BRPI0611739A2

BRPI0611739A2 - colágeno de atelopeptìdeo, composição, método e kit para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamìfero, e, processos para preparar e para reticular colágeno de atelopeptìdeo, e para reduzir a quantidade de partìculas virais em uma composição de colágeno

Info

Publication number: BRPI0611739A2
Application number: BRPI0611739-2A
Authority: BR
Inventors: Sascha Abramson; Mohit Bhatia; Kristen Labazzo; Qing Liu; Chris Lugo; Wei Wu Matcham
Original assignee: Celgene Corp
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2011-12-20
Also published as: CA2610928A1; NZ564563A; JP2008543783A; US20070020225A1; KR20080031735A; ZA200800144B; WO2006135843A3; MX2007015541A; WO2006135843A2; AU2006257878A1; PE20070166A1; EP1893249A2; CN101237898A; IL187982A0

Abstract

COLáGENO DE ATELOPEPTìDEO, COMPOSIçãO, MéTODO E KIT PARA AUMENTAR, AVOLUMAR OU SUBSTITUIR TECIDO DE UM MAMìFERO, E, PROCESSOS PARA PREPARAR E PARA RETICULAR COLáGENO DE ATELOPEPTìDEO, E PARA REDUZIR A QUANTIDADE DE PARTìCULAS VIRAIS EM UMA COMPOSIçãO DE COLáGENO. A presente invenção fornece composições compreendendo colágeno de placenta humana, métodos para preparar as composições, métodos e seus usos e kits compreendendo as composições. As composições, kits e métodos são úteis, por exemplo, para aumentar ou substituir tecido de um mamífero.

Description

"COLAGENO DE ATELOPEPTIDEO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO E KIT PARA AUMENTAR, AVOLUMAR OU SUBSTITUIR TECIDO DE UM MAMÍFERO, E, PROCESSOS PARA PREPARAR E PARA RETICULAR COLÁGENO DE ATELOPEPTIDEO, E PARA REDUZIR A QUANTIDADE DE PARTÍCULAS VIRAIS EM UMA COMPOSIÇÃO DE COLÁGENO"

1. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições que compreendem colágeno de placenta humana, a métodos de preparação das composições e a métodos para seu uso.

AFUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Colágeno é uma proteína que forma muitas estruturas no corpo, incluindo tendões, ossos, dentes e folhas que suportam pele e órgãos internos. Colágeno é composto de três cadeias, enroladas em uma hélice tripla. A estrutura vem de repetições de três aminoácidos. Nas hélices, cada terceiro aminoácido é glicina, e muitos dos aminoácidos restantes são prolina ou hidroxiprolina.

Colágeno tem sido usado comercialmente e clinicamente por algum tempo. Hoje, colágeno pode ser usado para substituir ou aumentar tecido conectivo duro ou macio, tal como pele, tendões, cartilagem, osso e intgfstício. O dito colágeno tem sido implantado cirurgicamente, e formulações de colágeno injetáveis são agora disponíveis para administração mais conveniente. Hoje, várias composições de colágeno injetáveis são comercialmente disponibilizadas incluindo Zyderm®, Zyplast®, Cosmoderm® e Cosmoplast®.

Cada composição de colágeno tem propriedades físicas particulares que podem ser vantajosas e desvantajosas para seu uso em técnicas particulares. Assim, permanece a necessidade na técnica por composições de colágeno com outras propriedades físicas para expandir a seleção de composições disponíveis para os versados na técnica. 3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é baseada, em parte, na verificação de composições de colágeno que são úteis, por exemplo, para aumentar ou substituir tecido de um mamífero. Em certas formas de realização, composições de colágeno da presente invenção mostram durabilidade e injetabilidade melhoradas. Por exemplo, em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção mostram durabilidade vantajosa após a injeção. Em certas formas de realização da presente invenção, as composições de colágeno da presente invenção mostram vantajosamente baixa toxicidade. Em certas formas de realização da presente invenção, as composições de colágeno mostram propriedades reológicas vantajosas.

Em um aspecto, a presente invenção fornece composições compreendendo colágeno reticulado. Em certas formas de realização, o colágeno é reticulado com o reticulante 1,4-butanodiol diglicidil éter. Em formas de realização particulares, as composições de colágeno compreendem colágeno de atelopeptídeo.

Neste aspecto da presente invenção, o material inicial de colágeno pode ser qualquer colágeno conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o material inicial de colágeno é um colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido. Em formas de realização particulares, o material inicial de colágeno é colágeno de placenta. Em outras formas de realização particulares, o material inicial de colágeno é colágeno de mamífero. Um exemplo é colágeno humano. Em formas de realização particulares, o colágeno é de placenta humana. O material inicial de colágeno pode ser preparado de acordo com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica.

Em certas formas de realização, o material inicial de colágeno é preparado de acordo com os aspectos da presente invenção, tais como aqueles discutidos em detalhes abaixo. O colágeno pode ser qualquer tipo de colágeno conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, as composições de colágeno são enriquecidas nos colágenos Tipo I e Tipo IV. Em outras formas de realização, as composições de colágeno são reduzidas no colágeno Tipo III. Em certas formas de realização, as composições de colágenos são enriquecidas nos colágenos Tipo I e Tipo III. Em outras formas de realização, as composições de colágeno são reduzidas no colágeno Tipo IV.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de preparação das composições de colágeno da presente invenção. Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção são preparadas pelo contato de um material inicial de colágeno com o reticulante 1,4-butanodiol diglicidil éter sob condições adequadas para a formação de reticulações. Em formas de realização particulares, de cerca de quatro a um 1,4-butanodiol diglicidil éter no colágeno são usados em uma base em peso. Em formas de realização particulares, a reação de reticulação é catalisada por um catalisador, tal como piridina.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece processos para a preparação de colágeno de placenta solúvel em ácido. Embora a fonte do tecido de placenta possa ser qualquer mamífero, a placenta humana é usada em certas formas de realização. O tecido da placenta pode ser de qualquer parte da placenta, incluindo o âmnio, solúvel ou insolúvel ou ambos, o córion e o cordão umbilical, ou de toda a placenta. Em certas formas de realização, o colágeno de placenta solúvel em ácido é preparado a partir de toda a placenta humana após a remoção do cordão umbilical.

Em certas formas de realização, os processos compreendem um choque osmótico de tecido da placenta. Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que o choque osmótico possa romper as células no tecido e desta forma facilitar a remoção das células, componentes celulares e componentes do sangue. A etapa de choque osmótico pode produzir composições de colágeno da presente invenção com pureza vantajosa. O choque osmótico pode ser realizado em condições de choque osmótico conhecidas por aqueles versados na técnica.

Em formas de realização particulares, o choque osmótico realizado por incubação em condições de muito sal seguidas por incubação em uma solução em água. As incubações podem ser repetidas de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica.

Após o choque osmótico, a composição de colágeno resultante pode ser lavada sob condições ácidas. As condições ácidas podem ser quaisquer condições ácidas conhecidas por aqueles versados na técnica. O ácido acético é um exemplo de um ácido útil para a lavagem com ácido. Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a lavagem com ácido possa solubilizar alguns polipeptídeos, enquanto se precipita e facilita a remoção de polipeptídeos de baixo peso molecular (e.g., 30-60 kDa) que podem contaminar a composição de colágeno.

Em certas formas de realização onde o colágeno de atelopeptídeo for desejado, a composição de colágeno é contatada com uma enzima capaz ou parcialmente ou completamente remover telopeptídeos do colágeno. Como será aparente para aqueles versados na técnica, esta etapa não vai ser usada quando colágeno atelopeptídeo não for desejado. A enzima pode ser qualquer enzima proteolítica conhecida por aqueles versados na técnica que seja capaz de remover telopeptídeos do colágeno. Em certas formas de realização, a enzima é pepsina ou papaína. Geralmente, a enzima é contatada com a composição de colágeno sob condições adequadas para a remoção de telopeptídeo conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, a enzima é contatada com a composição de colágeno em temperatura elevada. Embora não se deseje estar limitado por nenhuma teoria de operação particular, acredita-se que a temperatura elevada possa melhorar o rendimento do colágeno tipo I na composição de colágeno final. Em formas de realização particulares, a composição de colágeno é contatada com pepsina a 23-27°C por um tempo suficiente para remover telopeptídeo.

Em uma outra etapa, a composição de colágeno pode ser purificada por precipitação de sal. A precipitação de sal pode ser qualquer precipitação conhecida por aqueles versados na técnica. Contudo, em certas formas de realização, uma precipitação de pouco sal inicial é seguida por uma precipitação com muito sal. O colágeno desejado para as composições de colágeno da presente invenção permanece no sobrenadante na precipitação de pouco sal e é precipitada na precipitação de muito sal nestes métodos. Em formas de realização particulares, a precipitação de pouco sal está em cerca de NaCl 0,2M, enquanto que a precipitação de muito sal está em cerca de NaCl 0,7M. Em cada precipitação, a composição de colágeno da presente invenção pode ser recuperada do sobrenadante ou precipitar por técnicas padrão, tais como centrifugação, filtração e concentração, como será aparente para aqueles versados na técnica. Cada precipitação de sal pode ser repetida de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica, e os precipitados podem ser lavados quando necessário de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtra de baixo peso molecular para concentrar a amostra e para limpar endotoxinas. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de 100 kDa ou um filtro de 30 kD, ou ambos, para concentrar e/ou remover endotoxinas. Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de alto peso molecular para remover vírus. Como discutido abaixo, o filtro de alto peso molecular retém colágeno ao mesmo tempo que permite que as partículas virais passem. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de 1000 kDa, 750 kDa ou 500 kDa para remover vírus, tais como HTV5 hepatite A, hepatite B, hepatite C, herpes, parvovírus, e outros contaminantes virais conhecidos por aqueles versados na técnica.

Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção podem ser também processadas por fibrilação. A fibrilação pode ser realizada por qualquer técnica para fibrilação de colágeno conhecida por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é fibrilada em 3 mg/ml de colágeno, fosfato de sódio 30 mM, pH 7,2, em cerca de 32°C por cerca de 20-24 horas.

Quando desejado, as composições de colágeno da presente invenção podem ser reticuladas. Em certas formas de realização, a reticulação é realizada após a fibrilação. A reticulação pode ser com qualquer reticulador para aqueles versados na técnica. Por exemplo, em certas formas de realização, o reticulador pode ser glutaraldeído, e a reticulação pode ser realizada de acordo com os métodos de reticulação com glutaraldeído de colágeno conhecidos por aqueles versados na técnica. Em outras formas de realização, o reticulador pode ser 1,4-butanodiol diglicidil éter ou genipina. Em formas de realização particulares, o reticulador é 1,4-butanodiol diglicidil éter. A reticulação pode ser realizada por técnicas aparentes por aqueles versados na técnica ou por aquelas descritas aqui. Em certas formas de realização, a reticulação com 1,4-butanodiol diglicidil éter é realizada com um catalisador, tal como piridina.

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção pode ser reduzida. A redução pode ser realizada pelo contato da composição de colágeno da presente invenção com qualquer agente de redução conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o agente de redução é boroidreto de sódio. Em algumas formas de realização particulares, o colágeno é reticulado antes da redução com o agente de redução.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser também processada por cisalhamento mecânico de acordo com os métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. As técnicas de cisalhamento exemplares são descritas na Patente US 4.642.117, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é cortada com um homogeneizador de tecido.

As composições de colágeno preparadas pelos processos da presente invenção têm mostrado propriedades vantajosas. Por exemplo, certas composições de colágeno da presente invenção têm compreendido uma quantidade substancial de colágeno do tipo IV, em algumas formas de realização entre 2 a 13%. Além disso, certas composições de colágeno da presente invenção têm compreendido uma menor quantidade de colágeno do tipo III, em certas formas de realização, cerca de 5%. Tipicamente, o colágeno restante das composições da presente invenção tem sido colágeno Tipo I, cerca de 80-90% em certas formas de realização. Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção compreendem uma quantidade substancial de carboidrato, por exemplo, pelo menos 10 μg/mg de carboidrato, com base no peso de colágeno. Embora não se pretenda estar ligado por qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a alta concentração de carboidrato seja devida ao teor de carboidrato do colágeno do tipo IV. Com isso, em certos aspectos, a presente invenção fornece composições de colágeno tendo as propriedades acima.

Em outras formas de realização, certas composições de colágeno da presente invenção compreendem entre 0 e 13% de colágeno tipo IV. Em algumas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem cerca de 0-5% de colágeno do tipo III. Em algumas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem cerca de 80-95% de colágeno do tipo I. Em algumas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem mais que 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de colágeno do tipo I. Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é substancialmente livre de carboidrato, por exemplo, menos que cerca de 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2, 5, 7,5 ou 10 μg/mg de caraboidrato, com base no peso de colágeno.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece composições de colágeno da presente invenção que também compreendem ácido hialurônico. Embora não e pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a inclusão de ácido hialurônico possa facilitar a migração de fibroblastos para o através de uma composição de colágeno da presente invenção. A composição de colágeno compreendendo ácido hialurônico pode ser preparada pelo contato de uma composição de colágeno da presente invenção com ácido hialurônico sob quaisquer condições adequadas aparentes para alguém versado na técnica. Em certas formas de realização, o colágeno da composição é reticulado. Em outras formas de realização, o ácido hialurônico da composição é reticulado. Em outras formas de realização, o colágeno e o ácido hialurônico são reticulados. Em formas de realização particulares, ambos são reticulados juntos. O reticulador pode ser qualquer reticulador adequado conhecido por alguém versado na técnica incluindo o glutaraldeído, genipina e 1,4-butanodiol diglicidil éter discutidos aqui.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para aumentar ou substituir o tecido de um mamífero pela administração de uma composição de colágeno da presente invenção em um mamífero em sua necessidade. Em certas formas de realização, o mamífero é humano. A composição de colágeno pode ser administrada de acordo com qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, as composições de colágeno são administradas por injeção. Em certas formas de realização, as propriedades reológicas das composições de colágeno da presente invenção são vantajosas.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece kits para a administração das composições de colágeno da presente invenção a um mamífero em sua necessidade. Os kits tipicamente compreendem uma composição de colágeno da presente invenção em um pacote conveniente para a distribuição a um versado na técnica. Os kits podem também compreender um dispositivo para a administração da composição de colágeno da presente invenção ao mamífero. O dispositivo pode ser qualquer dispositivo para a administração de uma composição de colágeno conhecida por aqueles versados na técnica, tal como uma seringa, uma seringa e uma agulha, uma cânula, etc. Em certas formas de realização, o dispositivo é pré-enchido com uma composição de colágeno da presente invenção.

Como descrito acima e em detalhes nas seções abaixo, as composições, processos, métodos e kits da presente invenção têm utilidade para a administração de composições de colágeno a mamíferos em sua necessidade.

4. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

4.1 Definições

Como usados aqui, os seguintes termos devem ter os seguintes significados.

O termo "colágeno" se refere a qualquer colágeno conhecido por aqueles versados na técnica.

O termo "colágeno atelopeptídeo" se refere a uma forma de colágeno, como reconhecido por aqueles versados na técnica, que não tem uma ou mais regiões de telopeptídeo. Em certas formas de realização, a região de telopeptídeo pode ser removida por digestão de protease, como discutido em detalhes abaixo.

"Biocompatibilidade" ou "biocompatível", como usado aqui, se refere à propriedade de ser biologicamente compatível pela não produção de uma resposta tóxica, prejudicial oi imunológica ou rejeição no tecido vivo. A resposta corpórea aos materiais não conhecidos é uma preocupação principal quando se usam materiais artificiais no corpo e então a biocompatibilidade de um material é uma consideração de projeto importante em tais materiais.

"Não-pirogênico", como usado aqui, se refere a um material que tenha sido testado e verificado conter menos que ou igual a 0,5 EU/ml de um pirogênio, e.g., endotoxina. Um EU é aproximadamente 0,1 a 0,2 ng de endotoxina por ml e varoa de acordo com a referência consultada.

O termo "indivíduo" se refere a animais, tais como mamíferos, que incluem, mas não são limitados a, primatas (e.g., humanos), vacas, ovelhas, cabras, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos, e semelhantes. Em certas formas de realização, o indivíduo é um humano.

O termo "rótulo" se refere a uma exibição de matéria escrita, impressa ou gráfica no recipiente imediato de um artigo, por exemplo, o material escrito exibido em um frasco contendo um agente farmaceuticamente ativo.

O termo "rotulagem" se refere a todos os rótulos e outra matéria escrita, impressa ou gráfica em qualquer artigo ou em qualquer de seus recipientes ou invólucros ou acompanhando tal artigo, por exemplo, um inserto de pacote ou fitas de vídeo ou DVDs com instruções que acompanham ou estão associados com um recipiente de um agente farmaceuticamente ativo.

4.2 Formas de Realização da Invenção

A presente invenção é voltada para composições de colágeno, para processos para a preparação de composições de colágeno, para kits compreendendo as composições de colágeno e para métodos de seu uso.

4.2.1 Composições de Colágeno da Invenção

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece composições de colágeno úteis, por exemplo, para aumentar ou substituir tecido de um mamífero. Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção têm propriedades de durabilidade, injetabilidade e reológica vantajosas.

Neste aspecto da presente invenção, o colágeno pode ser qualquer colágeno conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o colágeno é colágeno de mamífero. Em formas de realização particulares, o colágeno é humano, bovino, de ovelha, de rato ou de canguru. Em certas formas de realização de não-mamíferos, o colágeno é colágeno de peixe. Embora o colágeno possa ser de qualquer destas fontes, o colágeno humano é um exemplo particular.

O colágeno pode ser de qualquer porção da fonte. As fontes úteis incluem pele bovina, pele de bezerro, cauda de rato, cauda de canguru e pele de peixe. Em formas de realização particulares, o colágeno é colágeno de placenta, por exemplo, colágeno de placenta bovina, colágeno de placenta ovina ou colágeno de placenta humana. Um exemplo é colágeno de placenta humana.

O colágeno pode ser processado em qualquer maneira conhecida por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o colágeno compreende telopeptídeos. Em outras formas de realização, o colágeno é colágeno de atelopeptídeo. Para os propósitos de presente invenção, colágeno de atelopeptídeo compreende uma quantidade substancial de colágeno que não tem um ou ambos os telopeptídeos. Por exemplo, uma composição de colágeno de atelopeptídeo pode compreender pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% de colágeno de atelopeptídeo, com base no peso de colágeno. Em outras formas de realização, o colágeno pode ser colágeno fibrilar, que é conhecido por alguém versado na técnica. Em ainda outras formas de realização, o colágeno pode ser colágeno solúvel em ácido, como reconhecido por aqueles versados na técnica. As técnicas para a preparação de colágeno de atelopeptídeo, colágeno fibrilar e colágeno solúvel em ácido são discutidos nas seções abaixo.

O colágeno pode ser qualquer tipo de colágeno conhecido por aqueles versados na técnica ou uma mistura de tais colágenos. Em certas formas de realização, o colágeno está na forma de uma composição de colágeno que compreende um ou mais tipos de colágeno. Os colágenos particulares incluem colágeno do tipo I, colágeno do tipo II, colágeno do tipo III e colágeno do tipo IV. Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção compreende quantidades particulares destes colágenos. Uma composição particular compreende uma quantidade substancial de colágeno do tipo I, e também sendo enriquecido em colágeno tipo IV. Em certas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção compreende entre 1 e 15% de colágeno tipo IV, entre 2 e 13% de colágeno tipo IV, entre 3 e 12% de colágeno tipo IV ou entre 4 e 11% de colágeno tipo IV. Ao mesmo tempo, a composição de colágeno pode compreender pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% de colágeno tipo I. Por exemplo, a composição pode compreender entre 75 e 95% de colágeno tipo I, entre 77,5 e 92,5% de colágeno tipo I ou entre 80 e 90% de colágeno tipo I.

As mesmas composições de colágeno da presente invenção podem compreender uma quantidade de colágeno tipo III, por exemplo até 1%, até 2%, até 3%, até 4% ou até 5% de colágeno tipo III. Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem entre 2 a 13% de colágeno tipo IV, entre 80 e 90% de colágeno tipo I e até 5% de colágeno tipo III. Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem entre 0 e 13% de colágeno do tipo IV, entre 80 e 95% de colágeno tipo I e até 5% de colágeno tipo III.

Em certas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção compreende uma quantidade substancial de carboidrato, por exemplo, pelo menos 10, 15, 20 ou 25 µg/mg de carboidrato, com base no peso de colágeno. Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a alta concentração de carboidrato seja devida ao teor de carboidrato do colágeno tipo IV.

Estas composições de colágeno da presente invenção podem ser obtidas por qualquer processo aparente para alguém versado na técnica. Processos particulares são descritos em detalhes nas seções abaixo.

Como discutido acima, as composições de colágeno deste aspecto da presente invenção são reticuladas. O reticulador pode ser qualquer reticulador conhecido por aqueles versados na técnica. Um reticulador particular para este aspecto da presente invenção é um alquil diol ou alquil poliol de acordo com a seguinte estrutura:

R1-CH2-0-[-X-0-CH2-R2-]n

em que X é um CrCg alquil (reto ou ramificado) e R e R são, cada um, independentemente, hidrogênio ou grupos reativos, e em que η é um número inteiro de 1 a 100. Em formas de realização particulares, o reticulador é um reticulador multifuncional. Em certas formas de realização, η é 1 e o reticulador é um reticulador bifimcional. Em certas formas de realização, cada R1 e R2 são, independentemente, epóxido ou aldeído. Em certas formas de realização, pelo menos um R ou R é epóxido. Em certas formas de realização, o reticulador é glicerol poliglicidil éter (EX-313 EC) ou poliglicerol poliglicidil éter (EX-512 EC).

Em certas formas de realização, X é C4 alquil linear e R e R são, cada um, epóxido, i.e., o reticulador é 1,4-butanodiol diglicidil éter.

