干细胞原代培养；

间充质干细胞传代培养；

间充质干细胞培养上清液的收集与处理。

本发明的一实施例中，所述脐带的取样及处理步骤包括：

按照预设的尺寸取新生儿脐带；

用浓度为0.9％的生理盐水清洗所述脐带，将清洗后的所述脐带在浓度为75％的酒精中浸泡2-3min，沿螺旋形剔除所述脐带上的动脉和静脉；

获取所述脐带上的华通胶，并使用生理盐水清洗所述华通胶。

本发明的一实施例中，所述间充质干细胞培养步骤包括：

将清洗后的所述华通胶剪成多块，加入无血清培养基混匀，置入37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

培养至第5天进行第一次换液，之后继续培养；

培养至第9-10天进行第二次换液，之后继续培养；

培养至第12天收获P0代细胞。

本发明的一实施例中，所述间充质干细胞传代培养步骤包括：

用浓度为0.9％的生理盐水洗涤所述P0代细胞的细胞面，加入0.25％Trypsin-EDTA，置于37℃培养箱消化30s-1min，终止消化后，吹打细胞面将吹打后的细胞液用100μm的细胞筛过滤，之后加培养基离心弃上清液，加入细胞悬液摇晃使得细胞均匀分布，置入37℃、5％CO₂培养箱培养72h收获P1代细胞；

当所述P1代细胞融合率达到80-90％时，对所述P1代细胞进行传代培养，收集P4-P10代细胞培养液。

本发明的一实施例中，所述P1代细胞进行传代培养的步骤中，所述传代培养过程与所述P0细胞传代得到所述P1代细胞的步骤相同。

本发明的一实施例中，所述间充质干细胞培养上清液的收集与处理步骤包括：

将所述P4-P10代细胞培养液离心，并通过100um的筛网去除底部离心沉淀，收集离心后的上清液；

将所述上清液在超滤器中过滤；

将所述在超滤器中过滤后的上清液除菌。

本发明的一实施例中，所述超滤器为回旋流/切向流超滤器。

本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：

本发明的实施例中，精华液中的间充质干细胞可以分泌多种旁分泌因子，这些细胞因子功能强大，在机体免疫调节，促进细胞增殖、血管再生，修复衰老和损伤组织器官等方面发挥重要作用，壳聚糖具有紫外线防护作用，透明质酸可增加皮肤的水分含量，还原型谷胱甘肽可起到抗氧化剂的作用，维生素C维生素E可淡化色斑、抗氧化，海藻胶原胶质能增加肌肤的紧缩性及弹性，酵母提取物则起到保湿、赋活的功效。通过上述各组分在一定比例下的协同作用，本发明提供的精华液，对于各种皮肤问题具有安全有效的修复、支持作用，能够有效改善使用者皮肤干涩、敏感、老化等问题，刺激促进皮肤细胞修复和再生，提升皮肤细胞更新能力，减少皱纹，预防皮肤衰老。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后皮肤的弹性变化率图；

图2示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后毛孔大小的变化率图；

图3示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后皮肤皱纹大小的变化率图；

图4示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞培养过程中从华通胶中爬出的原代P0细胞；

图5示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞培养过程中，40X镜下观察到的P2代细胞；

图6示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞培养过程中，40X镜下观察到的P4代细胞；

图7示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞培养过程中，40X镜下观察到的P6代细胞；

图8示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞培养过程中，40X镜下观察到的P10代细胞；

图9示出本发明示例性实施例中脐带间充质干细胞流式表型鉴定结果。

具体实施方式

现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本发明将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。

本示例实施方式中首先提供了一种精华液，该精华液包括以下质量百分比的组分：酵母提取物5-10％，还原型谷胱甘肽0.1-0.2％，壳聚糖0.05-0.1％，透明质酸钠0.8-1％，维生素C 0.01-0.03％，维生素E 0.01-0.03％，海藻胶原胶质8-10％，余量间充质干细胞培养上清液。

本发明提供的上述精华液包含多种组分，其中，间充质干细胞培养上清液中的间充质干细胞可以分泌多种旁分泌因子，这些细胞因子功能强大，在机体免疫调节，促进细胞增殖、血管再生，修复衰老和损伤组织器官等方面发挥重要作用，壳聚糖具有紫外线防护作用，透明质酸可增加皮肤的水分含量，还原型谷胱甘肽可起到抗氧化剂的作用，维生素C维生素E可淡化色斑、抗氧化，海藻胶原胶质能增加肌肤的紧缩性及弹性，酵母提取物则起到保湿、赋活的功效。通过上述各组分在一定比例下的协同作用，本发明提供的精华液对于各种皮肤问题具有安全有效的修复、支持作用，能够有效改善使用者皮肤干涩、敏感、老化等问题，刺激促进皮肤细胞修复和再生，提升皮肤细胞更新能力，减少皱纹，预防细胞衰老。