<formula>formula see original document page 14</formula>

1,4-butanodiol diglicidil éter

Outros reticuladores exemplares e métodos de seu uso para a reticulação de colágeno são descritos nas Patentes US 5,880,242 e 6,117,979 e em Zeeman et ai, 2000, JBiamed Mater Res.51(4):541-8, van Wachem et al., 2000, J Biamed Mater Res. 53(l):18-27, van Wachem et al., 1999, J Biamed Mater Res. 47(2):270-7, Zeeman et al., 1999, JBiamed Mater Res. 46(3):424-33, Zeeman et al., 1999, Biomaterials 20(10):921-31, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência por completo. Em formas de realização particulares, o reticulador é usado para reticular colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido de qualquer fonte. Em formas de realização particulares, o colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido é de placenta humana.

A reticulação pode ser realizada por qualquer método aparente para aqueles versados na técnica, por exemplo, pelos métodos descritos nas referências acima ou de acordo com os métodos descritos aqui. Em certas formas de realização, de cerca de 0,1:10 a 10:0,1 de 1,4-butanodiol diglicidil éter são usados em relação à quantidade de colágeno em uma base em peso. Em certas formas de realização, a relação é 1:10,1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ou 10:1. Em certas formas de realização, a relação é 4:1 BDDE: colágeno em uma base em peso. Em formas de realização particulares, a reação de reticulação é catalisada por um catalisador, tal como piridina, como descrito aqui.

Em outras formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção são reticuladas com genipina. Genipina é um agente de reticulação de ocorrência natural não-tóxico. Ela pode ser obtida de seu composto originário, que pode ser isolado dos frutos de Gardênia jasminoides. Genipina pode ser obtida comercialmente da Challenge Bioproducts Co., Ltd., 7 Alley 25, Lane 63, TzuChiang St. 404 Taichung Taiwan R.O.C., Tel 886-4-3600852. O uso de genipina como um reagente de reticulação é descrito extensivamente na Publicação de Pedido de Patente US No. 2003 00493 01, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência.

Em outras formas de realização, a composição de colágeno pode ser reticulada com outros reticuladores conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a composição de colágeno da presente invenção pode ser reticulada com glutaraldeído de acordo com os métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos são descritos extensivamente, por exemplo, nas Patentes US 4,852;640, 5,428,022, 5,660,692 e 5;008,116, e em McPherson et al., 1986, J. Biomedical Materials Res. 20:79-92, cujo conteúdo é incorporado como referência.

Em outras formas de realização, a composição de colágeno pode ser reticulada com qualquer técnica de reticulação mediada por enzima conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, a composição de colágeno da presente invenção pode ser reticulada por transglutaminase de acordo com os métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. A transglutaminase catalisa a formação da reticulação de amida entre os resíduos de glutamina e lisina de colágeno. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Orban et al., 2004, J. Blomedical Material Res. 68(4):756-62, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência.

As composições de colágeno da presente invenção podem ser reticuladas com um reticulador único ou com uma mistura de reticuladores. Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção compreende colágeno de placenta humana solúvel em ácido reticulado com 1,4-butanodiol diglicidil éter. Em formas de realização particulares, o colágeno é colágeno de atelopeptídeo.

Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção podem também compreender ácido hialurônico. Embora não se deseje estar limitado por qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a inclusão de ácido hialurônico possa facilitar a migração de fibroblastos em ou através de uma composição de colágeno da presente invenção. A composição de colágeno compreendendo ácido hialurônico pode ser preparada pelo contato de uma composição de colágeno da presente invenção sob quaisquer condições adequadas aparentes para alguém versado na técnica. Em certas formas de realização, o colágeno da composição é reticulado. Em outras formas de realização, o ácido hialurônico da composição é reticulado. Em outras formas de realização, o colágeno e o ácido hialurônico são reticulados. Em formas de realização particulares, ambos são reticulados juntos. O reticulador pode ser qualquer reticulador adequado conhecido por aqueles versados na técnica, incluindo o glutaraldeído, genipina e 1,4-butanodiol diglicidil éter discutidos acima.

Em certas formas de realização, as composições compreendendo ácido hialurônico podem compreender de 0,1:99,9 a 99,9 a 0,1 de ácido hialurônico : colágeno em uma base peso / peso. Em certas formas de realização, a relação é 0,1:99,9,1:99, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 99:1 ou 99,9:0,1. As composições de colágeno compreendendo ácido hialurônico não-reticulado, e processos para sua preparação, são descritos extensivamente nas Patentes US 4.803.075 e 5.137.875, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência. A reticulação pode ser realizada por técnicas aparentes para aqueles versados na técnica ou para aqueles descritos aqui.

4.3 Processos para a Preparação de Composições de Colágeno da Invenção

Em outro aspecto, a presente invenção fornece processos para a preparação das composições de colágeno da presente invenção. Os processos são úteis, por exemplo, para a preparação das composições de colágeno da presente invenção descritas acima.

Em certas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção são preparadas a partir de placenta humana de acordo com os métodos descritos aqui. As etapas iniciais de preparação de composições de colágeno a partir de placenta humana são descritas em detalhes nas Patentes US 5.428.022, 5,660,692 e 5,008,116, e nas Publicações de Pedido de Patente US Nos. 2004/0048796 e 2003/0187515, cujos conteúdos são incorporados como referência.

O tecido da placenta pode ser de qualquer parte da placenta incluindo o âmnio, solúvel ou insolúvel, o córion, o cordão umbilical ou da placenta inteira. Em certas formas de realização, o colágeno de placenta solúvel em ácido é preparado a partir de placenta humana sem o cordão umbilical.

O saco da placenta é composto de duas camadas intimamente conectadas por tecido conectivo solto. Elas são conhecidas como as camadas amniótica e coriônica. A camada amniótica é a mais interna das duas camadas e entra em contato com o fluido amniótico que circunda o feto e juntos formam o saco amniótico. A camada amniótica é avascular e revestida por epitélio colunar simples que envolve uma membrana basal e ela mede 30-60 mícrons de espessura. A membrana coriônica é a camada externa do saco e é altamente celularizada. A árvore vascular se origina na placenta e se estende até as membranas da placenta através da camada coriônica. A camada coriônica é separada da camada amniótica por tecido conectivo solto e combinadas, com as duas camadas medindo 120-180 mícrons. As membranas da placenta têm uma matriz de colágeno que é altamente carregada com mucopolissacarídeos e acredita-se que elas sirvam principalmente como um saco protetor para o feto em desenvolvimento. As membranas também mantêm uma barreira para agentes infecciosos e imunológicos presentes na circulação materna. As membranas da placenta têm transportes ativo e passivo. A maioria das moléculas e proteínas pequenas podem trafegar livremente através delas, mas as proteínas grandes, tais como IgM, não pode, atravessar a camada basal.

Em uma forma de realização particular, a placenta para uso nos métodos da presente invenção é retirada tão logo possível após a saída do bebê. Em uma outra forma de realização particular, a placenta é retirada imediatamente após o fornecimento pela secção cesariana de um bebê saudável normal. Vantajosamente, a placenta pode ser coletada sob condições assépticas. Em algumas formas de realização, a placenta é armazenada por 48 horas a partir do tempo de fornecimento antes de qualquer outro tratamento. Em outras formas de realização, a placenta é armazenada por até 5 dias desde o tempo de liberação antes de qualquer outro tratamento.

Vantajosamente, a placenta, o cordão umbilical, e o sangue do cordão umbilical podem ser transportados do ambiente de liberação ou nascimento para outro local, e.g., um laboratório, para outro processamento. A placenta pode ser transportada em um dispositivo de transporte estéril, tal como uma bolsa estéril ou um recipiente, que é opcionalmente termicamente isolado. Em algumas formas de realização, a placenta é armazenada à temperatura ambiente até outro tratamento. Em outras formas de realização, a placenta é refrigerada até outro tratamento, i.e., armazenada em uma temperatura de cerca de 2 a 8°C. Em ainda outras formas de realização, a placenta é armazenada sob condições estéreis por até 5 dias antes de outro tratamento. Em uma forma de realização particular, a placenta é manuseada e processada sob condições assépticas, como é conhecido por alguém versado na técnica. O laboratório pode ser equipado com um sistema de filtração HEPA (como definido por classificação de ambiente limpo, tendo uma classe 1000 ou melhor). Em uma forma de realização particular, o sistema de filtração HEPA é ligado em pelo menos 1 hora antes do uso em ambiente de laboratório para a realização dos métodos da presente invenção.

Em certas formas de realização, a placenta tem o sangue removido, i.e., completamente drenada do sangue do cordão restante após o nascimento. Em algumas formas de realização, a placenta tem 70% do sangue removido, 80% do sangue removido, 90% do sangue removido, 95% do sangue removido, 99% do sangue removido.

A presente invenção engloba a triagem da mãe grávida antes do nascimento, usando técnicas padrão conhecidas por alguém versado na técnica, para doenças comunicáveis incluindo, mas não limitadas a, MV5 HBV, HCV, HTLV, sífilis, CMV, e outros patógenos virais conhecidos por contaminar o tecido da placenta. Vantajosamente, os métodos podem ser usados para triar uma doença comunicável após as regulações mostradas pela Federal Drug Administration. A mãe grávida pode ser tríada (e.g., uma amostra de sangue é tomada para propósitos de diagnóstico) dentro de um mês do nascimento, particularmente dentro de duas semanas de nascimento, dentro de uma semana de nascimento, ou no tempo do nascimento. Somente tecidos coletados de doadores cujas mães foram negativas no teste ou não- reativas para os patógenos mencionados acima são usados para produzir uma composição de colágeno da presente invenção. Vantajosamente, um histórico paterno, médico e social completo do doador da membrana da placenta pode ser obtido, incluindo, por exemplo, um histórico familiar detalhado.

Em certas formas de realização, o doador é triado usando testes sorológicos e bacteriológicos conhecidos por alguém versado na técnica. Qualquer ensaio ou teste diagnóstico que identifica o(s) patógeno(s) está dentro do escopo do método da presente invenção, mas ensaios particulares são aqueles que combinam alta precisão com capacidade para alta produtividade. Em uma forma de realização específica, a presente invenção engloba a triagem do doador usando técnicas padrão conhecidas por alguém versado na técnica para antígenos e/ou anticorpos. Um exemplo não- limitantes de antígenos e anticorpos incluem: triagem de anticorpos (ATY); triagem de alanina amino transferase (ALT); Anticorpo de Núcleo de Hepatite (ácido nucleico e ELISA); Antígeno de Superfície de Hepatite B; Anticorpo de Vírus da Hepatite C; HIV-I e HIV-2; HTLV-I e HTLV-2; teste de sífilis (RPR); teste de anticorpo de CMV; e teste de Hepatite C e HIV. Os ensaios usados podem ser ensaios baseados em ácido nucleico ou ensaios baseados em ELISA conhecidos por alguém versado na técnica.

A presente invenção engloba outro teste do sangue do cordão umbilical do recém nascido usando técnicas padrão para alguém versado na técnica (Ver, e.g., Cotorruelo et al., 2002, Clin Lab. 48(5 6):2718 1; Maine et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn., 1(1):19 29; Nielsen et ad., 1987, J. Clin. Microbiol. 25(8): 1406 10; todos são incorporados aqui como referência por completo). Em uma forma de realização, o sangue do cordão umbilical do recém-nascido é testado para os patógenos bacterianos (incluindo, mas não limitados a bactérias gram positivas e gram negativas) e fungos usando técnicas conhecidas por alguém versado na técnica. Em uma forma de realização específica, o tipo de sangue e o fator Rh do sangue do cordão umbilical do recém nascido são determinados usando técnicas padrão conhecidas por alguém versado na técnica. Em outra forma de realização, CBC com diferencial é obtido do sangue do cordão umbilical do recém nascido usando métodos padrão conhecidos por alguém versado na técnica. Em uma outra forma de realização, uma cultura bacteriana aeróbica é retirada do sangue do cordão umbilical do recém nascido, usando métodos padrão conhecidos por alguém versado na técnica. Somente tecidos coletados de doadores que têm um CBC dentro de um limite normal (e.g., nenhuma anormalidade gritante ou desvio do nível normal), negativos no teste para sorologia e bacteriologia, e negativos no teste ou não-reativos para doença infecciosa e contaminação são usados para produzir uma composição de colágeno da presente invenção.

Quando o tecido de placenta humana for obtido, ele pode ser tratado de acordo com as seguintes etapas, de forma a preparar uma composição de colágeno da presente invenção. Embora as seguintes etapas sejam apresentadas em ordem seqüencial, alguém versado na técnica vai reconhecer que a ordem de várias etapas pode ser mudada sem exceder o escopo da presente invenção. Além disso, várias etapas são indicadas como opcionais, dependendo da natureza da composição de colágeno desejada da presente invenção. E assumido que técnicas prontamente aparentes para aqueles versados na técnica, tais como troca de tampão, precipitação, centrifugação, ressuspensão, diluição e concentração de composições de proteína não precisam ser explicadas em detalhes. Uma preparação exemplar é descrita nos exemplos abaixo.

Qualquer porção da placenta, ou toda a placenta, pode ser usada nos processos da presente invenção. Em certas formas de realização, as composições de colágeno são preparadas a partir de toda a placenta. Contudo, em certas formas de realização, as composições de colágeno podem ser obtidas de porções coriônicas ou amniônicas da placenta.

Nestas formas de realização, a presente invenção engloba o processamento da membrana da placenta de forma que o cordão umbilical seja separado do disco da placenta, e a separação da membrana amniótica da membrana coriônica. Em uma forma de realização particular, a membrana amniótica é separada da membrana coriônica antes do corte da membrana da placenta. A separação da membrana coriônica da membrana amniótica pode ser feita iniciando da borda da membrana da placenta. Em outra forma de realização, a membrana amniótica é separada da membrana coriônica usando dissecção cega, e.g., com dedos com luva. Após a separação da membrana amniótica da membrana coriônica e do disco da placenta, a ponta do cordão umbilical é cortada, e.g., com uma tesoura, e destacada do disco da placenta. Em certas formas de realização, quando a separação das membranas coriônica e amniótica não for possível sem rasgar o tecido, a presente invenção engloba o corte das membranas coriônica e amniótica do disco da placenta como um pedaço e então o retira.

A membrana amniótica, a membrana coriônica ou toda a placenta podem ser armazenados antes do uso nos processos da presente invenção. As técnicas de armazenagem vão ser aparentes para alguém versado na técnica. As técnicas de armazenagem exemplares são descritas nas Publicações de Pedido de Patente US 2004/0048796 e 2003/0187515, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência.

Nos processos da presente invenção, o tecido da placenta tem as células retiradas. O tecido da placenta pode ter as células removidas de acordo com qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica, tais como aquelas descritas em detalhes nas Publicações de Pedido de Patente US 2004/0048796 e 2003/0187515, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência.

Em certas formas de realização, o tecido da placenta é submetido a um choque osmótico. A etapa de choque osmótico pode produzir composições de colágeno da presente invenção com pureza vantajosa. Embora não se pretenda estar ligado a nenhuma teoria de operação particular, acredita-se que o choque osmótico possa romper as células no tecido e desta forma facilitar a remoção das células, dos componentes celulares e dos componentes do sangue. O choque osmótico pode ser em adição a qualquer etapa de clarificação ou pode ser a etapa de clarificação única de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica.

O choque osmótico pode ser realizado em quaisquer condições de choque osmótico conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais condições incluem a incubação do tecido em soluções de alto potencial osmótico, ou de baixo potencial osmótico ou de potenciais osmóticos baixo e alto alternantes. A solução de alto potencial osmótico pode ser qualquer solução de potencial osmótico alto conhecida por aqueles versados na técnica, tais como uma solução compreendendo um ou mais dentre NaCl (e.g., 0.2 - 1.0 M), KCl (e.g, 0.2 - 1.0 ou 2.0 M), sulfato de amônio, um monossacarídeo, um dissacarídeo (e.g., 20% de sacarose), um polímero hidrofílico (e.g., polietileno glicol), glicerol, etc. Em certas formas de realização, a solução de alto potencial osmótico é uma solução de cloreto de sódio. Em algumas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 0,25 M, 0,5M, 0,75M, 1,0M, 1,25M, 1,5M, 1,75M, 2M, ou 2,5M NaCl. Em algumas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é cerca de 0,25-5M, cerca de 0,5-4M, cerca de 0,75-3M, ou cerca de 1,0-2,OM NaCl.

A solução com baixo potencial osmótico pode ser qualquer solução de baixo potencial osmótico conhecida por aqueles versados na técnica, tais como água, por exemplo, água deionizada de acordo com qualquer método conhecido por alguém versado na técnica.

Em certas formas de realização, o choque osmótico é em uma solução de cloreto de sódio seguida por uma solução de água. Em algumas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 0,5M NaCl. Em certas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 0,75M NaCl. Em certas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 1,0M NaCl. Em certas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 1,5M NaCl. Em certas formas de realização, a solução de cloreto de sódio é pelo menos 2,OM NaCl. Em certas formas de realização, uma lavagem com 0,5M NaCl é seguida por uma lavagem com água. Em certas formas de realização, duas lavagens com 0,5M NaCl são seguidas por uma lavagem com água. Em certas formas de realização, uma lavagem com 2M NaCl é seguida por uma lavagem com água. Estas seqüências podem ser repetidas de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno resultante do choque osmótico pode ser incubada em condições básicas. Embora não se pretenda estar ligado por qualquer teoria de operação particular, acredita-se que uma lavagem básica possa remover partículas virais que podem contaminar a composição de colágeno. As condições básicas podem ser quaisquer condições básicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Em particular, qualquer base em qualquer pH conhecido para remover partículas virais pode ser usada. As bases particulares para a lavagem básica incluem bases biocompatíveis, bases voláteis e bases conhecidas por aqueles versados na técnica como sendo facilmente e seguramente removidas da composição de colágeno. A base pode ser qualquer base orgânica ou inorgânica conhecida por aqueles versados na técnica em uma concentração de, por exemplo, 0,2-1,0 M. Em certas formas de realização, a lavagem de base é realizada em solução de hidróxido de sódio. A solução de hidróxido de sódio pode ser 0,1M NaOH5 0,25M NaOH, 0,5M NaOH; ou 1 M NaOH. Em formas de realização particulares, a lavagem básica é realizada em 0,1 M ou 0,5M NaOH.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno resultante do choque osmótico pode ser incubada em condições ácidas. Embora não se pretenda estar ligado a nenhuma teoria de operação particular, acredita-se que a lavagem ácida possa precipitar e/ou facilitar a remoção de polipeptídeos de baixo peso molecular que podem contaminar a composição de colágeno. As condições ácidas podem ser quaisquer condições ácidas conhecidas por aqueles versados na técnica. Em particular, qualquer ácido em qualquer pH conhecido para precipitar proteínas contaminantes de baixo peso molecular pode ser usado. Os ácidos particulares para a lavagem ácida são ácidos biocompatíveis, ácidos voláteis e ácidos conhecidos por aqueles versados na técnica por serem facilmente e seguramente removidos da composição de colágeno. O ácido pode ser qualquer ácido orgânico ou inorgânico conhecido por aqueles versados na técnica, tal como ácido fórmico, ácido cítrico, ácido clorídrico ou ácido acético em uma concentração de, por exemplo, 0,2-1,0 M. Em certas formas de realização, a lavagem ácida é realizada em ácido acético 0,5 M.

A lavagem ácida pode ser realizada em qualquer temperatura de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, a lavagem ácido é realizada em cerca de 0-30°C, cerca de 5- 25°C, cerca de 5-20°C, ou cerca de 5-15°C. Em certas formas de realização, a lavagem ácida é realizada em cerca de 0°C, cerca de 5°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 20°C, cerca de 25°C, ou cerca de 30°C. Em formas de realização particulares, a lavagem ácida é realizada em cerca de 5-15°C.

A lavagem ácida pode ser realizada por um tempo adequado de acordo com o julgamento por alguém versado na técnica. Em certas formas de realização, a lavagem ácida pode ser realizada por cerca de 1-24 horas, cerca de 2-20 horas, cerca de 5-15 horas, cerca de 8-12 horas, ou cerca de 2-5 horas.

Quando desejado, uma enzima, tal como pepsina ou papaína, pode ser adicionada na solução de lavagem ácida. Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a pepsina na lavagem ácida possa reduzir impurezas na composição de colágeno. A pepsina pode estar na solução de lavagem ácida em uma quantidade de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica. Em algumas formas de realização, cerca de 0,1g, cerca de 0,5g, cerca de l,0g, cerca de 2,0g ou cerca de 5,Og pepsina/kg de placenta congelada estão na solução de lavagem ácida. Em outras formas de realização, cerca de 0,1 g; cerca de 0,5g, cerca de l,0g, cerca de 2,Og ou cerca de 5,og de pepsina/ placenta estão na solução de lavagem ácida. Em certas formas de realização, cerca de 0,1-2,0 g/l, cerca de 0,2-1,5 g/l, ou cerca de 0,5-1,0 g/l de pepsina estão na solução de lavagem ácida. Em algumas formas de realização, cerca de 0,1 g/l, cerca de 0,2g/l, cerca de 0,5g/l, cerca de 1,0 g/l, ou cerca de 2,0 g/l de pepsina estão na solução de lavagem ácida. Em formas de realização particulares, cerca de 0,5 g/l de pepsina estão não solução de lavagem ácida em cerca de 5-15°C por cerca de 2-5 horas. Em formas de realização particulares, cerca de 0,5 g/l de pepsina estão na solução de lavagem ácida em cerca de 5°C-6°C por cerca de 18-24 h.

Em certas formas de realização, quando colágeno de atelopeptídeo for desejado, a composição de colágeno é contatada com uma enzima capaz de remover parcialmente ou completamente telopeptídeos do colágeno. Como será aparente para aqueles versados na técnica, esta etapa não vai ser usada quando colágeno de atelopeptídeo não for desejado. A enzima pode ser qualquer enzima conhecida por aqueles versados na técnica que seja capaz de remover telopeptídeos do colágeno. Em certas formas de realização, a enzima é pepsina ou papaína. Os métodos de tratamento de composições de colágeno com enzimas para remover telopeptídeos são descritos em detalhes nas Patentes US 4,511,653, 4,582,640, 5,436,135 e 6,548,077, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência. Geralmente, a enzima é contatada com a composição de colágeno sob condições adequadas para a remoção de telopeptídeo conhecidas por aqueles versados na técnica. Tais condições incluem, por exemplo, contatar a enzima com a composição de colágeno em pH adequado, em uma concentração de enzima adequada, em um volume adequado de uma solução, em temperatura adequada e por um tempo adequado.

A composição de colágeno pode ser contatada com a enzima sob condições de pH baixo de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, a posição do colágeno é contatada com pepsina em pH de cerca de 1-3 ou de cerca de 2-3.

Em certas formas de realização, a enzima é contatada com a composição de colágeno em temperatura elevada. Embora não se pretenda estar ligado a qualquer teoria de operação particular, acredita-se que a temperatura elevada possa melhorar o rendimento do colágeno do Tipo I na composição de colágeno final. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é contatada com pepsina em cerca de 15-40 °C, cerca de 20-35 °C, cerca de 25-30°C, cerca de 20-30°C, ou cerca de 23-27 °C. Em formas de realização particulares, a composição de colágeno é contatada com pepsina em cerca de 23-27°C por um tempo suficiente para remover telopeptídeo.

A composição de colágeno é contatada com a enzima por um tempo suficiente para remover telopeptídeo de acordo com o julgamento por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o colágeno é contatado com pepsina por pelo menos 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 horas. Em certas formas de realização, o colágeno é contatado com pepsina por cerca de 5-30 horas, cerca de 10-25 horas ou cerca de 20-25 horas. Em certas formas de realização, o colágeno é contatado com pepsina por cerca de 8,16, 24 ou 32 horas.

A composição de colágeno é contatada com a enzima em uma quantidade adequada para remover telopeptídeo de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. Em algumas formas de realização, cerca de 0,1 g, 0,5 g, 1,0 g, 2,0 g ou 5,0 g de pepsina / kg de placenta congelada são contatados com a composição de colágeno. Em outras formas de realização, cerca de 0,1 g, 0,5 g, 1,0 g, 2,0 g ou 5,0 g de pepsina / placenta são contatados com a composição de colágeno. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é contatada com cerca de 0,l-10.0g/L, cerca de 0.5- 5/L, cerca de l-2.5g/L, ou cerca de 0,5-1,5 g/l de pepsina. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno é contatada com cerca de 0,1 g/L, cerca de 0,2g/L, cerca de 0,5g/L, cerca de l,0g/L, cerca de 2,0g/L, 5g/L ou 10g/L pepsina. Em formas de realização particulares, a composição de colágeno é contatada com cerca de 0,5-1,0 g/l de pepsina em solução de ácido acético com pH de cerca de 2-3, em cerca de 23-27°C por cerca de 16-24 horas.

A composição de colágeno é contatada com a enzima em uma solução adequada volume :placenta para remover telopeptídeo de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. É observado que uma alta relação de volume para placenta pode maximizar o efeito por pepsina. Em certas formas de realização, cerca de 1, 2, 4 ou 8 volumes de solução de ácido acético por placenta são usados. Em formas de realização particulares, cerca de 2 volumes de solução de ácido acético por placenta são usados.

Em uma outra etapa, a composição de colágeno é purificada por precipitação de sal. A precipitação de sal pode ser qualquer precipitação de sal conhecida por aqueles versados na técnica. O sal pode ser, por exemplo, sulfato de amônio, KCl, NaCl ou qualquer outro sal conhecido por aqueles versados na técnica como sendo úteis para a precipitação de proteínas. O sal pode ser adicionado à composição de colágeno por qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o sal pode ser adicionado à composição de colágeno na forma de uma solução de sal líquida concentrada até uma concentração desejada ser obtida. Em certas formas de realização, uma precipitação de sal baixa inicial é seguida por uma precipitação de sal alta. O colágeno desejado para as composições de colágeno da presente invenção permanece no sobrenadante na precipitação de sal baixa e é precipitado na precipitação de sal alta nestes métodos. Em formas de realização particulares, a precipitação de sal baixa está em cerca de 0,2M NaCl, enquanto que a precipitação de sal alta está em cerca de 0,7M NaCl. Em certas formas de realização, uma precipitação de sal alta é usada para purificar a composição de colágeno. Em certas formas de realização, a precipitação de sal alta está em cerca de 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M ou 1,0M NaCl. Em formas de realização particulares, a precipitação de sal alta está em cerca de 0,7M NaCl. Em cada precipitação, a composição de colágeno da presente invenção pode ser recuperada do sobrenadante ou precipitar por técnicas padrão, tais como centrifugação, filtração, ressuspensão e concentração, como será aparente para aqueles versados na técnica. Cada precipitação de sal pode ser repetida de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica, e os precipitados podem ser lavados quando necessário de acordo com o julgamento de alguém versado na técnica. Qualquer precipitado resultante pode ser redissolvido ou ressuspenso, por exemplo, sob condições ácidas.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser purificada por cromatografia. A cromatografia pode ser qualquer cromatografia conhecida por aqueles versados na técnica. A cromatografia pode ser, por exemplo, cromatografia de tamanho ou de troca iônica ou qualquer outra cromatografia conhecida por aqueles versados na técnica como sendo úteis para purificação de proteínas. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é purificada por cromatografia de troca iônica. Em certas formas de realização, uma troca de ânions e/ou meio de adsorção pode se ligar a proteínas de impureza, e um meio de troca de cátions pode se ligar a colágeno. O colágeno pode então ser recuperado, por exemplo, por eluição seletiva por uma solução de sal, tal como uma solução de cloreto de sódio.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de baixo peso molecular para concentrar a amostra e para limpar as citotoxinas. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de 100 kDa ou com um filtro de 30 kDa, ou ambos, para concentrar e/ou remover endotoxinas. Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de alto peso molecular para remover vírus. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser filtrada com um filtro de 1000 kDa, 750 kDa ou 500 kDa para remover vírus, tais como HIV, hepatite A, hepatite B, hepatite C, herpes, parvovírus, e outros contaminantes virais conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos são descritos em detalhes abaixo.

Se desejado, as composições de colágeno da presente invenção podem também ser processadas por fibrilação. A fibrilação pode ser realizada por qualquer técnica para fibrilação de colágeno conhecida por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é fibrilada em 3-3,5 mg/ml de colágeno, 30 mM de fosfato de sódio, pH 7,2, em cerca de 32°C por cerca de 20-24 horas. A fibrilação de composições de colágeno é descrita extensivamente nas Patentes US 4,511,653, 4,582,640 e 5,436,135, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência. Se necessário, a composição de colágeno pode ser concentrada de acordo com técnicas padrão antes da fibrilação. Opcionalmente, a composição de colágeno pode ser lavada uma ou mais vezes, por exemplo, em 20 mM Na2P04, pH 7.4, 130 mM NaCl.

Quando desejado, as composições de colágeno da presente invenção podem ser reticuladas. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é fibrilada antes da reticulação, A reticulação pode ser com qualquer reticulador conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, os reticuladores discutidos na seção acima. Em certas formas de realização, o reticulador pode ser glutaraldeído, e a reticulação pode ser realizada de acordo com os métodos de reticulação com glutaraldeído de colágeno conhecidos por aqueles versados na técnica. Em outras formas de realização, o reticulador pode ser 1,4-butanodiol diglicidil éter ou genipina. Em formas de realização particulares, o reticulador é 1,4-butanodiol diglicidil éter.

A reticulação pode ser realizada por técnicas aparentes para aqueles versados na técnica ou aquelas descritas aqui. Em certas formas de realização, cerca de 0,1:10 a 10:0,1 de 1,4-butanodiol diglicidil éter são usados em relação à quantidade de colágeno em uma base em peso. Em certas formas de realização, a relação é 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ou 10:1. Em certas formas de realização, a relação é 4:1 de BDDE : colágeno em uma base em peso. Técnicas padrão podem ser usadas para reticulação, por exemplo, incubação com BDDE a 250C por cerca de 24 horas ou até que o pH da solução alcance 10,0 a 10,5.

Embora a reticulação possa ocorrer sem a adição de um catalisador, em certas formas de realização, o uso de catalisador pode vantajosamente acelerar a reação. Qualquer catalisador conhecido por alguém versado na técnica para promover reação entre um grupo reativo no reticulador, tal como um grupo epoxi ou um grupo aldeído, e um grupo funcional em um colágeno, tal como grupo amina, carboxila ou hidroxila, pode ser usado. Tais catalisadores incluem ácidos de Lewis e bases de Lewis. Exemplos incluem aminas terciárias: trietilamina, piridina, 1,4-diazabiciclo [2.2.2]octano (DABCO) e 4-diinatilaminopiridina (DMAP). O catalisador pode também ser uma base inorgânica, tal como hidróxido de sódio ou potássio. Outros compostos, tais como sais de organoborato tetra-substituídos são também aplicáveis, tais como brometo de etil trifenil fosfônio. Em formas de realização particulares, a reação de reticulação é catalisada por um catalisador, tal como piridina.

Em algumas formas de realização, uma ligação covalente entre um reticulador e um colágeno pode ser reduzida, por exemplo, para melhorar a estabilidade. A redução pode ser realizada pelo contato da composição de colágeno da presente invenção com qualquer agente de redução conhecido por aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o agente de redução é boroidreto de sódio, bissulfito de sódio, β-mercaptoetanol, ácido mercaptoacético, mercaptoetilamina, benzil mercaptan, tiocresol, ditiotreitol ou uma fosfina, tal como tributilfosfina. Boroidreto de sódio é um exemplo útil. Em certas formas de realização, o colágeno é reticulado antes da redução com o agente de redução. A redução de composições de colágeno e composições de colágeno reticuladas é descrita extensivamente nas Patentes US 4.185.011, 4.597.762, 5.412.076 e 5.763.579, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência.

Em certas formas de realização, quando uma composição compreendendo colágeno e ácido hialurônico for desejada, a composição de colágeno pode ser preparada pelo contato do colágeno com ácido hialurônico de acordo com qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica. As técnicas para a preparação de composições de colágeno também compreendendo ácido hialurônico sem reticulação são descritas extensivamente nas Patentes US 4,803,075 e 5,137,875, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência. Se a reticulação for desejada, a reticulação pode ser realizada de acordo com os métodos descritos aqui. Em certas formas de realização, o colágeno é reticulado antes de contatar com o ácido hialurônico. Em outras formas de realização, o ácido hialurônico é reticulado antes de contatar o colágeno. Em certas formas de realização, o colágeno e o ácido hialurônico são reticulados antes de se contatarem. Em certas formas de realização, o colágeno e o ácido hialurônico são contatados e então reticulados na mesma composição. Qualquer destas composições pode ser também reduzida de acordo com os métodos descritos aqui, como será aparente para alguém versado na técnica.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser também processada por cisalhamento mecânico de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. As técnicas de cisalhamento exemplares são descritas na Patente US 4.642.117, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é cisalhada com um homogeneizador de tecido conhecido por aqueles versados na técnica.

Em certas formas de realização, a etapas podem ser tomadas para limitar a atividade de protease nas composições de colágeno da presente invenção. Aditivos, tais como quelantes de íon metálico, por exemplo, 1,10- fenantrolina e ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), criam um ambiente desfavorável para muitas enzimas proteolíticas. O fornecimento de condições sub-ótimas para proteases, tais como colagenase, pode ajudar na proteção das composições de colágeno contra degradação. As condições sub-ótimas para proteases podem ser alcançadas pela formulação das composições para eliminar ou limitar a quantidade de íons de cálcio e zinco disponíveis na solução. Muitas proteases são ativas na presença de íons de cálcio e zinco e perdem muito de sua atividade em ambientes livres de íons de cálcio e zinco. Vantajosamente, uma composição de colágeno vai ser preparada selecionando-se condições de pH, disponibilidade reduzida de íons de zinco e cálcio, presença de quelantes de íon de metal e o uso de inibidores proteolíticos específicos para colagenase. Por exemplo, uma composição de colágeno pode incluir uma solução tamponada de água, pH 5,5 a 8, ou pH de 7 a 8, livre de íons de cálcio e zinco e incluindo um quelante de íon de metal, tal como EDTA. Adicionalmente, o controle dos parâmetros de temperatura e tempo durante o tratamento de uma composição de colágeno pode também ser empregado para limitar a atividade de proteases.

4.4 Caracterização da composição de colágeno

4.4.1 Caracterização Bioquímica

Os ensaios baseados em bioquímica conhecidos na técnica e exemplificados aqui podem ser usados para determinar as composições bioquímicas das composições de colágeno da presente invenção. A presente invenção engloba ensaios baseados em bioquímica para a determinação do teor de proteína total de uma amostra, tal como, por exemplo, ensaios baseados em absorbância e ensaios baseados em colorimétricos. Os ensaios baseados em absorbância incluem, mas não estão limitados a, ensaios que medem absorbância a 280 nm (ver, e.g., Layne, E, Spectrophotometric and Turbidimetrie Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzynology 3: 447-455, (1957); Stoscheck; CM, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990); que são incorporadas aqui como referência), 205 nm, e ensaios baseados no coeficiente de extinção da amostra (ver, e.g., Scopes, RIK, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); Stoscheck, CM. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990); que são incorporadas aqui como referência). A presente invenção engloba métodos para a determinação do teor total de proteína específica nas composições de colágeno da presente invenção, que incluem, mas não estão limitadas a, colágeno (e.g., colágeno tipo I, tipo III, tipo IV), laminina, elastina, fibronectina, e glicosaminoglican.

Os ensaios baseados em colorimétricos incluem, mas não estão limitados a, ensaio de Lowry modificado, ensaio de biureto, ensaio de Bradford, ensaio de ácido bicinconínico (Smith) (ver, e.g., Stoscheck, CM, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-59 (1990)).

Em uma forma de realização específica, a medição do teor de proteína total de uma composição de colágeno da presente invenção usando um ensaio de ligação de corante de Bradford (Bradford, M., Analytical Biochernistry, 72, 248 (1976), que é incorporada aqui como referência). Um ensaio de Bradford exemplar para uso nos métodos da presente invenção pode compreender o seguinte: o ensaio pode ser realizado usando o ensaio de ligação de corante de Bradford disponibilizado pela BIO-RAD, Basedmond, CA, USA. O ensaio de proteína é baseado na mudança na cor do corante Coomasie Brilliant Blue 8-250 em resposta às diferentes concentrações de proteína. O ensaio envolve o desenvolvimento de uma curva de calibração padrão pela medição da absorbância (em 595 nm) de uma série de padrões de colágeno humano de concentrações conhecidas. A concentração de colágeno em uma amostra de teste, por exemplo, amostra da membrana amniótica, é determinada pela referência à curva padrão. O ensaio é desenvolvido em um formato padrão que permite a medição da concentração de colágeno na faixa de 0,2 - 1,4 mg/ml e como um microensaio que mede concentração de proteína até 25 μg. Para o ensaio padrão, é retirada uma alíquota de colágeno dissolvido em ácido cítrico em 100 mM (pH 2,4) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml em concentrações de 0,1 - 1 mg/ml em um volume total de 0,1 ml. A cada tubo, 1 ml do corante Coomasie Blue é adicionado. As amostras são misturadas com a formação de um vórtex e deixadas descansar à temperatura ambiente por 10 minutos. A absorbância é medida em 595 nm. Para o microensaio, é retirada uma alíquota de colágeno dissolvido em ácido cítrico 100 mM (pH 2,4) em poços de uma placa de 96 poços em um volume total de 0,1 ml (2,5 - 30 μ§/ηι1). A cada poço, 10 μl de reagente de corante são adicionados. As amostras são misturadas, incubadas à temperatura ambiente por dez minutos antes da medição da absorbância em uma leitora de placa em 595 nm. Para uma composição de colágeno da presente invenção, as amostras de teste podem ser avaliadas em triplicata. As concentrações de proteína são determinadas pela referência à curva padrão. A concentração de proteínas é calculada como uma percentagem do peso seco total da membrana. Dentro de uma margem de erro de cerca de 10%, o teor de proteína em cada membrana é essencialmente 95% ou mais do peso seco total da membrana. O teor de água pode ser baixo e dentro do erro experimental (cerca de 10%).

A estimativa do teor de colágeno total das composições de colágeno da presente invenção pode ser caracterizada usando métodos conhecidos por alguém versado na técnica e exemplificados aqui. Em uma forma de realização específica, o teor de colágeno de uma composição de colágeno da presente invenção é medido usando um kit de ensaio baseado em corante quantitativo (SIRCOL) fabricado por Biocolor Ltd, UK. O ensaio utiliza Sirius Red (ou Direct Red 80) como um corante de ligação de colágeno específico. O corante ligado ao colágeno exibe uma concentração dependente do aumento na absorbância em 540 nm em um espectrofotômetro de UV-vis. O ensaio envolve o desenvolvimento de uma curva de calibração padrão pela medição de absorbâncias de uma série de padrões de colágeno bovino de concentrações conhecidas. A concentração de colágeno em uma amostra de teste, por exemplo, amostra de membrana amniótica, é determinada pela referência à curva padrão. Em um ensaio exemplar,é retirada uma alíquota de colágeno (1 mg/ml) em tubos de microcentrífiiga de 1,5 ml em concentrações de 5-100 μg/100 μl. Os volumes das amostras são ajustados para 100 μl com água. A cada amostra, 1 ml de reagente de corante SIRCOL é adicionado à temperatura ambiente. Os tubos de amostra são tampados e deixados incubar à temperatura ambiente com agitação mecânica por 30 min. As amostras são então centrifugadas a 12.000 X g por 15 minutos e líquido é drenado usando uma pipeta. O precipitado avermelhado no fundo de cada tubo é dissolvido em 1 ml de NaOH 0,5 M (hidróxido de sódio). A absorbância de UV para as amostras é medida em 540 nm usando um espectrofotômetro Beckman DU- 7400 UV-VIS. A curva de calibração padrão é plotada usando a concentração de colágeno em cada amostra versus a absorbância (OD) a 540 nm. Para determinar erro experimental, o ensaio é repetido (n = 10) em uma concentração baixa única de colágeno padrão (10 μg/100 μΐ). A amostra de membrana é testada usando o mesmo protocolo, com a amostra sendo adicionada em um volume total de 100 μΐ.

Em ainda outras formas de realização, para determinar os tipos de colágeno das composições de colágeno da presente invenção usando métodos padrão conhecidos na técnica e exemplificados aqui, e.g., ensaio ELISA, podem ser empregados. Uma amostra exemplar para a determinação dos tipos de colágeno, e.g., colágenos dos Tipos I, III e IV, em uma composição de colágeno da presente invenção compreende o uso de um ensaio ELISA de sanduíche fornecido, por exemplo, como um kit pela Anthrogen-CIA Collagen-I da Chondrex, Inc., Redrnond, WA, USA. Para os estudos dos Tipos III e IV, os anticorpos primário (anticorpo de captura) e secundário (anticorpo de detecção) e padrões de colágeno podem ser obtidos pela Rockland Inlmunochemicals, Gilbertsville, PA. O anticorpo de detecção é um colágeno humano biotinilado dos Tipos I, III ou IV, que se liga a estreptavidina peroxidase. A reação enzimática com um substrato cromogênio e uréia e H2O2 dá uma cor amarela, que é detectada através de espectroscopia de UV-vis em 490 nm. Para quantificar a quantidade de um tipo de colágeno, uma curva de calibração padrão é desenvolvida com uma amostra de uma série de padrões de colágeno humano de concentrações conhecidas. A concentração de colágeno em uma amostra de teste de membrana amniótica é determinada por referência à curva padrão. Os protocolos de ensaio são desenvolvidos conforme as recomendações do kit ELISA. Para desenvolver uma curva de calibração padrão, 10-12 poços em uma bandeja de 96 poços são revestidos com o anticorpo de captura (anticorpo de colágeno tipo I anti- humano, não conjugado) pela adição de 100 μl de um anticorpo de captura diluído 100x fornecido com o kit. Após a incubação durante a noite, os poços são lavados três vezes com um tampão de lavagem para remover anticorpo não ligado. Colágeno Humano Tipo I é então adicionado aos poços em concentração crescente de 0-5 μg/ml em um volume de 100 μl. Após uma incubação de duas horas à temperatura ambiente, os poços são lavados com o tampão de lavagem três vezes para remover colágeno não ligado. O anticorpo de Colágeno I biotinilado é então adicionado ao complexo anticorpo-colágeno nos poços em um volume de 100 μl e deixado se ligar à temperatura ambiente por duas horas. O anticorpo não ligado é lavado com três lavagens com o tampão de lavagem. A enzima de detecção streptavidina peroxidase é então ligada ao complexo anticorpo-colágeno-anticorpo pela adição de uma amostra diluída 200x da enzima fornecida com o kit e permitindo se incubar à temperatura ambiente por uma hora. A placa de 96 poços é lavada repetidamente (seis vezes) para remover qualquer enzima não ligada. O substrato cromogênico + uréia/H202 é adicionado a cada um dos poços em um volume de 100 μl. A reação é deixada ocorrer por 30 minutos à temperatura ambiente. A reação é terminada pela adição de 50 μl de ácido sulfurico 2,5 N. A absorbância é medida a 490 nm.