在一个实施例中，间充质干细胞培养上清液中包括浓度比为20％的血清替代物和无血清基础培养基，具体的，在本实施例中，血清替代物采用市售美国PALL公司的血清替代物，无血清基础培养基采用市售美国LONZA无血清培养基。当然，本公开对血清替代物和无血清基础培养基的品牌并不做限制。

下面将对本发明公开的精华液中的各组分具体功效做进一步的说明：

脐带间充质干细胞的培养过程不添加外源动物血清，采用了无血清培养体系，避免了胎牛血清中动物源成分批次差异、污染和传染性病原体的传播的风险、潜在的异种免疫反应。保证产品安全，适合各种哺乳动物使用。

间充质干细胞可分泌多种旁分泌因子，这些旁分泌因子支持受损组织的再生。例如，其分泌的血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，血管生成素1(Ang-1)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，肝细胞生长因子(HGF)，转化生长因子(TGF)-β，单核细胞趋化蛋白(MCP-1)，白介素(IL)-6和SDF-1α。这些旁分泌因子有助于在严重的组织缺血或损伤部位进行血管修复和再生。此外，间充质干细胞还会分泌抗凋亡因子(VEGF、HGF、IGF-1、staniocalcin-1)；转化生长因子(TGF-β)；粒细胞巨噬细胞衍生生长因子(GM-CSF)；免疫调节因子(诱导型一氧化氮(NO)，前列腺素E2(PGE2)，2,3-双加氧酶，非经典主要组织相容性抗原(HLA-G)，HGF，TGF-β，白血病抑制因子(LIF)和IL-10)；支持组织干和祖细胞增殖的因子(干细胞生长因子(SCF)，LIF，巨噬细胞衍生生长因子(M-CSF)，基质细胞因子(SDF-1)和血管生成素1)；抑制缺血中纤维化和瘢痕形成的因子(HGF，FGF-2，肾上腺髓质素)。间充质干细胞分泌的这些细胞因子功能强大，在机体免疫调节，促进细胞增殖、血管再生，修复衰老和损伤组织器官等方面发挥重要作用。

壳聚糖和壳聚糖薄膜的紫外光谱显示在400nm以下有吸收，具有紫外线防护作用。此外，壳聚糖还具有多重功效。当其作为保湿剂时，将壳聚糖与吡咯烷酮羧酸(PCA)结合使用，可形成成膜的保湿剂材料。用作表面活性剂、乳化剂、稳定剂和增粘剂时，聚糖可在不添加任何表面活性剂的情况下获得稳定的水包水(w/o/w)多重乳液。用作抗氧化剂和抗菌剂时，壳聚糖及其衍生物的抗氧化活性可以归因于体外和体内清除自由基的活性，壳聚糖和某些衍生物(主要是阳离子衍生物)对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抗菌活性。由此看出，壳聚糖和衍生物是护肤活性成分的载体，是用于递送活性成分的良好聚合物基质。

透明质酸是天然获得的非免疫原性和非粘附性糖胺聚糖，在伤口愈合中最显着地使用。透明质酸具有简单的结构，在细胞、结构功能中都起着重要作用，且根据人体中存在的区域，其功能会发生变化。当存在于滑液中时，它可以为骨骼提供润滑，而在细胞外基质中，则可以为细胞提供复杂的结构。当降解成较小的片段时，它又具有血管生成特性。透明质酸由于双糖成分而稳定，由于存在许多碳水化合物亚基，吸水率特性最为显著，透明质酸可增加皮肤的水分含量，提供最大的营养，使皮肤柔软甚至有色，有助于对抗衰老迹象，使肌肤看起来更年轻。

还原型谷胱甘肽是由半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸组成的三肽，主要起抗氧化的作用。还原型谷胱甘肽保护硫醇蛋白基团免受氧化，并参与细胞排毒以维持细胞环境，其通过其酪氨酸酶抑制活性在人体内具有美白皮肤的作用，并通过在过氧化氢和脂质过氧化物的还原脱毒过程中充当自由基清除剂来发挥抗氧化活性。此外，它还能通过抑制酪氨酸酶的活性来抑制黑色素的生成。