Em ainda outras formas de realização, a presente invenção engloba ensaios para a determinação do teor total de elastina das composições de colágeno da presente invenção usando métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui. Um ensaio exemplar para a medição do teor de elastina de uma composição de colágeno da presente invenção pode compreender um kit de ensaio baseado em corante quantitativo (FASTIN) fabricado por Biocolor Ltd, UK. O ensaio utiliza 5,10,15,20- tetrafenil21,23-porfrina (TPPS) como um corante de ligação de elastina específico (ver, e.g., Winkleman, J. (1962), Câncer Research, 22,589-596, que é incorporada aqui como referência). O corante ligado a elastina exibe um aumento na absorbância dependente da concentração em 513 nm em um espectrofotômetro UV-Vis. O ensaio envolve o desenvolvimento de uma curva de calibração padrão pela medição das absorbâncias de uma série de padrões de elastina bovina de concentrações conhecidas. A concentração de elastina em uma amostra de teste, por exemplo, amostra da membrana amniótica, é determinada por referência à curva padrão. É retirada uma alíquota de elastina (1 mg/ml) e colocada em tubos de microcentrífuga com 1,5 ml em concentrações de 5-100 μg / 100 μΐ. Os volumes das amostras são ajustados até 100 μΐ com água. A cada amostra 1 ml de Reagente de precipitação de elastina (ácido tricloroacético + arginina) é adicionado a 4°C e armazenado durante a noite na mesma temperatura. Após a etapa de precipitação durante a noite, as amostras são centrifugadas a 12.000 χ g por 15 minutos e líquido é drenado usando uma pipeta. A cada amostra, 1 ml do reagente de corante FASTIN (TPPS) é adicionado com 100 μΐ de uma solução saturada de sulfato de amônio a 90%. Os tubos de amostra são tampados e deixadas incubar à temperatura ambiente com agitação mecânica por 1 hora. O sulfato de amônio serve para precipitar o complexo elastina-corante. Após a misturação por 1 h, as amostras são centrifugadas a 12.000 χ g por 15 minutos e líquido é drenado usando uma pipeta. O precipitado marrom no fundo de cada tubo é dissolvido em 1 ml de reagente de dissociação FASTIN que é uma solução de guanidina HCl em 1-propanol. A absorbância de UV para as amostras é medida em 513 nm usando um espectrofotômetro Beckman DU- 7400 UV-VIS. A curva de calibração padrão é plotada usando a concentração de elatina em cada amostra versus a absorbância (OD) a 513 nm. Para determinar erro experimental no ensaio, o ensaio é repetido (n = 10) em uma concentração baixa única de elastina padrão (10 μ§/100 μΐ). A amostra de membrana é retirada usando o mesmo protocolo, com a amostra sendo adicionada em um volume total de 100 μΐ. Cada amostra é avaliada em triplicata. Em outras formas de realização, a presente invenção engloba ensaios para a determinação do teor total de glicosaminoglican (GAGs) das composições de colágeno da presente invenção usando métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui. A presença de GAGs em uma composição de colágeno da presente invenção pode ser medida usando um kit de ensaio à base de corante quantitativo (BLYSCAN) fabricado por Biocolor, Ltd, UK. O ensaio utiliza 1,9-dimetil-metileno azul como um corante de ligação GAG específico. O corante ligado a GAG exibe um aumento dependente da concentração em absorbância a 656 nm em um espectrofotômetro UV-vis. O ensaio envolve o desenvolvimento de uma curva de calibração padrão pela medição de absorbâncias de uma série de padrões de GAG bovino de concentrações conhecidas. A concentração de GAG em uma amostra de teste de membrana amniótica é determinada por referência à curva padrão. É retirada uma alíquota de GAG bovino (0,1 mg/ml) e colocada em tubos de microcentrífuga com 1,5 ml em concentrações de 0,5-5 μg/100 μl. Os volumes das amostras são ajustados até 100 μl com água. A cada amostra 1 ml o reagente de corante 1,9-dimetil-metileno é adicionado à temperatura ambiente. Os tubos de amostra são tampados e deixados incubar à temperatura ambiente com agitação mecânica por 30 minutos. As amostras são então centrifugadas a 12.000 χ g por 15 minutos e líquido drenado usando uma pipeta. O precipitado avermelhado no fundo de cada tubo é dissolvido em 1 ml de um reagente de dissociação de corante. A absorbância de UV para as amostras é medida em 656 nm usando um espectrofotômetro Beckman DU-7400 UV-VIS. A curva de calibração padrão é plotada usando a concentração de GAG em cada amostra versus a absorbância (OD) a 540 nm. Para determinar erro experimental, o ensaio é repetido (n = 8) em uma concentração baixa única de GAG padrão (1 μg/100 μl). A amostra de membrana é testada usando o mesmo protocolo, com a amostra sendo adicionada em um volume total de 100 μl. Cada amostra é retirada em tripicata.

Em ainda outras formas de realização, a presente invenção engloba ensaios para a determinação do teor de laminina das composições de colágeno da presente invenção usando métodos padrão conhecidos na técnica e exemplificados aqui. Uma amostra exemplar para a determinação do teor total de lignina em uma composição de colágeno da presente invenção pode compreender o seguinte: um ensaio ELISA de sanduíche fornecido como um kit pela Takara Bio Inc., Shiga, Japão (Cal # MKI07) pode ser usado. O kit inclui uma placa com 96 poços pré-revestida com o primário (anticorpo de captura), que é um anticorpo monoclonal de murina para laminina humana. Os anticorpos secundários (anticorpos de detecção) e padrões de laminina humana são fornecidos como um kit. O anticorpo de detecção é um anticorpo de laminina humano conjugado com peroxidase. A reação enzimática com um substrato cromogênio tetrametilbenzidina e H2Oa dá uma cor azul, que é detectada através de espectroscopia de UV-vis em 450 nm. Para quantificar a quantidade de laminina, uma curva de calibração padrão é desenvolvida com uma amostra de uma série de padrões de colágeno humano de concentrações conhecidas (fornecidas com kit). A concentração de laminina em uma amostra de teste de membrana amniótica é determinada por referência à curva padrão. Os protocolos de ensaio são desenvolvidos conforme as recomendações do kit ELISA. Para desenvolver uma curva de calibração padrão, a laminina humana padrão é adicionada em concentrações aumentada de 5 ng/ml a 160 ng/ml em um volume final de 100 μΐ aos poços individuais de uma bandeja com 96 poços pré-revestida com anticorpos fornecida com um kit. Após a incubação por 1 hora à temperatura ambiente, os poços são lavados três vezes com um tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% Tween) para remover laminina não ligada. O anticorpo de laminina conjugado com peroxidase é então adicionado ao complexo de anticorpo-laminina nos poços em um volume de 100 μΐ e deixado se ligar à temperatura ambiente por 1 hora. A placa com 96 poços é lavada repetidamente (4x) para remover qualquer conjugado de enzima / anticorpo não ligado. O substrato cromogênio + H2O2 é adicionado a cada um dos poços em um volume de 100 μl. A reação é deixada ocorrer por 30 minutos à temperatura ambiente. A reação é terminada pela adição de 100 μΐ de ácido sulfórico 2,5 Ν. A absorbância é medida a 490 nm. As amostras de membrana solubilizada são testadas em uma concentração de 1000 ng/ml. Cada amostra de membrana é testada em triplicata. A concentração de laminina é apresentada como uma concentração de peso de membrana total como mostrado abaixo.

Em ainda outras formas de realização, a presente invenção engloba ensaios para a determinação do teor total de fibronectina total das composições de colágeno da presente invenção usando métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui. Um ensaio exemplar para a medição do teor de fibronectina de uma composição de colágeno da presente invenção pode compreender o seguinte: um ensaio ELISA de sanduíche fornecido como um kit pela Takara Bio Inc., Shiga, Japão (Cal # MKl 15) pode ser usado. O kit inclui uma placa com 96 poços pré-revestida com o primário (anticorpo de captura), que é um anticorpo monoclonal de murina para fibronectina humana. Os anticorpos secundários (anticorpos de detecção) e padrões de fibronectina humana são fornecidos como um kit. O anticorpo de detecção é um anticorpo de fibronectina humano conjugado com peroxidase de raiz forte. A reação enzimática com um substrato cromogênio tetrametilbenzidina e H2O2 dá uma cor azul, que é detectada através de espectroscopia de UV-vis em 450 nm. Para quantificar a quantidade de fibronectina, uma curva de calibração padrão é desenvolvida com uma amostra de uma série de padrões de fibronectina humana de concentrações conhecidas (fornecidas com kit). A concentração de fibronectina em uma amostra de teste de membrana amniótica é determinada por referência à curva padrão. Os protocolos de ensaio são desenvolvidos conforme as recomendações do kit ELISA. Para desenvolver uma curva de calibração padrão, a fibronectina humana padrão é adicionada em concentrações aumentadas de 12,5 ng/ml a 400 ng/ml em um volume final de 100 μl aos poços individuais de uma bandeja com 96 poços pré-revestida com anticorpos fornecida com um kit. Após a incubação por 1 hora à temperatura ambiente, os poços são lavados três vezes com um tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% Tween) para remover fibronectina não ligada. O anticorpo de fibronectina conjugado com peroxidase é então adicionado ao complexo de anticorpo-fibronectina nos poços em um volume de 100 μl e deixado se ligar à temperatura ambiente por 1 hora. A placa com 96 poços é lavada repetidamente (4x) para remover qualquer conjugado de enzima / anticorpo não ligado. O substrato cromogênio + H2O2 é adicionado a cada um dos poços em um volume de 100 μl. A reação é deixada ocorrer por 30 minutos à temperatura ambiente. A reação é terminada pela adição de 100 μl de ácido sulfurico 2,5 Ν. A absorbância é medida a 450 nm. As amostras de membrana solubilizada são testadas em uma concentração de 1000 ng/ml. Cada amostra de membrana é testada em triplicata.

4.4.2 Estudos de Biocompatibilidade

A composição de colágeno da presente invenção tem origem biológica e contém quantidades significativas de colágeno. Contudo, diferente de colágeno derivado de fontes animais (bovina e porcina), colágeno humano é não-imunogênico. Como tecido humano não-imunogênico é inerentemente biocompatível com outro tecido humano, não é necessário se realizar vários testes de biocompatibilidade padrão (e.g., irritação da pele e sensibilização, toxicidade sistêmica aguda). A presente invenção engloba ensaios para a determinação da biocompatibilidade da composição de colágeno da presente invenção. A biocompatibilidade, como usada aqui, se refere à propriedade de ser biologicamente compatível pela não produção de uma resposta tóxica, danosa ou imunológica ou rejeição no tecido vivo. A resposta a materiais desconhecidos é a principal preocupação quando se usam materiais artificiais no corpo e então a biocompatibilidade de um material é uma consideração de projeto importante em tais materiais. Os ensaios de biocompatibilidade englobados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, ensaios de citotoxicidade, testes de irritação de olho de coelho, ensaios de hemólise e ensaios de pirogenicidade. Os ensaios de biocompatibilidade da presente invenção são ensaios baseados em célula.

Em ainda outra forma de realização específica, a citotoxicidade da composição de colágeno da presente invenção é determinada usando um teste de Eluição ISO MEM (Exemplo 6.4.2.2). O propósito deste estudo é avaliar a capacidade de a composição de colágeno extrair uma resposta em células de fibroblasto de rato cultivadas. Em um ensaio exemplar, o meio essencial mínimo de Eagle (E-MEM) suplementado com 5% de Soro Bovino Fetal (FBS) é usado para extrair amostras de teste. O meio é também suplementado com um ou mais dos seguintes: L-glutamina, HEPES, gentamicina, penicilina, vancomicina, e anfotericina B (fungizona). As culturas de células L-929 (fibroblastos de rato) são crescidas e usadas como monocamadas em um dispositivo de laboratório de cultura de tecido descartável a 37 ± 1°C em uma atmosfera umedecida de 5 ± 1% de dióxido de carbono em ar. As amostras de teste são extraídas intactas usando uma relação equivalente de amostra de 120 cm2 e 20 ml de E-MEM plus 5% FBS. As amostras de teste são extraídas em E-MEM mais 5% de FBS a 37 ± 1°C em 5 ± 1% de dióxido de carbono por 24-25 horas. Após o período de extração, o meio de cultura de manutenção é removido dos poços da cultura de teste e substituído com 1 ml do meio / extrato de teste e meio /extratos de controle e meio de controle positivo misturado com cloreto de cádmio. Os controles positivo, intermediário e negativo são corridos em paralelo com as amostras de teste. O meio / extrato de teste e meio /extrato de controle e meio de controle positivo misturados com cloreto de cádmio são colocados em placa em triplicata e incubados 72 ± 4 horas a 37 ± 1°C em uma atmosfera umedecida de 5 ± 1% de dióxido de carbono em ar. As culturas são avaliadas quanto a efeitos citotóxicos por observação microscópica a 24, 48 e 72 ± 4 horas de incubação. Os critérios para a avaliação de citotoxicidade vão incluir alterações morfológicas nas células, tais como granulação, formação crenada ou arredondamento, e perda de células viáveis da monocamada por Iise ou destacamento. A validade do teste requer que as culturas de controle negativo mantenham uma aparência normal saudável durante todas a duração do teste. Os graus de toxicidade são classificados, como a seguir:

0 Nenhum. Grânulos intracitoplásmicos discretos; nenhuma lise de célula.

1 Leve. Não mais que 20% das células são redondas, destacadas, e sem grânulos intracitoplásmicos; células lisadas ocasionais estão presentes.

2 Suave. Não mais que 50% das células são redondas e sem grânulos citoplasmáticos; nenhuma Iise celular extensiva e áreas vazias entre as células.

3 Moderado. Não mais que 70% das camadas de células contêm células redondas e/ou são lisadas.

4 Severo. Destruição quase completa das camadas das células.

De acordo com USP, os artigos de teste com classificação "o", "1", ou "2" vão ser considerados não-tóxicos. os artigos de teste com classificação "3" ou "4" vão ser considerados tóxicos. A amostra de controle positivo deve ter uma classificação de "3" ou "4" e a amostra de controle negativo deve ter uma classificação de "o" para um teste válido.

A superfície ocular do coelho é conhecida por ser mais sensível do que a pele humana, portanto, estudos de irritação de pele de coelho são usados para avaliar a biocompatibilidade de uma composição de colágeno da presente invenção. Em uma amostra exemplar, amostras são tríadas para irritação ocular primária. A membrana amniótica é limpa usando uma solução aquosa de 0,05% de sal de sódio de ácido deoxicólico monoidratado (Célula D). O teste pode ser conduzido de acordo com as linhas guia das Regulamentações da Federal Hazardous Substances Act (FHSA), 16 CFR 1500. Em um ensaio exemplar, os olhos de controle são julgados clinicamente normais para coelhos por exame com o auxílio de uma fonte de luz. Para detectar qualquer dano na córnea pré-existente, os olhos são tratados com mancha de fluoresceína, lavados com solução de soro fisiológico (PSS) 0,9% USP, e observados com luz ultravioleta em um ambiente escurecido. Uma amostra é vertida no saco conjuntivo inferior de um olho de cada coelho de acordo com técnicas padrão. O olho oposto de cada coelho permanece não tratado e serve como o controle comparativo. Os animais são retornados para suas gaiolas após o tratamento. Em 24, 48 e 72 horas após a dosagem, o olho de teste de cada coelho é examinado com uma fonte de luz auxiliar e ampliação apropriada quando comparada com o olho de controle não tratado, e graduado para irritação ocular. Para detectar ou confirmar o dano na córnea, os olhos de teste são tratados com mancha de fluoresceína, jateados com PSS, e examinados em condições escurecidas com uma lâmpada ultravioleta em 24 horas. As reações são classificadas de acordo com os critérios de classificação de Draise modificado por FHSA. Um dos três animais que exibem reação positiva significativa é uma verificação de limite. Dois dentre os três animais que exibem uma reação positiva significativa é uma resposta positiva significativa e o artigo de teste é considerado um irritante.

A presente invenção engloba a determinação das propriedades hemolíticas de uma composição de colágeno da presente invenção usando métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui (ver Exemplo 6.4.2.4). A Hemólise descreve as propriedades hemolíticas de uma amostra de teste que vai contatar o sangue. É considerado como um teste de triagem especialmente significativo para realizar porque ele mede a fragilidade da membrana celular do sangue com materiais e dispositivos. Em um ensaio exemplar, o procedimento envolve a exposição do material de teste a uma suspensão de célula de sangue e então a determinação da quantidade de hemoglobina liberada. O teste é realizado sob condições estáticas com contato direto da amostra de teste com sangue humano. A quantidade de hemoglobina liberada pelas células vermelhas do sangue é medida espectrofotometricamente em 540 nm (após a conversão em cianometemoglobina) concorrentemente com os controles negativo e positivo.

O índice hemolítico para as amostras e controles é calculado a seguir:

índice hemolítico = Hemoglobina liberada (mg/ml) χ 100

Hemoglobina presente (mg/ml)

Onde: Hemoglobina liberada (mg/ml) = (constante + coeficiente Χ) χ densidade óptica χ 16. Hemoglobina present5e (mg/ml) = sangue diluído 10 ± 1 mg/ml.

A presente invenção engloba métodos para a determinação da pirogenicidade da composição de colágeno da presente invenção usando métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui (ver exemplo 6.4.2.5). Em uma forma de realização, a pirogenicidade da composição de colágeno da presente invenção é determinada pela medição da presença de endotoxina bacteriana na composição de colágeno da presente invenção usando, por exemplo, o teste de Liminus Amebocyte Lysate (LAL). Este teste é um ensaio in vitro para a detecção e quantificação de endotoxina bacteriana. Em um teste exemplar, noventa e oito amostras da composição de colágeno (η = 1 por lote), cada um medindo 1x2 cm, são testadas individualmente para extração. As extrações são realizadas pela lavagem de cada amostra em 30 ml de fluido de extração por 40 a 60 minutos a 37 a 40°C com redemoinho intermitente em um chacoalhador orbital. O pH de cada extrato de amostra está entre 6 e 8 quando verificado com papel de pH. Os níveis de pirogênio são medidos por um Teste Colorimétrico Turbidimétrico Cinético com uma sensibilidade de teste de 0,05 Unidades de Endotoxina (EU) por ml. O nível de endotoxina total por amostra é calculado pela multiplicação do valor de endotoxina detectado (EU/ml) por 30 ml (volume de extração por dispositivo) e novamente por vinte e quatro horas (para simular um dispositivo com tamanho 6 χ 8).

4.4.3 Estudos de microbiológicos

A presente invenção engloba métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui para determinar a presença de organismos microbiológicos que incluem, mas não estão limitados a, Escherichia coli, Klebsiella pneumonias, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, e Pseudomonas aeruginosa em uma composição de colágeno da presente invenção. Tais métodos podem ser usados em qualquer etapa da preparação da composição de colágeno. Um processo exemplar para estudos de microbiologia durante o processamento compreende o seguinte: Teste de amostras microbiologicamente marcadas de membrana amniótica não processada e equipamento usado durante o processamento. As amostras são imergidas por cinco minutos em solução salina marcada com oito microorganismos como a seguir para deliberadamente contaminar a amostra:

1. Escherichia coli 5. Candida albicans

2. Klebsiella pneumonias 6. Proteus vulgaris

3. Staphylococcus aureus 7. Staphylococcus viridans

4. Enterococcus faecalis 8. Pseudomonas aeruginosa

Vantajosamente, os métodos de descelularização e rinsagem da presente invenção podem reduzir o número de microorganismos na composição de colágeno da presente invenção.

A presente invenção engloba métodos conhecidos na técnica e exemplificados aqui para determinar o bioburden das composições de colágeno da presente invenção. Como usado aqui, "bioburden" é uma medida dos organismos contaminantes encontrados em uma dada quantidade de material antes de se submeter a um processo de esterilização industrial. Em um método exemplar, a dose de radiação de feixe de E mínima que alcançaria a esterilidade com um Nível de Asseguração de Esterilização de 10-6 é determinada. As membranas são extraídas por imersão e chacoalhamento manual usando uma solução Peptone-Tween®. O método de deposição é filtração por membrana usando agar de digestão de feijão-soja-caseína. As placas em condições aeróbicas são incubadas 4 dias a 30-3 50C e depois numeradas. Para fungos, placas são incubadas quatro dias a 20-25°C e depois numeradas. Para bactérias de formação de esporos, a porção de extrato é aquecida, filtrada e colocada em placa para bactérias aeróbicas. As placas são incubadas 4 dias a 30-3 5°C, depois numeradas para bactérias anaeróbicas, as placas foram incubadas sob condições anaeróbicas por 4 dias a 3 0-3 5°C, depois numeradas. Os microorganismos utilizados são Clostridiuin sporogenes, pseudomonos aeruginosa, Bacillus atrophaeus.

Em formas de realização particulares, as composições de colágeno da presente invenção têm menos que 2 Unidades de Formação de Colônia (cfu) para aeróbicos e fungos, menos que 1, ou zero cfu para aeróbicos e fungos. Em ainda outras formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção têm menos que 5,1 Unidades de Formação de Colônia (cfu), menos que 2 ou menos que 1 cfu para anaeróbicos e esporos.

Em formas de realização particulares, a composição de colágeno da presente invenção não é bacteriostática ou fungiostática quando determinado usando métodos exemplificados aqui e conhecidos por alguém versado na técnica (ver Exemplo 6.4.3.2). Como usado aqui, bacteriostático se refere a um agente que inibe o crescimento ou reprodução bacteriana, mas não mata as bactérias. Como usado aqui, fungiostático se refere a um agente que evita o crescimento de um fungo pela presença de um composto químico ou físico não-fungicida. 4.4.4 Armazenagem e Manuseamento da Composição de Colágeno

A presente invenção engloba a armazenagem da composição de colágeno da presente invenção à temperatura ambiente (e.g., 25°C). Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção pode ser armazenada em uma temperatura de pelo menos 0°C, pelo menos 4°C, pelo menos 10°C, pelo menos 15°C, pelo menos 20°C, pelo menos 25°C, pelo menos 30°C, pelo menos 35°C ou pelo menos 40°C. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção não é refrigerada. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção pode ser refrigerada em uma temperatura de cerca de 2 a 8°C. Em outras formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção pode ser armazenada em qualquer uma das temperaturas identificadas acima por um período de tempo prolongado. Em uma forma de realização particular, a composição de colágeno da presente invenção é armazenada sob condições estéreis e não oxidantes. Em certas formas de realização, a composição de colágeno produzida de acordo com os métodos da presente invenção pode ser armazenada em qualquer das temperaturas especificadas por 12 meses ou mais sem alteração na integridade bioquímica ou estrutural (e.g., sem degradação), sem qualquer alteração das propriedades bioquímicas ou biofísicas da composição de colágeno. Em certas formas de realização, a composição de colágeno produzida de acordo com a presente invenção pode ser armazenada por vários anos sem alteração na integridade bioquímica ou estrutural (e.g., sem degradação), sem qualquer alteração das propriedades bioquímicas ou biofísicas da composição de colágeno. Em certas formas de realização, é esperado que a composição de colágeno da presente invenção preparada de acordo com os métodos da presente invenção dure indefinidamente. A composição de colágeno pode ser armazenada em qualquer recipiente adequado para armazenagem de longo prazo. Vantajosamente, a composição de colágeno da presente invenção pode ser armazenada em um pacote de bolsa de dupla camada estéril. 4.4.5 Esterilização

As composições de colágeno da presente invenção podem ser esterilizadas de acordo com técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica para esterilização de tais composições. Em certas formas de realização, as composições da presente invenção são filtradas através de filtros apropriados para produzir composições esterilizadas seguidas por tratamento sob condições assépticas. Os filtros úteis incluem filtros com 0,22 μm e 0,1 μm, e outros filtros reconhecidos por aqueles versados na técnica para esterilização.

Além disso, em certas formas de realização da presente invenção, uma composição de colágeno é filtrada para remover vírus e/ou endotoxinas. Em algumas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção é filtrada de acordo com técnicas padrão. Em outras formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada para remover vírus e/ou endotoxinas de acordo com as técnicas fornecidas aqui.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno é filtrada através de um filtro que permite a passagem de endotoxinas e retém a composição de colágeno. Qualquer filtro de um tamanho, por exemplo de 30 kDa, conhecido por aqueles versados na técnica para filtração de endotoxinas pode ser usado. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é contatada com o filtro sob condições que permitem que as endotoxinas passem através do filtro enquanto retém a composição de colágeno. As condições podem ser quaisquer condições para filtração conhecidas por aqueles versados na técnica, por exemplo, centrifugação ou bombeamento. O filtro deve ter um tamanho que retenha colágeno, ao mesmo tempo que permite que endotoxinas passem pelo filtro. Em certas formas de realização, o filtro é entre 5 kDa e 100 kDa. Em formas de realização particulares, o filtro é cerca de 5 kDa, cerca de 10 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 30 kDa, cerca de 40 kDa, cerca de 50 kDa, cerca de 60 kDa, cerca de 70 kDa, cerca de 80 kDa, cerca de 90 kD ou, cerca de 100 kDa. O filtro pode ser de qualquer material conhecido por alguém versado na técnica como sendo compatível com uma composição de colágeno, tal como celulose, poliétersulfona e outros aparentes para aqueles versados na técnica. A filtração pode ser repetida tantas vezes quanto desejado por alguém versado na técnica. A endotoxina pode ser detectada de acordo com as técnicas padrão para eliminação monitorada.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno pode ser filtrada para gerar composições de colágeno livres de, ou reduzidas em, partículas virais. Vantajosamente, nestas formas de realização da presente invenção, o filtro retém uma composição de colágeno enquanto permite que as partículas virais passem. Qualquer filtro conhecido por aqueles versados na técnica que são úteis para eliminar vírus pode ser usado. Por exemplo, um filtro 1000 kDa pode ser usados para eliminação, ou redução, de parvovírus, vírus da hepatite A e HIV. Um filtro de 750 kDa pode ser usado para eliminação, ou redução, de parvovírus e vírus da hepatite A. Um filtro de 500 kDa pode ser usado para eliminação, ou redução, de parvovírus.

Com isso, a presente invenção fornece métodos de produção de composições de colágeno livres de, ou reduzidas em partículas virais, compreendendo a etapa de contatar uma composição de colágeno com um filtro de um tamanho que permite que uma ou mais partículas virais passem através do filtro, ao mesmo tempo que retém a composição de colágeno. Em certas formas de realização, a composição de colágeno é contactada com o filtro sob condições que permitem que uma ou mais partículas virais passem através do filtro enquanto retém uma composição de colágeno. As condições podem ser quaisquer condições para a filtração conhecidas por aqueles versados na técnica, por exemplo, centrifugação ou bombeamento. O filtro deve ter um tamanho que retenha colágeno ao mesmo tempo que permite que uma ou mais partículas virais passem pelo filtro. Em certas formas de realização, o filtro tem um tamanho entre 500 kDa e 1000 kDa. Em formas de realização particulares, o filtro tem cerca de 500 kDa, cerca de 750 kDa ou cerca de 1000 kDa. O filtro pode ser de qualquer material conhecido por aqueles versados na técnica compatível com uma composição de colágeno, tal como celulose, poliétersulfona e outros aparentes para aqueles versados na técnica. A filtração pode ser repetida tantas vezes quanto desejado por alguém versado na técnica. As partículas virais podem ser detectadas de acordo com técnicas padrão para monitorar a filtração.

A esterilização de uma composição de colágeno da presente invenção pode também ser realizada por irradiação de feixe de elétrons usando métodos conhecidos por alguém versado na técnica, e.g., Gorham, D. -35-Byrom (ed), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122. Qualquer dose de radiação suficiente para matar pelo menos 99,9% de bactérias ou outros organismos potencialmente contaminantes está dentro do escopo da presente invenção. Em uma forma de realização, uma dose de pelo menos 18-25 kGy é usada para alcançar a esterilização terminal de uma composição de colágeno da presente invenção.

A esterilização de uma composição de colágeno da presente invenção pode também ser realizada pelo contato da composição de colágeno com uma solução básica usando métodos conhecidos por alguém versado na técnica. A solução básica pode ser qualquer solução básica conhecida por alguém versado na técnica. Em particular, qualquer base em qualquer pH conhecido para remover partículas virais pode ser usada. As bases particulares para a lavagem básica incluem bases biocompatíveis, bases voláteis e bases conhecidas por aqueles versados na técnica como sendo fácil e seguramente removidos da composição de colágeno. Em certas formas de realização, a base pode ser qualquer base orgânica ou inorgânica conhecida por aqueles versados na técnica em uma concentração de, por exemplo, 0,2-1,0 M. Em certas formas de realização, o tratamento com base é realizado em solução de hidróxido de sódio. A solução de hidróxido de sódio pode ser NaOH 0,1M, NaOH 0,25M, NaOH 0,5M, ou NaOH 1M. Em formas de realização particulares, a composição de colágeno é contatada com NaOH O, IM ou 0,5M.

O tratamento de base pode ser realizado em quaisquer condições adequadas para remover partículas virais e manter a qualidade do colágeno de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser contatada com uma solução básica em uma temperatura adequada por um tempo adequado.

Em certas formas de realização, o tratamento de base é realizado em cerca de 0-30°C, cerca de 5-25°C, 5-20°C, ou 5°-15°C. Em certas formas de realização, o tratamento de base é realizado em cerca de 0°C, cerca de 5°C, cerca de 10°C, cerca de 15°C, cerca de 20°C, cerca de 23°C, cerca de 25 °C, ou cerca de 30°C.

O tratamento de base pode ser realizado por um tempo adequado de acordo com o julgamento daqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, o tratamento básico pode ser realizado por cerca de 0,25-24 horas, 2-20 horas, 5-15 horas, 8-12 horas, 2-5 horas, 1-4 horas, ou 0,25-1 hora.

4.5 Formulações das Composições de Colágeno

Em certas formas de realização, a presente invenção fornece composições de colágeno injetáveis. O colágeno pode ser qualquer colágeno da presente invenção, por exemplo, colágeno fibrilado reticulado preparado por um dos métodos aqui. Vantajosamente, o colágeno pode ser formulado em água.

O colágeno pode estar em qualquer concentração útil para aqueles versados na técnica. Em certas formas de realização, as formulações da presente invenção compreendem 0,1 - 100 mg/ml, 1-100 mg/ml, 1-75 mg/ml, 1-50 mg/ml, 1-40 mg/ml, 10-40 mg/ml ou 20-40 mg/ml de colágeno. Em certas formas de realização, as formulações da presente invenção compreendem cerca de 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/Ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml ou 50 mg/ml de colágeno. Em uma forma de realização particular, a presente invenção fornece formulações que compreendem cerca de 35 mg/ml de colágeno.

Em certas formas de realização, as composições da presente invenção podem ser combinadas com carreadores farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis e administradas como composições in vitro ou in vivo. As formas de administração incluem, mas não estão limitadas a, injeções, soluções, cremes, géis, implantes, bombas, ungüentos, emulsões, suspensões, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas, lipossomas, pastas, emplastros, tabletes, dispositivos de fornecimento transdérmico, aspersões, aerossóis, ou outros meios familiares para alguém versado na técnica. Tais carreadores farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis são comumente conhecidos por alguém versado na técnica. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas por procedimento conhecidos na técnica usando ingredientes conhecidos e prontamente disponíveis. Por exemplo, os compostos podem ser formulados com excipientes, diluentes ou carreadores comuns e formados em tabletes, cápsulas, suspensões, pós, e semelhantes. Exemplos de excipientes, diluentes, e carreadores que são adequados para tais formulações incluem os seguintes: cargas e extensores (e.g., amido, açúcares, manitol, e derivados silícicos); agentes de ligação (e.g., carboximetil celulose e outros derivados de celulose, alginatos, gelatina, e polivinil-pirrolidona); agentes umectantes (e.g., glicerol); agentes desintegrantes (e.g., carbonato de cálcio e bicarbonato de sódio); agentes para retardar dissolução (e.g., parafina); aceleradores de ressorção (e.g., compostos de amônio quaternário); agentes ativos na superfície (e.g., álcool cetílico, monoestearato de glicerol); carreadores adsorvedores (e.g., caulim e bentonita); emulsificantes; conservantes; adoçantes; estabilizantes; agentes colorantes; agentes de perfume; agentes flavorizantes; lubrificantes (e.g., talco, cálcio e estearato de magnésio); polietil glicóis sólidos; e misturas destes.

Os termos "carreador farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável" ou "veículo farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável" são usado aqui para significar, sem limitações, qualquer líquido, sólido ou semi- sólido, que incluem, mas não estão limitados a, água ou solução salina, um gel, creme, solvente, diluente, base de ungüento fluido, ungüento, pasta, implante, lipossoma, micela, micela gigante, e semelhante, que é adequado para uso em contato com tecido de humano ou animal vivo sem causar respostas cosméticas ou fisiológicas adversas, e que não interage com os outros componentes da composição em uma maneira prejudicial. Outros carreadores ou veículos farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis conhecidos por alguém versado na técnica podem ser empregados para fazer composições para o fornecimento das moléculas da presente invenção.

As formulações podem ser constituídas de forma que elas liberem o ingrediente ativo somente ou preferivelmente em um local particular, possivelmente durante um período de tempo. Tais combinações fornecem ainda um outro mecanismo para controle de cinéticas de liberação. Os revestimentos, envelopes, e matrizes protetoras podem ser feitos, por exemplo, de substâncias poliméricas ou ceras.

Os métodos de administração in vivo das composições da presente invenção, ou de formulações compreendendo tais composições e outros materiais tais como carreadores da presente invenção que são particularmente adequados para várias formas incluem, mas não estão limitados a, administração oral (e.g., administração bucal ou sublingual), administração anal, administração retal, administração como um supositório, aplicação tópica, aplicação de aerossol, inalação, administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração transdérmica, administração intradérmica, administração subdérmica, administração intramuscular, administração intrauterina, administração vaginal, administração em uma cavidade do corpo, administração cirúrgica no local de um tumor ou dano interno, administração no lúmen ou perênquima de um órgão, e administração parenteral. As técnicas úteis nas várias formas de administração acima incluem, mas não estão limitadas a, aplicação tópica, ingestão, administração cirúrgica, injeções, aspersões, dispositivos de fornecimento transdérmico, bombas osmóticas, eletro-deposição direta em um local desejado, ou outros meios familiares para alguém versado na técnica. Os locais de aplicação podem ser externos, tais como na epiderme, na parte interna, por exemplo, uma úlcera gástrica, um campo cirúrgico, ou outros.

As composições de colágeno da presente invenção podem ser aplicadas na forma de cremes, géis, soluções, suspensões, lipossomas, partículas, ou outros meios conhecidos por alguém versado na técnica de formulação e fornecimento de compostos cosméticos e terapêuticos. Os tamanhos de partículas ultrafinos de materiais de colágeno podem ser usados para fornecimento por inalação de compostos terapêuticos. Alguns exemplos de formulações apropriados para administração subcutânea incluem, mas não estão limitados a, implantes, depósito, agulhas, cápsulas, e bombas osmóticas. Alguns exemplos de formulações apropriadas para administração vaginal incluem, mas não estão limitados a, cremes e anéis. Alguns exemplos de formulações apropriadas para administração oral incluem, mas não estão limitados a: pílulas, líquidos, xaropes e suspensões. Alguns exemplos de formulações apropriadas para administração transdérmica incluem, mas não estão limitados a, géis, cremes, pastas, emplastros, aspersões e géis. Alguns exemplos de mecanismos de fornecimento apropriados para administração subcutânea incluem, mas não estão limitados a, implantes, depósito, agulhas, cápsulas, e bombas osmóticas. As formulações adequadas para administração parenteral incluem, mas não estão limitadas a, soluções de injeção estéril aquosas e não-aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostats e solutos, que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor desejado, e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas, que podem incluir agentes de suspensão e agentes de espessamento. As soluções e suspensões de injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e tabletes comumente usado por alguém versado na técnica.

As formas de realização nas quais as composições da presente invenção são combinadas com, por exemplo, um ou mais "carreadores farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitáveis" ou excipientes podem convenientemente ser apresentados em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparados por técnicas farmacêuticas convencionais. Tais técnicas incluem a etapa de colocar em associação as composições contendo o ingrediente ativo e o(s) carreador(es) ou excipiente(s) farmacêutico(s). Em geral, as formulações são preparadas pela colocação uniforme e íntima em associação do ingrediente ativo com carreadores líquidos. As formulações de dosagem unitária particulares são aquelas contendo uma dose ou unidade, ou uma sua fração apropriada, do ingrediente administrado. Deve ser entendido que, em adição aos ingredientes particularmente mencionados acima, as formulações compreendendo as composições da presente invenção podem incluir outros agentes comumente usados por alguém versado na técnica. O volume de administração vai variar, dependendo da via de administração. Por exemplo, as injeções intramusculares podem variar em volume de cerca de 0,1 a 1,0 ml.

As composições da presente invenção podem ser administradas a pessoas ou animais para fornecer substâncias em qualquer faixa de dosagem que vão produzir resultados fisiológicos ou farmacológicos desejados. A dosagem vai depender da substância ou das substâncias administradas, do ponto final terapêutico desejado, da concentração efetiva desejada no local de ação ou em um fluido corporal, e do tipo de administração. Informação referente a doses apropriadas de substâncias são conhecidas por pessoas versados na técnica e podem ser verificadas em referências, tais como L. S. Goodman and A. Gilman, eds, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, e Katzung, Basic & Clinicai Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Connecticut, (6a. edição, 1995). Alguém versado na técnica da terapia desejada pode escolher dosagens específicas e faixas de dosagens, e a freqüência de administração, como requerido pelas circunstâncias e pelas substâncias a serem administradas.

A composição de colágeno pode compreender um ou mais compostos ou substâncias que não são colágeno. Por exemplo, a composição de colágeno pode ser impregnada, ou durante a produção ou durante a preparação para a cirurgia, com uma biomolécula. Tais biomoléculas incluem, mas não estão limitadas a, antibióticos (tais como clindamicin, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormônios, fatores de crescimento, agentes anti- tumor, agentes anti-fungicos, agentes anti-virais, medicamento contra a dor, anti-histaminas, agentes antiinflamatórios, antiinfectivos incluindo, mas não limitados a, prata (tais como sais de prata, incluindo mas não limitados a, nitrato de prata e sulfadiazina de prata), prata elementar, antibióticos, enzimas bactericidas (tais como lisossoma), agentes de cura de ferida (tais como citoquinas, incluindo mas não limitadas a PDGF, TGF; timosina), ácido hialurônico, como um agente de cura de ferida, vedantes de ferida (tais como fibrina com ou sem trombina), atraente celular e reagentes de estruturação (tais como fibronectina) e semelhantes. Em um exemplo específico, a composição de colágeno pode ser impregnada com pelo menos um fator de crescimento, por exemplo, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento epitelial, etc. A composição de colágeno pode também ser impregnada com pequenas moléculas orgânicas, tais como inibidores específicos de processo bioquímicos particulares, e.g., inibidores de receptor de membrana, inibidores de quinase, inibidores de crescimento, drogas anti- câncer, antibióticos, etc.

Em ainda outras formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção pode ser combinada com um hidrogel. Qualquer composição de hidrogel conhecida por alguém versado na técnica é englobada na presente invenção, e.g., qualquer das composições de hidrogel descrita nas seguintes revisões: Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1):

18-22; Peppas et aL, 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Heninel et aL, 2002, Adv. Dzug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorne et al., 2002, Med. Device. Technol. 13(9):

19-23; Schmedlen et al., 2002, Biomaterials 23: 4325-32; todas são incorporadas aqui como referência. Em uma forma de realização específica, a composição de hidrogel é aplicada na composição de colágeno, i.e., descarregada na superfície da composição de colágeno. A composição de hidrogel, por exemplo, pode ser aspergida na composição de colágeno, saturada na superfície da composição de colágeno, encharcada com a composição de colágeno, banhada com a composição de colágeno ou revestida na superfície da composição de colágeno.

Os hidrogéis úteis nos métodos e nas composições da presente invenção podem ser feitos de qualquer polímero interativo com água ou solúvel em água conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, álcool polivinílico (PVA), polihidroxietil metacrilato; polietileno glicol, polivinil pirrolidona, ácido hialurônico, dextrano ou seus derivados e análogos.

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é também impregnada com uma ou mais biomoléculas antes de ser combinada com um hidrogel. Em outras formas de realização, a composição de hidrogel é também impregnada com uma ou mais biomoléculas antes de ser combinada com uma composição de colágeno da presente invenção. Tais biomoléculas incluem, mas não estão limitadas a, antibióticos (tais como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormônios, fatores de crescimento, agentes antitumor, agentes anti-fungicos, agentes anti-virais, medicamentos contra a dor, anti-histaminas, agentes antiinflamatórios, agentes antiinfectivos, incluindo, mas não limitados a prata (tais como sais de prata, incluindo mas não limitados a nitrato de prata e sulfadiazida de prata), prata elementar, antibióticos, enzimas bactericidas (tais domo lisossoma), agentes de cura de ferida (tais como citoquinas incluindo mas não limitadas a PDGF, TGF, timosina), ácido hiarulônico como um agente de cura de ferida, vedantes de ferida (tais como fibrina com ou sem trombina), atraentes celulares e reagentes de estruturação (tais como fibronectina) e semelhantes. Em um exemplo específico, a composição de colágeno ou a composição de hidrogel pode ser impregnada com pelo menos um fator de crescimento, por exemplo, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epitelial, etc. Vantajosamente, a biomolécula pode ser um agente terapêutico.

Em algumas formas de realização, a composição de hidrogel é combinada com um laminado compreendendo a composição de colágeno da presente invenção.

A composição de hidrogel/colágeno tem utilidade no campo médico incluindo mas não limitado a tratamento de feridas, queimaduras, e condições da pele (e.g., para tratar cicatriz), usos cosméticos (e.g., cirurgia cosmética), e qualquer uso como um implante. Em algumas formas de realização, a composição de hidrogel/colágeno é aplicada topicamente a um indivíduo, i.e., na superfície da pele, por exemplo, para o tratamento de uma ferida. Em outras formas de realização, a composição de hidrogel/colágeno pode ser usada no interior de um indivíduo, por exemplo, como um implante, para se tornar uma estrutura permanente ou semi-permanente no corpo. Em algumas formas de realização, as composições de hidrogel são formuladas para serem não-biodegradáveis. Em ainda outras formas de realização, a composição de hidrogel é formulada para ser biodegradável. Em uma forma de realização específica, a composição de hidrogel é formulada para se degradar dentro de dias. Em outra forma de realização específica, a composição de hidrogel é formulada para se degradar dentro de meses.

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é populada com células, de forma que as células sejam uniformes e confluentes. As células que podem ser usadas para popular uma composição de colágeno da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, células tronco, células tronco humanas, células adultas diferenciadas humanas, células tronco totipotentes, células tronco pluripotentes, células tronco multipotentes, células tronco específicas para tecido, células tronco semelhantes às embriônicas, células progenitoras comprometidas, células fibroblastóides. Em outras formas de realização, a presente invenção engloba a população da composição de colágeno da presente invenção com classes específicas de células progenitoras incluindo mas não limitadas a condrócitos, hepatócitos, células hematopoiéticas, células parenquimais pancreáticas, neuroblastos, e células prorgenitoras musculares.