维生素C在人体组织中是最丰富和最典型的水溶性非酶抗氧化剂，然而，人类自身却无法合成它，必须从饮食中获得。维生素C在皮肤病学领域局部使用，可治疗和预防与光老化有关的变化以及色素沉着过度。此外，维生素C有自由基的中和特性，能够与超氧化物，羟基和游离氧离子发生相互作用，从而防止炎症过程、致癌物以及其他加速皮肤光老化的过程。

维生素E是一种非常强的抗氧化剂，能够抑制脂肪酸的氧化，减少脂褐质(老年斑)的形成，并保护细胞免受自由基的损害，因此具有延缓衰老的作用。

海藻胶原胶质在增稠性、稳定性、胶凝性、保形性、薄膜成形性等方面具有显著的优点。一方面，可以增加肌肤的保水性，使肌肤的保湿效果增大，因而促使肌肤更显亮丽且不易产生过敏反应。另一方面，可以增加肌肤的紧缩性及弹性，使松弛的肌肤回复年轻状态，并可以此达到去除皱纹的目的。其因保水性及紧缩性的双重作用，可改善干性及油性肌肤的分泌状态，使之渐趋于中性肌肤，并促使毛细孔收缩细致。

酵母提取物是酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的淡黄色粉末。其中氨基酸含量30％以上，总蛋白50％以上，核苷酸10％以上，具有保湿、赋活等功效。

为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

以质量百分比，取10％的酵母提取物、0.1％的还原型谷胱甘肽、0.05％的壳聚糖、0.8％的透明质酸钠、0.016％的维生素C、0.01％的维生素E、8％的海藻胶原胶质、81.024％的间充质干细胞培养上清液，充分混匀后，于4℃冰箱静置2h，按照50ml/支分装到灭菌后的精华液瓶中，即得到一种具有修复、抗衰老功能的精华液。

实施例2

以质量百分比，取5％的酵母提取物、0.1％的还原型谷胱甘肽、0.1％的壳聚糖、1％的透明质酸钠、0.016％的维生素C、0.01％的维生素E、10％的海藻胶原胶质、83.774％的间充质干细胞培养上清液，充分混匀后，于4℃冰箱静置2h，按照50ml/支分装到灭菌后的精华液瓶中，即得到一种具有修复、抗衰老功能精华液。

实施例3

以质量百分比，取5％的酵母提取物、0.2％的还原型谷胱甘肽、0.1％的壳聚糖、1％的透明质酸钠、0.03％的维生素C、0.03％的维生素E、10％的海藻胶原胶质、83.64％的间充质干细胞培养上清液，充分混匀后，于4℃冰箱静置2h，按照50ml/支分装到灭菌后的精华液瓶中，即得到一种具有修复、抗衰老功能精华液。

实施例4

以质量百分比，取7％的酵母提取物、0.15％的还原型谷胱甘肽、0.1％的壳聚糖、0.9％的透明质酸钠、0.01％的维生素C、0.02％的维生素E、9％的海藻胶原胶质、82.82％的间充质干细胞培养上清液，充分混匀后，于4℃冰箱静置2h，按照50ml/支分装到灭菌后的精华液瓶中，即得到一种具有修复、抗衰老功能精华液。

对比例1

市售其他精华液1

对比例2

市售其他精华液2

对比例3

清水

随机筛选相关人员对上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3中的产品进行试用，每周使用2次，连续使用4周，并在0天、7天、14天、21天、28天时使用CBS-807皮肤分析系统对皮肤毛孔大小、皮肤弹性、肤色、皮肤光泽度、皱纹大小进行测试，具体测试效果如表1、表2、图1、图2、图3所示。其中，肤色测试表中“*”的数量越多表示肤色越白，皮肤光泽度测试表中“*”的数量越多表示光泽越好。

表1肤色测试

肤色

实施例1

实施例2

实施例3

实施例4

对比例1

对比例2

对比例3

0天

*

7天

**

*

14天

**

***

**

*

21天

***

****

***

**

*

28天

****

**

*

表2皮肤光泽度测试

从表1、2可看出，受试者在使用本发明公开的精华液1周后皮肤有所改善，连续使用4周后相较对比例皮肤改善明显。

图1示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后皮肤的弹性变化率图，图2示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后毛孔大小的变化率图，图3示出使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的产品后皮肤皱纹大小的变化率图。从图1、2、3可看出，受试者在使用本发明公开的精华液1周后皮肤有所改善，连续使用4周后相较对比例皮肤改善明显。