4.6 Métodos de Uso de Composições de Colágeno

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos de uso das composições de colágeno da presente invenção terapeuticamente, profilaticamente ou cosmeticamente.

As composições de colágeno da presente invenção têm um amplo arranjo de usos potenciais. Os usos incluem, mas não estão limitados a, fabricação de tecido e órgãos engenheirados, incluindo estruturas, tais como emplastros ou tampões de tecidos ou material de matriz, próteses, e outros implantes, estruturantes de tecido, reparo ou curativo de feridas, dispositivos hemostáticos, dispositivos para uso no reparo ou suporte de tecido, tal como suturas, parafusos cirúrgicos ou ortopédicos, e placas cirúrgicas e ortopédicas, revestimentos naturais ou componentes para implantes sintéticos, implantes e suportes cosméticos, suporte de reparo ou estrutural para órgãos ou tecidos, fornecimento de substância, plataformas de bio-engenharia, plataformas para teste do efeito de substâncias nas células, cultura de célula, e vários outros usos. Esta discussão de usos possíveis não é pretendida para ser exaustiva e muitas outras formas de realização existem. Além disso, embora muitos exemplos específicos sejam fornecidos abaixo com relação à combinação de colágeno com outros materiais e/ou substâncias específicas, muitas outras combinações de materiais e substâncias podem ser usadas.

A capacidade de combinar células em um material de colágeno fornece a capacidade de se usar as composições da presente invenção para construir tecido, órgãos, ou tecido semelhante a um órgão. As células incluídas em tais tecidos ou órgãos podem incluir células que têm uma função de fornecer uma substância, células semeadas que vão fornecer os inícios do tecido de substituição, ou ambos. Muitos tipos de células podem ser usados para criar tecido ou órgãos. As células tronco, células tronco comprometidas, e/ou as células diferenciadas são usadas em várias formas de realização. Exemplos de células tronco usadas nestas formas de realização incluem, mas não estão limitados a, células tronco embriônicas, células tronco de medula óssea e células tronco do cordão umbilical usadas para fazer órgãos ou tecido semelhante a um órgão, tais como fígados ou rins. Em algumas formas de realização, a forma da composição ajuda a enviar sinais para as células crescerem e se reproduzirem em um tipo específico de forma desejada. Outras substâncias, por exemplo, indutores de diferenciação, podem ser adicionadas à matriz para promover tipos específicos de crescimento celular. Além disso, as misturas diferentes de tipos de células são incorporadas na composição em algumas formas de realização. A capacidade de se usar materiais de colágeno e matrizes para órgãos ou tecido de bioengenharia cria uma grande variedade de aplicações de substituição de tecido bioengenheirado. Exemplos de componentes bioengenheirados incluem, mas não estão limitados a, osso, estruturas dentárias, juntas, cartilagem, músculo do esqueleto, músculo liso, músculo cardíaco, tendões, menisco, ligamentos, vasos sangüíneos, stents, válvulas cardíacas, córneas, tambor do ouvido, guias de nervos, emplastros ou vedantes de tecido ou órgão, um enchimento para tecidos mortos, folhas para reparos cosméticos, pele (folhas com células adicionadas para fazer um equivalente de pele), estruturas de tecido macio da garganta, tais como traquéia, epiglote, e cordas vocais, outras estruturas cartilaginosas, tais como cartilagem nasal, placas tarsais, anéis da traquéia, cartilagem da tiróide, e cartilagem aritenóide, tecido conectivo, enxertos vasculares e seus componentes, e folhas para aplicações tópicas e reparo para ou substituição de órgãos tais como fígados, rins, e pâncreas. Em algumas formas de realização, tais matrizes são combinadas com droga e matrizes de fornecimento de substância da presente invenção em formas que vão melhorar a função do implante. Por exemplo, antibióticos, antiinflamatórios, anestésicos locais ou combinações destes, podem ser adicionados à matriz de um órgão bioengenheirado para acelerar o processo de cura e reduzir o desconforto.

4.6.1 Aplicações de Cosméticos

A pele humana é um material compósito da epiderme e da derme. A camada mais externa da camada da epiderme da pele é o stratum corneum. Abaixo da camada do stratum corneum está a epidermo. Abaixo da epidermo está a camada mais externa da derme, chamada de derme papilar, seguida pela derme reticular e pela camada subcutânea.

A pele exerce muita funções, incluindo proteção, adsorção, pigmentogênese, percepção sensorial, secreção, excreção, termo-regulação, e regulação de processos imunológicos. Estas funções da pele são negativamente afetadas, por exemplo, por envelhecimento, exposição ao sol agressiva, fumaça, trauma, e/ou fatores ambientais, que causam mudanças estruturais na pele e podem resultar no impedimento da função de barreira da pele e um retorno diminuído das células da epiderme. O colágeno e a elastina danificados perdem a capacidade de se contrair apropriadamente, o que resulta em enrugamento da pele e aspereza da superfície. As rugas são modificações da pele que são tipicamente associadas com envelhecimento cutâneo e se desenvolvem preferivelmente na pele exposta ao sol. Conforme o envelhecimento evolui, a face, bem como outras áreas do corpo começam a mostrar os efeitos de gravidade, exposição ao sol e anos de, e.g., movimento muscular facial, tal como sorriso, mastigação e olhar cerrado. Conforme a pele envelhece ou se torna não saudável, ela adquire rugas, decaimentos e marcas de estiramento, ela fica áspera, e ela tem uma capacidade diminuída de sintetizar Vitamina D. A pele envelhecida também se torna mais fina e tem uma interface dermo-epidermal planificada por causa das alterações em colágeno, elastina e glicosaminoglicans. Tipicamente, a pele envelhecida pode ser caracterizada por espessura, elasticidade e aderência diminuídas ao tecido subjacente.

Dano à pele devido ao envelhecimento, a fatores ambientais, à exposição ao sol e a outros elementos, tais como perda de peso, parto, doença (e.g., acne e câncer) e cirurgia freqüentemente resulta em deficiência de contorno de pele e outras anomalias da pele. Para se corrigir as deficiências de contorno e outras anomalias da pele, as pessoas freqüentemente recorrem a cirurgia cosmética, tal como levantamento de face e dobras na pele. Cirurgia cosmética, contudo, é geralmente cara, invasiva, e tem o potencial de deixar cicatrizes nas áreas de operação e pode afetar as funções biológica e fisiológica normais. Assim, permanece uma necessidade por terapias alternativas.

A presente invenção fornece métodos para aumento da pele em um paciente. Em uma forma de realização, um método para aumento da pele em um paciente compreende a injeção ou de outra forma a administração de uma composição de colágeno da presente invenção em uma área da face ou do corpo de um paciente em necessidade de aumento, em que a área da face ou do corpo do paciente é aumentada quando comparada com a área antes da administração do colágeno. "Aumento da pele", no contexto da presente invenção, se refere a qualquer mudança do estado natural da pele de um paciente (e.g., um humano) e áreas relacionadas devidas às ações ou efeitos externos. As áreas não limitantes da pele que podem ser alteradas por aumento da pele incluem a epiderme, derme, camada subcutânea, gordura, músculo eretor de pêlo, fio de cabelo, poro de suor, glândula sebácea, ou uma combinação destes.

Em algumas formas de realização, os métodos da presente invenção compreendem injetar ou de outra forma administrar uma composição de colágeno da presente invenção a um paciente para o tratamento de pés de galinha, dobras nasolabiais ("linhas de sorriso"), linhas de marionete, dobras globulares ("linhas de franzimento"), ou uma combinação destes. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ajudar a encher linhas, dobras e outras rugas e restabelecer uma aparência mais jovial e mais lisa. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada sozinha ou em conjunto com uma ou mais composições injetáveis adicionais, um procedimento de reconstrução da superfície, tal como um tratamento a laser, ou um procedimento de novo contorno, tal como levantamento de face.

Em uma forma de realização, uma composição de colágeno da presente invenção pode também ser usada para aumentar as áreas enrugadas ou afundadas da face e/ou adicionar ou aumentar a completude em áreas da face e no corpo de um paciente. As áreas da face e/ou do corpo que requerem o aumento podem ser o resultado de, e.g., envelhecimento, trauma, doença, fatores, perda de peso, parto ou uma combinação destes. Exemplos não limitantes de uma área da face ou do corpo de um paciente onde uma composição de colágeno da presente invenção pode ser injetada ou de outra forma administrada incluem a partir de baixo do olho, têmpora, malar superior, sub malar, queixo, lábio, linha da mandíbula, testa, glabela, sobrancelha, bochecha, área entre o lábio superior e o nariz, nariz (tal como ponto do nariz), pescoço, nádegas, quadril, esterno, ou qualquer outra parte da face ou do corpo, ou uma combinação destes.

Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para tratar deficiências na pele, incluindo, mas não limitadas a, rugas, depressões ou outras dobras (e.g., linhas de franzimento, linha de preocupação, pés de galinha, linhas de marionete), marcas de esticamento, cicatrizes internas e externas (tais como cicatrizes que resultam de dano, feridas, acidentes, ou cirurgia), ou combinações destes. Em algumas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para a correção de, por exemplo, olhos "ocos", vasos visíveis resultando em círculos escuros, bem como calhas de lágrimas visíveis. Uma composição de colágeno da presente invenção pode também ser usada, por exemplo, para correção da parte inferior do olho após a remoção agressiva de gordura da parte inferior do olho de blefaroplastia inferior ou correção da bochecha inferior após extração de gordura bucal agressiva ou perda natural. Em uma forma de realização, uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para corrigir os resultados de rinoplastia, enxerto na pele ou outras irregularidades cirurgicamente induzidas, tais como protuberâncias resultantes de liposucção. Em outras formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para a correção de cicatrizes faciais ou corporais (e.g., ferida, pé de galinha, cicatrizes de acne). Em algumas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção é injetada ou de outra forma administrada em um paciente para nova conformação de face. A nova conformação da face usando os métodos da presente invenção pode ser completada em um paciente com frouxidão do pescoço, ou tendo uma face macilenta, uma face longa, uma face de fundo pesado, uma face assimétrica, uma face gorducha, ou tendo uma face com atrofia de gordura localizada, uma retrusão de face média, olhos fundos, e/ou combinações destes.

Em uma forma de realização, os métodos da presente invenção compreendem a injeção ou de outra forma a administração de uma composição de colágeno da presente invenção a um paciente para o tratamento de uma deficiência de pele, tal como deficiência de pele causada por uma doença, tal como câncer ou acne. A deficiência pode ser o resultado direto ou indireto da doença. Por exemplo, uma deficiência de pele pode ser causada por uma doença ou pode ser causada por um tratamento de uma doença.

4.6.2 Aplicações de Não-Cosméticos

4.6.2.1 Enchimento de Vazios

A presente invenção fornece métodos para a vedação, enchimento e/ou de outra forma tratamento de um vazio dentro do corpo de um paciente. Em algumas formas de realização, os métodos da presente invenção compreendem a injeção ou de outra forma a administração de uma composição de colágeno da presente invenção a um paciente para enchçr um vazio dentro do corpo do paciente. Por exemplo, uma composição de colágeno pode ser administrada ao paciente na área onde o vazio está localizado. O termo "vazio" é voltado para englobar qualquer espaço oco indesejável criado por envelhecimento, doença, cirurgia, anormalidades congenitais, ou uma combinação destes. Por exemplo, um vazio pode ser criado após a remoção cirúrgica de um tumor ou outra massa do corpo de um paciente. Os exemplos não-limitantes de vazios que podem ser enchidos com uma composição de colágeno da presente invenção incluem uma fissura, fístula, divércula, aneurisma, cisto, lesão, ou qualquer outro espaço oco indesejável em qualquer órgão ou tecido no corpo do paciente.

Em algumas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para encher, vedar e/ou de outra forma tratar, completamente ou em parte, uma fissura, ou uma fístula dentro de um tecido, órgão, ou outra estrutura do corpo (e.g., um vaso sangüíneo), ou junções entre tecidos adjacentes, órgãos ou estruturas, para evitar o vazamento de fluidos biológicos, tais como sangue, urina, ou outros fluidos biológicos. Por exemplo, uma composição de colágeno da presente invenção pode ser injetada, implantada, enrascada em, ou de outra forma administrada em uma fístula entre vísceras, ou na abertura ou orifício de uma víscera para o exterior do corpo do paciente. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser usada para encher um vazio ou outro defeito formado por estes estados patológicos e estimular infiltração de fibroblasto, cura, e crescimento interno do tecido.

Em uma forma de realização, um método da presente invenção é usado para encher, vedar e/ou de outra forma tratar uma fístula em um paciente em necessidade de tratamento, o dito método compreendendo a injeção ou de outra forma a administração ao paciente de uma composição de colágeno da presente invenção. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser administrada ao paciente pela injeção através de uma agulha em um dos orifícios fistulares e deposição de quase tudo ou tudo das ramificações do orifício.

Alternativamente, as hastes ou filamentos dos colágenos podem ser enrascados nas lesões das fístulas através de um orifício, ou o colágeno pode ser introduzido no paciente com um cateter. Vários tipos de fístulas podem ser preenchidos, vedados e/ou de outra forma tratados por uma composição de colágeno ou método da presente invenção, tal como anel, arteriovenosa, bexiga, carótida-cavernosa, externo, gástrico, intestino, parietal, salivar, vaginal, e fístula anorrectal, ou uma combinação destes.

Em uma forma de realização, um método da presente invenção é usado para encher, vedar e/ou de outra forma tratar um divertículo em um paciente em necessidade de tratamento, o dito método compreendendo a injeção ou de outra forma a administração ao paciente de uma composição de colágeno da presente invenção. Os divertículos são estruturas fisiológicas anormais que são aberturas de bolsas ou sacos de um órgão tubular ou sacular, tal como o intestino, a bexiga, e semelhantes, e podem ser enchidos ou aumentados usando uma composição de colágeno da presente invenção.

Em outra forma de realização, um método da presente invenção é usado para encher, vedar e/ou de outra forma tratar um cisto em um paciente em necessidade de tratamento, o dito método compreendendo a injeção ou de outra forma a administração ao paciente de uma composição de colágeno da presente invenção. Os cistos são sacos anormais tendo um revestimento de membrana que contém gás, fluido ou material semi-sólido. Em algumas formas de realização, o cisto é um pseudocisto, que tem uma acumulação de, e.g., fluido mas não compreende um revestimento epitelial ou de outra membrana. Exemplos não limitantes adicionais de cistos que podem ser enchidos, vedados e/ou de outra forma tratados pela presente invenção incluem cistos sebáceos, dermóides, de osso, ou cerosos, ou uma combinação destes.

Em outra forma de realização, um método da presente invenção compreende a injeção ou de outra forma a administração de uma composição de colágeno da presente invenção para encher todos ou parte dos vazios criados como um resultado de remoção cirúrgica, química ou biológica de crescimentos desnecessários ou indesejáveis, fluidos, células, ou tecidos de um paciente. Uma composição de colágeno pode ser localmente injetada ou de outra forma administrada no local do vazio, de forma a aumentar o tecido restante e circundante, ajudar no processo de cura, e minimizar o risco de infecção. Este aumento é especialmente útil para sítios de vazios criados após a retirada do tumor, tal como após uma cirurgia de câncer de mama, cirurgia para a remoção de tecido conectivo com tumor, tecidos de osso ou tecido de cartilagem, e semelhantes.

A presente invenção também fornece um método para provocar o aumento por injeção ou de outra forma administração de uma composição de colágeno da presente invenção não diretamente no corpo, mas fora do corpo em órgãos, componentes de órgãos, ou tecidos antes da inclusão dos ditos tecidos, órgãos ou componentes de órgãos no corpo.

4.6.2.2 Avolumação do Tecido

Em uma forma de realização, os métodos da presente invenção compreendem a administração de uma composição de colágeno da presente invenção a um paciente para avolumação do tecido. "Avolumação do tecido", no contexto da presente invenção, se refere a qualquer mudança do estado natural de tecidos macios não dérmicos de um paciente (e.g., um humano) devido a ações ou efeitos externos Os tecidos englobados pela presente invenção incluem, mas não estão limitados a, tecidos musculares, tecidos conectivos, gorduras, e tecidos dos nervos. Os tecidos englobados pela presente invenção podem ser parte de muitos órgãos ou partes do corpo, incluindo, mas não limitados a, o esfíncter, o esfíncter da bexiga e uretra.

4.6.2.3 Incontinência Urinária

A incontinência urinária (incluindo incontinência urinária por tensão) é um vazamento súbito de urina que ocorre com atividades que resultam em um aumento na pressão intra-abdominal, tal como tosse, espirro, riso ou exercício. Durante estas atividades, a pressão intra-abdominal aumenta transientemente acima da resistência da uretra, resultando, assim, em uma quantidade súbita, usualmente pequena, de vazamento urinário. A incontinência por tensão é geralmente um problema de armazenagem na bexiga no qual a resistência do esfíncter uretral é diminuída, e o esfíncter não é capaz de evitar fluxo de urina quando houver pressão aumentada do abdômen. A incontinência urinária pode ocorrem como um resultado de músculos pélvicos enfraquecidos que suportam a bexiga e a uretra, ou por causa de mau funcionamento do esfíncter uretral. Por exemplo, antes do trauma à área da uretra, dano neurológico, e alguns medicamentos podem enfraquecer a uretra. A incontinência urinária é mais comumente vista em mulheres após a menopausa, cirurgia pélvica, ou parto, e.g., após várias gravidezes e partos vaginais, ou que têm prolapso pélvico (protuberância da parede da bexiga, uretra, ou retal no espaço vaginal), com cistocele, cistouretrocele ou rectocele, e é usualmente relacionado com uma perda de suporte vaginal anterior. Em homens, a incontinência urinária pode ser observada após cirurgia porostática, mais comumente, prostactetomia radical, em que pode haver dano ao esfíncter uretral externo.

A presente invenção engloba um método para o gerenciamento ou tratamento de incontinência urinária, ou um sintoma ou condição que resulte dela, compreendendo a injeção ou de outra forma a administração de uma composição de colágeno da presente invenção a um paciente em sua necessidade, em que o tecido do esfíncter do paciente é aumentado e continência é melhorada ou restaurada no paciente. A composição de colágeno pode ser injetada ou de outra forma administrada periuretralmente para aumentar o volume do tecido em torno da uretra para o gerenciamento e/ou tratamento de incontinência urinária. O melhoramento em incontinência por tensão pode ser alcançado pelo aumento do volume do tecido e desta forma aumentar a resistência ao fluxo externo de urina.

Em algumas formas de realização, uma composição de colágeno da presente invenção é injetada ou de outra forma administrada a um paciente na área em torno da uretra, por exemplo, para fechar um furo na uretra através do qual a urina vaza ou para aumentar a espessura da parede da uretra, de forma a vedar firmemente quanto a urina estiver sendo mantida de volta.

Em outra forma de realização, uma composição de colágeno da presente invenção é injetada ou de outra forma administrada a um paciente em torno da uretra fora do músculo da uretra na saída da bexiga. A injeção do material de avolumação pode ser feita através da pele, através da uretra, ou, em mulheres, através da vagina.

Quando as agulhas são usadas para injeção das composições de colágeno da presente invenção, a colocação da agulha pode ser guiada pelo uso de um cistóscopo inserido na uretra. Os procedimentos de avolumação de uretra podem ser realizados sob anestesia local, mas alguns pacientes podem requerer uma anestesia geral, regional ou espinhal. Um anestésico local pode ser usado de forma que o paciente possa levantar após a injeção, e pode ser determinado se a continência foi alcançada. Se continência não tiver sido restabelecida, uma ou mais injeções subseqüentes podem ser administradas ao paciente. O procedimento pode precisar ser repetido após poucos meses para alcançar o controle da bexiga. A injeção de colágeno ajuda a controlar o vazamento de urina por avolumação da área em torno da uretra, assim comprimindo o esfíncter.

4.6.2.4 Refluxo Vesicoureteral

O refluxo vesicoureteral (VUR) (ou refluxo urinário) é caracterizado pelo fluxo retrógrado de urina da bexiga para os rins. VUR não tratado pode causar efeitos de devastação a longo prazo na função renal e na saúde do paciente. Um paciente com VUR tem um risco aumentado de desenvolver uma infecção do trato urinário, cicatriz renal, pielonefrite, hipertensão e falha renal progressiva.

A presente invenção fornece um método para o gerenciamento ou tratamento de VUR, ou um sintoma ou condição que resulta dele, compreendendo a injeção ou outra administração a um paciente em sua necessidade de uma composição de colágeno da presente invenção, em que a parede da uretra do paciente está aumentando, e os sintomas de VUR são reduzidos ou eliminados. A composição de colágeno pode ser injetada (e.g., uma injeção subtrigonal) ou de outra forma administrada, tal como sob guia endoscópico, no forro do detrusor sob o orifício uretral usando qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica.

4.6.2.5 Doença de Refluxo Gastroesofageal

A doença de refluxo gastroesofageal (GERD) é um distúrbio que usualmente ocorre porque o esfíncter esofageal inferior (LES) - a válvula muscular onde o esôfago de une ao estômago - não fecha apropriadamente, relaxa e enfraquece, e o conteúdo do estômago vaza de volta, ou refluxa, no esôfago. Quando o ácido do estômago, ou ocasionalmente os sais biliares, entra em contato com o esôfago, ele causa a sensação de queimação ou azia que a maior parte de nós ocasionalmente sente. Quando o estômago refluxado tocar o revestimento do esôfago, ele causa uma sensação de queimação no peito ou garganta (azia), e o fluido pode ser provado no final da boca (indigestão ácida). Com o tempo, o refluxo de ácido no estômago danifica o tecido que reveste o esôfago, causando inflamação e dor. Em adultos, GERD não tratado, de duração longa, pode levar a um dano permanente do esôfago e, às vezes, ainda, ao câncer. Alguém, incluindo bebês, crianças e mulheres grávidas, podem ter GERD.

A presente invenção fornece um método para o gerenciamento ou tratamento de GERD, ou um sintoma ou condição que resulta dele, compreendendo a injeção ou outra forma de administração a um paciente em sua necessidade de uma composição de colágeno da presente invenção, em que o LES do paciente é aumentado, e os sintomas de GERD são reduzidos ou eliminados. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno é administrada sob guia endoscópico na parede do esôfago no nível da junção esôfago-gástrica. Pretendido para impedir o refluxo, o efeito de avolumação resulta de uma combinação do material retido e conseqüente resposta de tecido. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser injetada através de agulhas de injeção padrão ou de furo grande (e.g., calibre grande).

4.6.2. Cordas Vocais e Laringe A presente invenção fornece métodos para o gerenciamento ou tratamento de uma doença, distúrbio (tal como um distúrbio neurológico), ou outra anormalidade que afeta as uma ou mais cordas vocais (dobras) e/ou a laringe (caixa de voz). Os exemplos não-limitantes de tais doenças, distúrbios ou outras anormalidades da laringe são incompetência glótica, paralisia das cordas vocais unilaterais, paralisia das cordas vocais bilaterais, disfonia paralítica, disfonia não paralítica, disfonia espasmódica ou uma combinação destes. Em outras formas de realização, os métodos da presente invenção podem também ser usadas para gerenciar ou tratar doenças, distúrbios ou outras anormalidades que resultem nas cordas vocais fechando impropriamente, tal como uma paralisia incompleta da corda vocal ("parese"), geralmente cordas vocais enfraquecidas, por exemplo, com idade avançada ("presbilaringe"), e/ou cicatriz das cordas vocais (e.g., de cirurgia ou radioterapia prévia).

A presente invenção engloba métodos que fornecem suporte ou volume para uma corda vocal em um paciente que não tem o volume (tal como em curvatura ou atrofia da corda vocal) ou a mobilidade (tal como em paralisia) da corda vocal que tinha antes. Em algumas formas de realização, a cordas vocais e/ou os outros tecidos moles da laringe podem ser aumentados com uma composição de colágeno da presente invenção, sozinho ou em combinação com outros tratamentos ou medicamentos. Em uma forma de realização, uma composição de colágeno da presente invenção aumenta ou adiciona volume a uma ou mais das cordas vocais de forma que elas possam contatar com a outra corda vocal.

Qualquer um dentre vários procedimentos bem conhecidos por aqueles versados na técnica pode ser usado para administração de uma composição de colágeno da presente invenção a uma corda vocal ou laringe de um paciente. Em algumas formas de realização, uma agulha curvada é usada para injetar uma composição de colágeno da presente invenção através da boca de um paciente. Em outras formas de realização, uma agulha (tal como uma agulha curta de maior calibre) pode ser usada para injetar uma composição de colágeno da presente invenção diretamente através da pele e do pomo de Adão do paciente. Uma composição de colágeno da presente invenção pode ser administrada a um paciente enquanto se monitoram as cordas vocais do paciente com um laringoscópio em um monitor de vídeo. 4.6.2.7 Incompetência Glótica

Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um método para o gerenciamento ou tratamento de incompetência glótica. O aumento do colágeno laringeal percutâneo pode ocorrer por injeção do colágeno da presente invenção usando uma agulha nas cordas vocais de um paciente usado métodos conhecidos na técnica. Em alguns casos, o paciente tem hipofonia e/ou incompetência glótica que afeta a função da voz da laringe, rigidez muscular aumentada, e capacidade diminuída para movimento do músculo tiroaritenóide. Em outra forma de realização, a hipofonia é um resultado de Mal de Parkinson. Em uma forma de realização, um método da presente invenção para o gerenciamento ou tratamento de incompetência glótica em um paciente em sua necessidade compreende a injeção ou outra forma de administração de uma composição de colágeno da presente invenção às cordas vocais de um paciente, em que a injeção aumenta a corda vocal e melhora o fechamento da glote, de tal forma que incompetência glótica seja reduzida ou eliminada no paciente. O paciente pode ter ou não as cordas vocais móveis antes da administração de uma composição de colágeno da presente invenção.

4.6.2.8 Disfonia

A disfonia é qualquer impedimento da voz ou dificuldade de fala. A disfonia pode estar associada ou não com paralisia da corda vocal ou laringeal. A presente invenção fornece métodos para o gerenciamento ou tratamento de disfonia, tal como disfonia paralítica, disfonia não-paralítica ou disfonia espesmódica. Em uma forma de realização, um método para gerenciamento ou tratamento de distonia em um paciente compreende injetar ou administrar uma composição de colágeno da presente invenção ao paciente em sua necessidade, em que distonia é melhorada em um paciente quando comparado com antes da administração da composição de colágeno. Em alguns casos, a injeção de colágeno na laringe permite outra medialização de uma ou ambas as cordas vocais por pequenos incrementos para melhorar a fonação em conjunto com ou após tiroplastia de medialização.

4.6.2.9 Paralisia das Cordas Vocais

A corda vocal é essencialmente um músculo coberto com uma membrana mucosa. Quando o músculo não for mais conectado a um nervo, o músculo atrofia. Portanto, as cordas vocais paralisadas típicas são menores em tamanho e se curvam. Adicionalmente, dependendo do tipo de paralisia, a corda vocal pode ou não se mover próxima o bastante até o meio para que a outra corda entre em contato com ela. Quando as cordas vocais são incapazes de se encontrar, é difícil que o paciente emita um som (ou pelo menos um som alto). Assim, a presente invenção fornece métodos para aumentar ou encorpar uma corda vocal atrofiada em um paciente com paralisia da corda vocal, em que a capacidade das cordas vocais de ficarem juntas é melhorada.

A paralisia de corda vocal unilateral é não mobilidade de uma corda vocal, tipicamente por causa da disfunção do nervo, e freqüentemente a laringe é incapaz de fechar completamente. O nervo laringeal recorrente é o nervo principal que é responsável pela maior parte do movimento de cada corda vocal, e pode ser danificado, e.g., por várias doenças, certas cirurgias ou infecção viral. Em algumas formas de realização, a paralisia da corda vocal em um paciente é um sintoma ou resultado de câncer na tiróide, câncer de pulmão, tuberculose ou sarcóide (ou qualquer coisa que faça com que nós linfáticos cresçam no peito), derrame, uma doença neurológica (e.g., Charcot- Marie-Tooth, Shy-Drager, e atrofia multi-sistema). A paralisia da corda vocal bilateral é a não mobilidade (usualmente próxima à linha do centro) de ambas as cordas vocais. Em algumas formas de realização, a paralisia da corda vocal bilateral em um paciente é um sintoma ou resultado de, e.g., derrame ou outra condição neurológica (tal como má formação de Arnold-Chiari), câncer de tiróide, cirurgia (tal como cirurgia de cérebro) ou tiroidectomia.

A presente invenção fornece métodos para uso no gerenciamento ou tratamento de paralisia de corda vocal. Em uma forma de realização, um método é fornecido para gerenciar ou tratar paralisia de corda vocal unilateral ou bilateral, ou um sintoma relacionado a ele em um paciente, compreendendo injetar ou de outra forma administrar uma composição de colágeno da presente invenção ao paciente, em que o fecho da corda vocal é melhorado no paciente. Em uma forma de realização, uma composição de colágeno da presente invenção aumenta ou adiciona volume a uma corda vocal paralisada de forma que ela faça contato com a outra corda vocal. A injeção de uma composição de colágeno da presente invenção ao paciente em sua necessidade pode ser através da boca do paciente ou diretamente através da pele e do pomo de Adão.

4.6.2.10 Fornecimento de Droga

A composição de colágeno da presente invenção pode ser usada como um veículo de fornecimento de droga para fornecimento controlado de uma droga, e.g., um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno fornece os um ou mais agentes terapêuticos a um indivíduo, e.g., um humano. Os agentes terapêuticos englobados dentro do escopo da presente invenção são proteínas, peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeo, vacinas baseadas em genética, vacinas de vida atenuada, células integrais. Um exemplo não limitante de drogas para uso nos métodos da presente invenção é antibióticos, agentes anticâncer, agentes antibacterianos, agentes antivirais; vacinas, anestésicos, analgésicos, agentes anti-asma, agentes antiinflamatórios; agentes anti- depressão; agentes anti-artrite, agentes anti-diabetes; anti-psicóticos; estimulantes do sistema nervoso central; hormônios; imuno-supressores; relaxantes musculares; prostaglandinas.

A composição de colágeno pode ser usada como um veículo de fornecimento para fornecimento controlado de uma ou mais moléculas pequenas a um indivíduo, e.g., um humano. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno fornece as uma ou mais moléculas pequenas a um indivíduo, e.g., um humano. Como usado aqui, o termo "molécula pequena", e termos análogos, incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, polinucleotídeos, análogos de polinucleotídeos, nucleotídeos, análogos de nucleotídeo, compostos orgânicos ou inorgânicos (i.e., incluindo compostos hetero-orgânicos ou organometálicos) tendo um peso molecularmenor que cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor que cerca de 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor que 1.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor que cerca de 500 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor que cerca de 100 gramas por mol, e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos. Sais, ésteres, e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos são também englobadas.

Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção como um veículo para o fornecimento de droga resulta em absorção melhorada da droga; perfil farmacocinético melhorado, e distribuição sistêmica da droga em relação aos outros sistemas de fornecimento de droga conhecidos na técnica. Por farmacocinéticos melhorados entende-se que o melhoramento do perfil farmacocinético é alcançado quando medido, por exemplo, por parâmetros farmacocinéticos padrão como tempo para alcançar concentração máxima no plasma (Tmax); grandeza da concentração máxima no plasma (Cmax); tempo para extrair uma concentração no sangue ou plasma detectável (Tlag). Por absorção melhorada, entende-se que a absorção da droga é melhorada quando medida por tais parâmetros. A medição de parâmetros farmacocinéticos é rotineiramente realizada na técnica.

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção também compreende uma ou mais biomoléculas, e.g., agentes terapêuticos, que incluem, mas não estão limitados a, antibióticos, hormônios, fatores de crescimento, agentes anti-tumor, agentes anti-fungicos, agentes anti-virais, medicamento contra a dor, anti-histaminas, agentes antiinflamatórios, antiinfectivos, agentes de cura de ferida, vedantes de ferida, atraente celular e reagentes de estruturação, enzimas, antagonistas ou agonistas de receptor, hormônios, fatores de crescimento, medula óssea autógena ou outros tipos de célula, antibióticos, agentes antimicrobianos, e anticorpos, e semelhantes, ou combinações destes. Em um exemplo específico, as composições de colágeno da presente invenção podem ser impregnadas com um ou mais fatores de crescimento, por exemplo, fator de crescimento de fibroblastos, fator de crescimento epitelial, etc. As composições de colágeno da presente invenção podem também ser impregnadas com uma ou mais moléculas pequenas, que incluem, mas não estão limitadas a, moléculas orgânicas pequenas, tais como inibidores específicos de processo bioquímicos particulares, e.g., inibidores de receptor de membrana, hormônios, inibidores de quinase, inibidores de crescimento, drogas anti-câncer, antibióticos, etc.

Em algumas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção são impregnadas com uma biomolécula, durante a produção ou antes da injeção, dependendo de seu uso pretendido. Em algumas formas de realização, as composições de colágeno da presente invenção compreendem uma ou mais interferonas (a-EFN, β-IFN, γ-IFN), fatores de estimulação de colônia (CSF), fatores de estimulação de colônia de granulócito (GCSF), fatores de estimulação de colônia de granulócito- macrófago (GM-CSF), fatores de necrose de tumor (TNF), fatores de crescimento de nervo (NGF), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGF), linfotoxinas, fatores de crescimento epidermais (EGF), fatores de crescimento de fibroblastos (FGF), fatores de crescimento de células endoteliais vasculares, eritropoietina, fatores de crescimento de transformação (TGF), oncostatina M, interleucinas (IL-1, IL-2„ IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13,1L-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 19, IL-20, etc.), membros das famílias destes, ou combinações destes. Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção compreende análogos biologicamente ativos, fragmentos ou derivados de tal fator de crescimento ou outra biomolécula.

Os agentes ativos particulares para uso nos métodos da presente invenção incluem fatores de crescimento, tais como fatores de crescimento de transformação (TGFs), fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGFs), fator de crescimento epidermal (EGFs), peptídeos ativados por tecido conectivo (CTAPs), fatores osteogênicos, e análogos biologicamente ativos, e derivados de tais fatores de crescimento. Os membros da família de supergenes de fator de crescimento de transformação (TGF), que são proteínas reguladoras multifuncionais, são úteis. Os membros da família de supergene de TGF incluem os fatores de crescimento de transformação beta (por exemplo, TGF- β1, TGF-P2, TGF-p3); proteínas morfogenéticas de osso (por exemplo, BMP- 1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5; BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); fatores de crescimento de ligação de heparina (por exemplo, fator de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidermal (EGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento semelhante a insulina (IGF)); inhibinas (por exemplo, inhibina A, inhibina B); fatores de diferenciação de crescimento (por exemplo, GDF-1); e activinas (por exemplo, activina A, activina B, activina AB).

4.6.2.11 Feridas e Queimaduras

A composição de colágeno da presente invenção é esperada ter uma utilidade clínica melhorada como um curativo de ferida, para aumentar ou substituir reparo de tecido mole e/ou duro, quando comparada com outros biomateriais conhecidos na técnica, e.g., aqueles descritos nas Patentes US 3.157.524; 4.320.201; 3.800.792; 4.837.285; 5.116.620, devido em parte às suas propriedades físicas. A composição de colágeno da presente invenção, como retém a estrutura quaternária nativa de colágeno, fornece tecido melhorado em-crescimento através da migração de célula nos interstícios da matriz de colágeno. A composição de colágeno da presente invenção permite que células se liguem e cresçam na matriz de colágeno, e para sintetizar suas próprias macromoléculas. As células desta forma produzem uma nova matriz que permite o crescimento de um novo tecido. Tal desenvolvimento de célula não é observado em outras formas conhecidas de colágeno, tais como fibras, tosquias e colágeno solúvel.

Em algumas formas de realização, a presente invenção engloba o tratamento de uma ferida pela colocação da composição de colágeno da presente invenção diretamente na pele do indivíduo, i.e., no stratum corneum, no local da ferida, de forma que a ferida seja coberta, por exemplo, usando uma fita adesiva. Em outras formas de realização, a presente invenção engloba o tratamento de uma ferida usando a composição de colágeno da presente invenção como um implante, e.g., como um implante subcutâneo.

A presente invenção engloba o aumento da taxa de cura da ferida pela adição de uma macromolécula capaz de promover o crescimento interno de tecido à composição de colágeno da presente invenção. Tais macromoléculas incluem, mas não estão limitadas a, ácido hiarulônico, fibronectina, laminina, e proteoglicans (ver, e.g., Doillon et dl. (1987) Biomaterials 8:195 200; and Doillon and Silver (1986) Biomaterials 7:3 8).

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é usada para o gerenciamento de feridas que incluem, mas não estão limitadas a, feridas de espessura parcial ou completa, úlceras de pressão, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crônicas, feridas não determinadas, feridas cirúrgicas (e.g., sítios doadores/enxertos, cirurgia pós-Moh-s, cirurgia pós-laser, podiátrica, dehiscência de ferida), feridas de trauma (e.g., abrasões, lacerações, queimaduras de segundo grau, e rasgos na pele) e feridas de drenagem. Em certas formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é voltada para uso uma vez.

A presente invenção também engloba a incorporação de agentes farmaceuticamente ativos que incluem, mas não estão limitados a, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento semelhante a insulina; inhibinas fator de crescimento epidermal, fator de crescimento de transformação beta, fator de angiogênese, antibióticos, agentes anti-fungicos, agentes espermicidas, hormônios^ enzimas, inibidores de enzima na composição de colágeno da presente invenção como descrito aqui na seção 5.4.2.7 para fornecimento à pele, e qualquer biomolécula descrita acima. Em certas formas de realização, os agentes farmaceuticamente ativos são fornecidos em uma quantidade fisiologicamente efetiva.

Em algumas formas de realização, a composição de colágeno é também populada por células vivas, que incluem, mas não estão limitadas a, células tronco alogênicas, células tronco, e células adultas autólogas, antes de ser aplicada ao local da ferida.

A composição de colágeno da presente invenção é particularmente útil para o tratamento de infecções de ferida, e.g., infecções de ferida seguidas por uma piora de feridas cirúrgicas ou traumáticas. Em uma forma de realização particular, a composição de colágeno é impregnada com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente útil no tratamento de uma infecção de ferida, que inclui, mas não está limitado a, um antibiótico, um agente antimicrobiano, e um agente anti-bacteriano. A composição de colágeno da presente invenção tem utilidade clínica e terapêutica no tratamento de infecções de ferida de qualquer microorganismo conhecido na técnica, e.g., microorganismos que infectam feridas que se original de dentro do corpo humano, que é um reservatório conhecido para organismos patogênicos, ou de origem ambiental. Um exemplo não limitante dos microorganismos, o crescimento dos quais em feridas pode ser reduzido ou evitado pelos métodos e composições da presente invenção são S. aureus, St. epidermes, beta haemolytic Streptococci, E. cole, Klebsiella e Pseudomonas, e dentre as bactérias anaeróbicas, a Clostridium welchii ou tartium, que são a causa de gangrena de gás, principalmente em feridas traumáticas profundas.

Em outras formas de realização, a composição de colágeno da presente invenção é usada para tratamento de ferida, que inclui mas não está limitada a, feridas epidermais, feridas na pele, feridas crônicas, feridas agudas, feridas externas, feridas internas (e.g., a composição de colágeno pode ser envolvida em torno de um local de anastomose durante a cirurgia para evitar vazamento de sangue de linhas de sutura, e para evitar que o corpo forme adesões no material de sutura), feridas congenitais (e.g., bulosa epidermolose distrófica). Em particular, a composição de colágeno tem utilidade melhorada no tratamento de úlceras de pressão (e.g., úlceras decubitus). As úlceras de pressão ocorrem freqüentemente com pacientes submetidos a um descanso em cama prolongado, e.g., tetraplégicos e paraplégicos que sofrem de perda de pele devido aos efeitos de pressão localizada. As feridas de pressão resultantes exibem erosão dérmica e perda da epiderme e da pele. Em outras formas de realização mais específicas, a composição de colágeno da presente invenção é usada para o gerenciamento de feridas que incluem, mas não estão limitadas a, feridas de espessura parcial e completa, úlceras de pressão, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crônicas, feridas não deerminadas, feridas cirúrgicas (e.g., locais doadores/enxertos, cirurgia pós-Moh, cirurgia de pós-laser, deiscência de ferida), ferida de trauma (e.g., abrasões, lacerações, queimaduras de segundo grau, e cortes na pele) e feridas de dreno.

A composição de colágeno da presente invenção pode ser também usada no tratamento de queimaduras, que incluem, mas não estão limitadas a, queimaduras de primeiro grau, queimaduras de segundo grau (queimaduras de espessura parcial), queimaduras de terceiro grau (queimaduras de espessura completa), infecção de feridas de queimadura, infecção de feridas de queimadura excisadas e não excisadas, infecção de ferida enxertada, infecção de local doador, perda de epitélio de uma queimadura previamente enxertada e curada ou sítios doador de enxerto de pele, e impetigo de ferida de queimadura.

4.6.2.12 Dentário

A composição de colágeno da presente invenção tem utilidade particular em odontologia, e.g., cirurgia periodontal, regeneração de tecido guiado para regeneração de tecido periodontal, regeneração de osso guiado, e cobertura de raiz. A presente invenção engloba o uso da composição de colágeno da presente invenção para promover a regeneração de defeitos intra- osso periodontal, que incluem, mas não estão limitados a, defeitos periodontais bilaterais coincidentes, defeitos intra-osso interdental, defeitos intra-osso de 3 paredes profundos, defeitos intra-osso de 2 paredes, e defeitos intra-osso 2 e 3. A composição de colágeno da presente invenção é esperada ter uma utilidade terapêutica melhorada e parâmetros clínicos melhorados para o tratamento de defeitos intra-osso periodontais relativos a outras técnicas conhecidas na arte, uso de membranas de colágeno reticuladas, tais como aquelas descritas em Quteish et al., 1992, J. Clin. Periodontol. 19(7): 47684; Chung et al., 1990, S. Periodontol. 61(12): 732-6; Manson et al., 1995, J. Periodontol. 66(7): 635-45; Benque et al., 1997, J. Clin. Periodontol. 24(8): 544_9; Mattson et al., 1999, J. Periodontol, 70(5): 510-7). Exemplos de parâmetros clínicos que são melhorados usando a composição de colágeno da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, classificações de índice de placa e gengival, profundidade de bolsa de sonda, profundidade de ligação de sonda, e classificação de envolvimento de furcação e defeito ósseo, que são conhecidos por alguém versado na técnica.

A presente invenção também engloba o uso da composição de colágeno da presente invenção no tratamento de defeitos de furcação de classe II que incluem, mas não estão limitados a, defeitos bilaterais, defeitos de furcação de molar mandibular de Classe II bucal emparelhados, e defeito de furcação mandibular bilateral. A utilidade da composição de colágeno da presente invenção no tratamento de defeitos de furcação de classe II pode ser explicada em parte por sua capacidade de regenerar periodôntio perdido em defeitos de furcação. A composição de colágeno da presente invenção é esperada ter uma utilidade terapêutica ou clínica relativa às membranas de colágeno usadas na técnica para o tratamento de defeitos de furcação de classe II, tais como aqueles descritos em Paul et al:, 1992,Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang et al.,1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blinnenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black et al:, 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukna et al., 1995, J. Periodontol. 67: 650-7).