综上所述，本公开提供的精华液，对于各种皮肤问题具有安全有效的修复、支持作用，能够有效改善使用者皮肤干涩、敏感、老化等问题，刺激促进皮肤细胞修复和再生，提升皮肤细胞更新能力，减少皱纹，预防细胞衰老。

本示例实施方式中还提供了一种精华液的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤S101：制备间充质干细胞培养上清液；

步骤S102：按照前述精华液的组分比例，取定量的间充质干细胞培养上清液，分别加入还原型谷胱甘肽、壳聚糖、透明质酸钠、维生素C、维生素E以及海藻胶原胶质，充分混匀后，在3-6℃的环境中静置1.5-3小时。

进一步的，制备间充质干细胞培养上清液的步骤包括：

步骤S1011：脐带的取样及处理；

步骤S1012：间充质干细胞原代培养；

步骤S1013：间充质干细胞传代培养；

步骤S1014：间充质干细胞培养上清液的收集与处理。

具体的，在步骤S1011中，根据实际情况，按照预设的尺寸取健康足月新生儿脐带。例如，在本实施例中，取健康足月新生儿脐带8-12cm，并置于含有脐带保存液的采集瓶中保存运输，另外，再采集母体外周血3-5ml用于病毒五项检测。

将剪下的脐带用医用镊子夹到10cm盘子中，用0.9％生理盐水洗至无血色，用75％酒精浸泡2-3min，剪成2-3cm小段，沿螺旋形剔除2根动脉和1根静脉。用带齿医用镊撕下华通胶，夹取到50ml离心管中。加适量生理盐水离心洗涤华通胶(3000r/min，5min)，弃掉上清液。

在步骤S1012中，将上述步骤中清洗后的华通胶剪成多块，每块直径大约2mm，再加适量无血清培养基混匀，取5ml到T75瓶中，再将T75瓶放入37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

培养至第5天进行第一次的换液，具体操作为：将T75瓶内培养液连同漂浮的华通胶组织块一并倒入50ml离心管，离心3000r/min，5min。另外取10ml培养液于15ml离心管用于质量检测，弃掉其余上清，用适量培养基重悬后，混匀，沿侧壁加入到培养瓶中(4ml/瓶)。放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，4h之后补加4ml培养基于各个T75瓶内继续培养。

培养至第9-10天进行第二次的换液。将T75瓶内培养液连同漂浮的华通胶组织块一并倒入50ml离心管，离心3000r/min，5min。取10ml培养液于15ml离心管用于质量检测，弃掉其余上清，用适量培养基重悬后，混匀，沿侧壁加入到培养瓶中(4ml/瓶)。放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，4h之后补加4ml培养基于各个T75瓶内继续培养。

培养至第12天收获P0细胞。

在步骤S1013中，将P0细胞进行传代培养，具体操作如下：将P0细胞所在的T75瓶进行晃动，将培养液连同组织取10ml，用于质检部检验，其余培养液倒入废液缸。用10ml0.9％生理盐水轻轻洗涤细胞面一次。再加0.25％Trypsin-EDTA 1ml/T75，置于37℃培养箱消化30s-1min。镜检观察细胞分散，收缩变圆，加入3ml培养基终止消化。移液管吹打细胞面，将吹打后的细胞液用100μm的细胞筛过滤，加0.9％生理盐水10ml轻轻吹打细胞面2遍，每遍吹打5次左右，将吹打后的细胞液用100μm的细胞筛过滤。转到离心管中，离心1200r/min，5min。弃上清，加入适量培养基重悬，并计数。10ml移液管吹打细胞面，将吹打后的细胞液用100μm的细胞筛过滤。加入15ml生理盐水洗涤细胞瓶两次，转到50ml离心管中，离心1200r/min，5min。弃上清，加入适量培养基重悬。取10ul细胞悬液和10ul台盼蓝混合计数。根据计数结果和传代密度算出传代瓶数。每个T175或150培养皿加20ml培养基。根据细胞数量和传代密度(原代细胞传代密度10000/cm²)加入相应体积的细胞悬液。细胞面向上十字交叉晃动培养瓶使细胞均匀分布。放入37℃，5％CO₂培养箱培养。培养至第15天P1代细胞收获和传代。