A presente invenção também engloba o uso da composição de colágeno da presente invenção em procedimentos de cobertura de raiz. A utilidade da composição de colágeno da presente invenção em cobertura de raiz pode ser explicada em parte devido à sua capacidade de substituir tecido gengival perdido, danificado ou adoentado baseado nos princípios de regeneração de tecido guiada. A composição de colágeno da presente invenção é esperada ter uma utilidade clínica melhorada na cobertura de raiz quando comparada com membranas de colágeno na técnica tradicionalmente usadas para cobertura de raiz, tais como descrito em Shieh et aL,1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahedi et al.; 1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan et al., 1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wang et aL,1997 J. Dent, Res. 78 (Spec lssue): 119 (Abstr. 106), pelas razões citadas acima.

A presente invenção também engloba o uso da composição de colágeno em um indivíduo com uma doença periodontal incluindo periodontite e gengivite. A composição de colágeno da presente invenção também tem utilidade clínica como um adjunto para procedimento de planejamento de raiz. A presente invenção engloba o tratamento de um indivíduo com uma doença periodontal usando uma composição de colágeno da presente invenção. Um método exemplar para o tratamento de uma doença periodontal em um indivíduo usando uma composição de colágeno da presente invenção compreende a inserção de uma composição de colágeno, que pode ser impregnada com um antibiótico, tal como gluconato de clorexidina, em uma ou mais bolsas poriodontais no indivíduo, e.g., maior que ou igual a 5 mm. Vantajosamente, a composição de colágeno pode ser biodegradável.

A composição de colágeno da presente invenção para uso em odontologia pode ser impregnada com uma ou mais biomoléculas dependendo do tipo de distúrbio dental sendo tratado. Qualquer biomolécula conhecida na técnica para o tratamento de distúrbios dentários é englobada nos métodos e nas composições da presente invenção. Em uma forma de realização específica, a composição de colágeno usada no tratamento de um distúrbio dentário associado com uma infecção pode ser impregnada com um ou mais antibióticos, incluindo mas não limitados a to doxociclin, tetraciclin, clorexidina gluconato, e minociclina.

4.6.2.13 Outros Usos

A composição de colágeno da presente invenção pode também ser usada como uma barreira de adesão pós-operativa nos ovários ou ressaltos uterinos. A composição de colágeno pode também ser usada como uma barreira de adesão no cérebro (e.g., na prevenção de adesão meningio- cerebral). Aqui, a composição de colágeno pode ser usada para restabelecer o espaço subdural que separa a pachymeninx e a leptomeninx. Geralmente, a composição de colágeno pode ser usada como um envoltório em órgãos internos danificados, por exemplo, o baço, ou como uma folha aderida ao pulmão para controlar vazamento pós-operativo. A composição de colágeno pode também ser usada para suportar tratamento cirúrgico de enxertos de membrana do tímpano (em perfurações do tímpano), ou como um revestimento em cavidades mastóides. A composição de colágeno pode também ser usada como um tecido de revestimento em neovaginoplastia. Em cirurgia cardiovascular, a composição de colágeno pode ser usada como um material de fechamento pericardial. A composição de colágeno pode também ser usada no término de anastomose em vasovasostomia. 4.7 Kits compreendendo as composições de colágeno

Em outro aspecto, a presente invenção fornece kits que compreendem as composições de colágeno da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção fornece kits para aumentar ou substituir tecido de um animal. Os kits compreendem uma ou mais composições de colágeno da presente invenção em um pacote para distribuição a alguém versado na técnica. Os kits podem compreender um rótulo ou rotulagem com instruções no uso da composição de colágeno para aumentar ou substituir tecido de um mamífero de acordo com os métodos da presente invenção. Em certas formas de realização, os kits podem compreender componentes úteis para realizar os métodos, tais como meios para a administração de uma composição de colágeno tal como uma ou mais seringas, cânulas, cateteres, etc. Em certas formas de realização, os kits podem compreender componentes úteis para a disposição segura de meios para a administração da composição de colágeno (e.g., um recipiente para seringas usadas). Em certas formas de realização, os kits podem compreender uma composição em seringas pré-enchidas, pacotes de dosagem unitária ou de unidade-de-uso.

5. EXEMPLOS

Nas seções abaixo, aqueles versados na técnica vão reconhecer que a frase "em cerca de 23°C" pode se referir à temperatura ambiente.

5.1 Exemplo 1: Isolamento de Colágeno de Placentas

Este exemplo ilustra o isolamento de colágeno de placentas. As placentas congeladas são obtidas de acordo com os métodos descritos aqui. As placentas são descongeladas pelo envolvimento em uma bandeja de Nalgene com água por 4 h. Elas são então removidas do envoltório de plástico e colocadas em NaCl 0,5 M (2 litros/placenta) por 4 h até o descongelamento. O fragmento de cordão umbilical é cortado de cada placenta, e cada placenta é cortada em cerca de 4 tiras em cerca de 23°C.

As bateladas de tiras de placenta, cerca de 3-4 em cada batelada, são moídas usando um moedor de carne em cerca de 23°C.

As placentas moídas são adicionadas a um tanque Nalgene de 50 1 com NaCl 0,5M (51/placenta) e misturadas usando um misturador motorizado a 75-100 rpm (24 h a 4°C).

Após 24 h, o tecido é isolado da mistura. O misturador é parado, deixando tecido assentar no fundo do misturador em cerca de 23°C. Fluido (~50 1) é removido usando uma bomba peristáltica em cerca de 23°C. Alternativamente, tecido e fluido são bombeados usando uma bomba peristáltica e um filtro através de uma peneira #10 em cerca de 23°C, e tecido isolado é colocado de volta no tanque de misturação.

NaCl 0,5M fresco (51/placenta) é adicionado à mistura e misturado por 24 h a 4°C (misturador motorizado, 75-100 rpm). Após 24 h, o tecido é isolado usando um método descrito acima.

O tecido é lavado com água (51/placenta) e misturado por 24 h a 4°C (misturador motorizado, 75-100 rpm). Após 24 h, o tecido é isolado usando um método descrito acima.

O tecido é lavado novamente com NaCl 0,5M, NaCl 0,5M fresco e então água de acordo com os quatro parágrafos acima.

Tecido livre de componentes do sangue é isolado. O tecido parece branco na cor.

Acido acético 0,5M (11/placenta) é adicionado ao tecido limpo em um tanque de misturação e misturado por 18-24 h a 4°C com um misturador motorizado a 75/100 rpm. O tecido é isolado usando um método descrito acima.

Ácido acético 0,5M fresco é adicionado ao tecido (11/placenta) com 1 g/l de pepsina. A amostra é misturada em um tanque por 24 h a 23°C com um misturador motorizado a 75-100 rpm. Após 24 h, a amostra é filtrada através de uma peneira #10 e de peneiras #50-100 em cerca de 23°C.

NaCl é adicionado à solução filtrada, levando a concentração de sal até 0,2M. A amostra é deixada incubar em cerca de 23°C por 1 h até que um precipitado se forme e comece a decantar. A amostra é centrifugada a 10.OOOg por 30 min, e o sobrenadante é separado da pelota por decantação cuidadosa do frasco de centrífuga. Alternativamente, a solução (em cerca de 23°C) é filtrada pela passagem através de uma série de filtros incluindo 20 μm, 5 μm, 2,7 μm, 0,45 μm, se desejado, 0,22 μηι.

O sobrenadante ou filtrado é adicionado a um recipiente de vidro ou de plástico alto e estreito. A concentração de NaCl da solução é levada até NaCl 0,7M onde tipicamente um precipitado branco se forma. O precipitado é deixado se mover até o topo da mistura. A amostra é deixada incubar durante a noite sem misturação ou chacoalhamento a 4-23°C. O sobrenadante é aspirado ou drenado do precipitado de sal para remover tanto da fase líquida quanto possível (em cerca de 23 °C).

O precipitado resultante é dissolvido em 5 vezes o volume de HCl 10 mM, e a precipitação de sal do parágrafo acima é repetida. O precipitado resultante é novamente dissolvido em 5 vezes o volume de HCl 10 mM, e a precipitação de sal do parágrafo acima é repetida novamente. A amostra resultante deve conter cerca de 5 mM de ácido acético em -10 mM de HCl com uma concentração de colágeno de cerca de 0,5 mg/ml.

Usando um dispositivo de filtração de fluxo tangencial (TFF) (diafiltração), a amostra (em 4°C) é concentrada até 3 mg/ml. A concentração de ácido acético é medida usando HPLC. Conforme a amostra é concentrada, mais HCl 10 mM é adicionado, e a concentração é continuada até que a concentração de ácido acético alcance < 1 mM.

Após a concentração de ácido acético alcançar < 1 mM, a concentração é continuada até que a amostra comece a se tornar viscosa. O processo de concentração é parado quando a concentração de colágeno, como medida pelo ensaio STRCOL™ (Biocolor Ltd., Newtownabbey, Northern Treland, UK) estiver na faixa de 3-4 mg/ml.

A amostra de colágeno final é filtrada usando 0,22 μπι e filtros de 0,1 μm em um recipiente asséptico fechado (estéril). Esta etapa é conduzida em cerca de 23°C.

A solução final é armazenada a 4°C.

5.2 Exemplo 2: Isolamento de Colágeno de Placentas

Este exemplo ilustra um outro processo para isolamento de colágeno de placentas de acordo com a presente invenção.

As placentas congeladas são obtidas, tecido é processado e lavado com ácido acético 0,5M (11/placenta) por 18-24 horas a 4°C, e isoladas da mistura como descrito no Exemplo 1. Acido acético 0,5M (11/placenta) com 0,5 g de pepsina/placenta é adicionado ao tecido em um tanque de misturação por 22-24 h, em cerca de 5-6°C com um misturador motorizado a 75-100 rpm.

Acido acético 0,5 M fresco é adicionado ao tecido (2 volumes de solução de ácido acético / placenta) com 2 g de pepsina/placenta. A amostra é misturada em um tanque por 24 horas a 23°C com um misturador motorizado a 75-100 rpm. Após 24 h, a amostra é filtrada através de uma peneira de #10 e de peneiras #50-100 em cerca de 23°C.

NaCl é adicionado à solução filtrada, levando a concentração de sal até 0,7M, onde tipicamente um precipitado branco se forma. O precipitado é deixado mover até o topo da mistura. A amostra é deixada incubar durante a noite sem misturação ou chacoalhamento a 4-23°C. O sobrenadante é aspirado ou drenado do precipitado de sal para remover tanto da fase líquida quanto possível (em cerca de 23°C).

O precipitado resultante é dissolvido em HCl 10 mM e também processado como descrito no Exemplo 1. Sob este processo, >l,5g de colágeno de placenta humana pode ser isolado de cada placenta com a amostra de colágeno final contendo >98% de colágeno e >90% de colágeno Tipo I.

5.3 Exemplo 3: Isolamento de Colágeno de Placentas

As placentas congeladas são obtidas, tecido é processado e precipitado, e o precipitado resultante é dissolvido em HCl 10 mM como descrito nos Exemplos 1 e 2.

Uma solução de hidróxido de sódio IN (NaOH) (cerca de 160 ml/placenta) é adicionada à amostra em uma taxa de 50 ml/min e misturada por 60 min a 5-6°C com um misturador motorizado a 60-100 rpm.

NaCl 4M e HCl 10 mM são adicionados para levar a concentração de sal até 0,7M, onde tipicamente um precipitado branco se forma. O precipitado é deixado se mover até o topo da mistura. A amostra é deixada incubar durante a noite sem misturação ou chacoalhamento a 4-23°C. O sobrenadante é aspirado ou drenado do precipitado de sal para remover tanto do líquido quanto possível (em cerca de 23°C)

O precipitado resultante é dissolvido em HCl 10 mM e também processado como descrito no Exemplo 1.

5.4 Exemplo 4: Preparação de Colágeno Fibrilado

Colágeno de placenta humana (HPC) em HCl 10 mM (~3 mg/ml, pH ~2) é mantido em um vaso de reação encamisado com água com capacidade de agitação a 4°C.

Com agitação, tampão de neutralização (Na2HPO4, pH 9,2) é adicionado ao colágeno em uma relação de 1,5 partes de tampão de neutralização para 8,5 partes de solução de colágeno para uma concentração de íon fosfato final de 30 mM. O pH é ajustado em 7m2 quando necessário e agitação é parada.

A temperatura é elevada até 32°C em l°C/min e então mantida a 32°C por 20-24 h. O colágeno é transferido para tubos de centrífuga e o volume de total é diminuído em pelo menos 10 vezes.

Para remover o colágeno não-fibrilado, a suspensão de colágeno fibrilada é lavada 3x em solução salina tamponada com fosfato (20 mM de Na2HPO4 e 130 mM de NaCl, pH 7,4).

A suspensão de colágeno fibrilada a ~3 mg/ml é cisalhada pela passagem através de uma tela com malha 60 a 2900 ml/min. Colágeno é passado através da malha ~75x.

A concentração de colágeno é confirmada por análise gravimétrica térmica. A temperatura de desnaturação de colágeno é confirmada por calorimetria de varredura diferencial.

A suspensão de colágeno fibrilada é mantida a 4°C.

5.5 Exemplo 5: Preparação de Colágeno Fibrilado Reticulado

Uma suspensão de colágeno fibrilado em PBS (-2,5 mg/ml, pH 7,4) é mantida em um vaso de reação encamisado com água com capacidade de agitação em cerca de 25°C. Enquanto se agita vigorosamente a suspensão de colágeno fibrilada, 50 mM de butanodiol diglicidil éter (BDDE) é adicionado. O pH é ajustado com NaOH IM até um pH de 9,5 ser alcançado. A reação é agitada em cerca de 25°C por 24 horas após o que a suspensão de colágeno reticulada resultante é lavada uma vez e ressuspendida em glicina 0,5M, pH 10. A reação de reticulação é deixada extinguir com agitação em cerca de 25°C por 24 horas. A suspensão de colágeno reticulada resultante é lavada 3x com PBS.

A concentração de colágeno é confirmada por análise termogravimétrica. A temperatura de desnaturação de colágeno é confirmada por calorimetria de varredura diferencial.

A suspensão de colágeno fibrilada reticulada é mantida em 4°C.

5.6 Exemplo 6: Preparação de Colágeno Fibrilado Reticulado Injetável

Este exemplo ilustra o cisalhamento de colágeno fibrilado reticulado para melhorar a capacidade de injeção e a durabilidade.

Colágeno fibrilado reticulado é cisalhado com um homogeneizador de tecido e quaisquer partículas excessivamente grandes são tríadas da suspensão. O colágeno é concentrado até ~35 mg/ml (confirmado por, por exemplo, análise termogravimétrica).

5.7 Exemplo 7: Remoção Viral

Este exemplo ilustra a remoção de partículas virais de uma composição de colágeno da presente invenção.

Uma composição de colágeno de 3 mg/ml preparada de acordo com o Exemplo 4, 5 ou 6 é dissolvida em um volume de 5 vezes de HCl 10 mM,pH 2-2,3.

A composição de colágeno diluída é então aplicada a um dispositivo de filtração. Para filtração, uma tubulação de #16 é ligada às portas de alimentação e retido de um dispositivo de filtração Minimate™ Tangential Flow Filtration (Pall Corporation, Santa Clara, CA). Outro tubo é ligado à porta de exaustão (coleta de rejeito). Uma bomba peristáltica é conectada à linha de alimentação entre a amostra e as portas de alimentação. A velocidade da bomba é ajustada em 20-30 ml/min. A composição de colágeno diluída é colocada em um recipiente, e o tubo de alimentação e o tubo de retido do dispositivo são aplicados ao mesmo recipiente. Um recipiente de coleta de rejeito é colocado para remover fluido removido da porta de exaustão. A bomba é ligada e deixada funcionar em cerca de A-21°C. A amostra é deixada concentrar até que o volume de colágeno restante alcance o volume original antes da diluição.

A amostra de colágeno coletada é rediluída cinco vezes e o processo de concentração é repetido. O processo de diluição e concentração é repetido até 6 vezes ou mais para produzir uma composição de colágeno limpa.

A composição de colágeno limpa pode ser também tratada de acordo com os Exemplos 3, 4 e/ou 6, quando apropriado.

5.8 Exemplo 8: Preparação de Composição de Colágeno Injetável

A composição de colágeno do Exemplo 6 ou 7 é carregada em seringas de 1 ml, equipadas com agulhas de calibre 30, e armazenada a 4°C.

5.9 Exemplo 9: Preparação de Composição de Colágeno Injetável de Placentas

Este exemplo ilustra a preparação de uma composição de colágeno injetável humana a partir de placentas humanas

Etapa 1: Colágeno de placenta humana (HPC) é isolado da placenta como descrito nos Exemplo 1 a 3 e a amostra de colágeno em HCl 10 mM é armazenada a 4°C.

Etapa 2: o HPC isolado é fibrilado como descrito no Exemplo 4.

Etapa 3: o HPC fibrilado é reticulado como descrito no Exemplo 5. Etapa 4: o HPC reticulado é cisalhado e concentrado como descrito no Exemplo 6.

Etapa 5: o HPC cisalhado é tem as partículas virais removidas como descrito no Exemplo 7.

Etapa 6: O HPC limpo é carregado em seringas e armazenado a 4°C, como descrito no Exemplo 8.

Cerca de 26 seringas de colágeno de placenta humana injetáveis / placenta podem ser preparadas por este processo.

Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relatório são aqui incorporados como referência como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência. Embora a presente invenção tenha sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente aparente para aqueles versados na técnica que certas mudanças e modificações podem ser feitas aqui sem se afastar do espírito ou do escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Colágeno de atelopeptídeo, caracterizado pelo fato de ser solúvel em ácido, reticulado com diglicidil éter de 1,4-butanodiol.

2. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o colágeno é colágeno de mamífero.

3. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é colágeno bovino, ovino ou de rato.

4. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é colágeno humano.

5. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é colágeno de placenta.

6. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é fibrilado antes da reticulação.

7. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é colágeno de placenta humana.

8. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é reticulado com um composto de epóxi multifuncional.

9. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é reticulado com diglicidil éter de 1,4- butanodiol.

10. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação -1, caracterizado pelo fato de que é reduzido.

11. Colágeno de atelopeptídeo de acordo com a reivindicação -10, caracterizado pelo fato de que é reduzido com boroidreto de sódio.

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o colágeno de atelopeptídeo reticulado como definido na reivindicação 1, em que pelo menos 80% do colágeno da composição é colágeno do Tipo I.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que 80-90% do colágeno da composição é colágeno do Tipo I.

14. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que menos que 10% do colágeno da composição é colágeno do Tipo III.

15. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que 2-13% do colágeno da composição é colágeno do Tipo IV.

16. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 10 μg/mg de carboidrato.

17. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que também compreende ácido hialurônico.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o ácido hiarulônico é reticulado.

19. Método para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do colágeno de atelopeptídeo reticulado como definido na reivindicação 1 ao tecido do mamífero.

20. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o colágeno de atelopeptídeo reticulado é administrado por injeção.

21. Kit para aumentar, avolumar ou substituir tecido de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende o colágeno de atelopeptídeo reticulado como definido na reivindicação 1 e um rótulo com instruções para a administração do colágeno de atelopeptídeo reticulado.

22. Kit de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que também compreende um meio para a administração do colágeno de atelopeptídeo reticulado.

23. Kit de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o dito meio é uma seringa.

24. Processo para preparar colágeno de atelopeptídeo do tecido de um mamífero que compreende colágeno, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: a) contactar o tecido com uma solução de choque osmótica para produzir uma solução de colágeno.

25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a solução de choque osmótica compreende água com um potencial osmótico menor que aquele de NaCl 50 mM.

26. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada ou seguida pelo contato do tecido com uma solução tendo um potencial osmótico de uma solução de pelo menos NaCl 0,5M.

27. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: b) contactar o tecido com uma solução de lavagem ácida.

28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem ácida compreende ácido acético 0,5 M.

29. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: c) remover telopeptídeos do colágeno.

30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que os telopeptídeos são removidos pelo contato da solução de colágeno com uma enzima capaz de remoção de telopeptídeos sob condições adequadas para a remoção de telopeptídeos.

31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a enzima é pepsina ou papaína.

32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem uma temperatura de 23-25°C.

33. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: d) contactar o colágeno com uma solução de força iônica baixa.

34. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a solução de força iônica baixa compreende NaCl 0,2M.

35. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: e) precipitar colágeno com uma solução de força iônica baixa.

36. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a solução de força iônica alta compreende NaCl 0,7M.

37. Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a etapa 35.e) é repetida.

38. Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de filtrar o colágeno.

39. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: f) fibrilar o colágeno.

40. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: g) reticular O colágeno para produzir colágeno reticulado.

41. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o colágeno é reticulado com glutaraldeído, genipina ou diglicidil éter de 1,4-butanodiol.

42. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: h) reduzir o colágeno reticulado.

43. Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o colágeno reticulado é reduzido pelo contato do colágeno reticulado com boroidreto de sódio.

44. Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que também compreende a etapa de: i) cortar o colágeno reticulado.

45. Processo para reticular colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contactar o colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido com diglicidil éter de 1,4- butanodiol sob condições adequadas para a reticulação do colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido.

46. Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido é da placenta humana.

47. Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido é contactado com 400% de diglicidil éter de 1,4-butanodiol em uma base em peso.

48. Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o colágeno de atelopeptídeo solúvel em ácido é contactado com diglicidil éter de 1,4-butanodiol na presença de um catalisador.

49. Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o catalisador é piridina.

50. Processo para reduzir a quantidade de partículas virais em uma composição de colágeno, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contactar uma composição de colágeno com um filtro de um tamanho que permita que uma ou mais partículas virais passem através do filtro, enquanto mantém a composição de colágeno.

51. Processo de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o filtro é cerca de 500 kDa, cerca de 750 kDa ou cerca de -1000 kDa.