镜检观察P1代细胞融合率达到80-90％时，对P1代细胞进行传代培养，具体的传代步骤同P0-P1，收集P4-P10代细胞培养液。

在步骤S1014中，将P4-P10代细胞培养上清原液收集到250ml无菌离心管中，并做好信息标记。用不含Ca²⁺、Mg²⁺的DPBS试剂清洗细胞培养瓶底部后，加入0.25％胰蛋白酶将细胞消化。在离心清洗3次后，用无外源血清冻存液重悬细胞，并放入-196℃液氮中备用。

将收集至离心管中的脐带间充质干细胞上清液，在高速离心机中离心，离心条件：离心5000r/min，离心时间为30min，通过100um筛网去除底部离心沉淀，收集离心后的上清液。

将该离心后的上清液在超滤器中过滤，具体的，可选用通量分别为3000和2000的道尔顿30/20回旋流/切向流超滤器。

超滤器超滤后，可将上述上清液用0.22um针头式的滤器再次过滤，以进一步除菌，保证上清液无菌。

如此，便得到富含细胞生长因子的、无菌的间充质干细胞培养上清液。

按照前述精华液的组分比例，取定量的间充质干细胞培养上清液，分别加入还原型谷胱甘肽、壳聚糖、透明质酸钠、维生素C、维生素E以及海藻胶原胶质，充分混匀后，在3-6℃的环境中静置1.5-3小时，按照50ml/支分装到灭菌后的精华液瓶中，即制备得到一种具有修复、抗衰老功能的精华液。

对本发明公开的上述方法制备得到的间充质干细胞培养上清液，按照国际细胞治疗协会(ISCT)制定的标准进行生物学鉴定。其中，表面抗原阳性指标CD73、CD90、CD105表达率≥95％，阴性指标CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR的表达率≤2％。

对本发明公开的上述方法制备得到的精华液进行安全性检测，具体包括①细菌/真菌检测；②病毒检测，包括艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、人巨细胞病毒；③内毒素检测；④原癌基因检测，包括不同代次cmyc、Bmi1、H-ras三个基因的表达水平；⑤支原体检测。所有安全性指标均符合要求。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由所附的权利要求指出。

Claims

1.一种精华液，其特征在于，包括以下质量百分比的组分：酵母提取物5-10％，还原型谷胱甘肽0.1-0.2％，壳聚糖0.05-0.1％，透明质酸钠0.8-1％，维生素C 0.01-0.03％，维生素E 0.01-0.03％，海藻胶原胶质8-10％，余量间充质干细胞培养上清液。

2.根据权利要求1所述精华液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养上清液中包括浓度比为20％的血清替代物和无血清基础培养基。

3.一种权利要1所述精华液的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

制备间充质干细胞培养上清液；

按照权利要求1所述的组分比例，取定量的所述间充质干细胞培养上清液，分别加入还原型谷胱甘肽、壳聚糖、透明质酸钠、维生素C、维生素E以及海藻胶原胶质，充分混匀后，在3-6℃的环境中静置1.5-3小时。

4.根据权利要求3所述精华液的制备方法，其特征在于，所述制备间充质干细胞培养上清液的步骤包括：

脐带的取样及处理；

间充质干细胞原代培养；

间充质干细胞传代培养；

间充质干细胞培养上清液的收集与处理。

5.根据权利要求4所述精华液的制备方法，其特征在于，所述脐带的取样及处理步骤包括：

按照预设的尺寸取新生儿脐带；

6.根据权利要求5所述精华液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞原代培养步骤包括：

培养至第5天进行第一次换液，之后继续培养；

培养至第9-10天进行第二次换液，之后继续培养；

培养至第12天收获P0细胞。

7.根据权利要求6所述精华液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞传代培养步骤包括：

用浓度为0.9％的生理盐水洗涤所述P0细胞的细胞面，加入0.25％Trypsin-EDTA，置于37℃培养箱消化30s-1min，终止消化后，吹打细胞面将吹打后的细胞液用100μm的细胞筛过滤，之后加培养基离心弃上清液，加入细胞悬液摇晃使得细胞均匀分布，置入37℃、5％CO₂培养箱培养72h收获P1代细胞；

8.根据权利要求7所述精华液的制备方法，其特征在于，所述P1代细胞进行传代培养的步骤中，所述传代培养过程与所述P0细胞传代得到所述P1代细胞的步骤相同。

9.根据权利要求7所述精华液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞培养上清液的收集与处理步骤包括：

将所述上清液在超滤器中过滤；

将所述在超滤器中过滤后的上清液除菌。

10.根据权利要求9所述精华液的制备方法，其特征在于，所述超滤器为回旋流/切向流超滤器。