CN106267313A - 一种组合物、含有该组合物的3d敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及3D打印领域,特别涉及一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。含有该组合物的3D敷料能够有效修复创面。本发明利用3D打印和脂肪间充质干细胞、支架相结合的技术,快速打印出一种用于修复皮肤创面的3D打印敷料。该3D敷料机械强度良好,可用手术钳夹取,加入培养基后不松散,继续培养过程中未见破碎和大幅降解。
Description
技术领域
本发明涉及3D打印领域,特别涉及一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。
背景技术
创面是正常皮肤(组织)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失,同时,皮肤的正常功能受损,也称为伤口或者创伤,创面修复既伤口修复。
皮肤创面的修复和愈合是外科学研究的热点与难点,严重烧伤、糖尿病足和肿瘤溃疡等难愈性伤口更是创伤外科领域的棘手问题。目前临床上主要采用药物、手术等方法来修复创面,难以取得令人满意的疗效,给患者带来了痛苦。而移植脂肪成活率较低也极大地限制了其在临床的广泛应用。
干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界将其称之为“万用细胞”。脂肪间充质干细胞(ADSCs)是存在于脂肪组织中的干细胞,具有多向分化的潜能。相对于其它种子细胞,脂肪间充质干细胞具有来源广泛、含量丰富、分离简单、体外扩增稳定容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、免疫原性低、对供区损伤小等优势,备受外科医生的重视。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。本发明利用3D打印技术打印本发明提供的3D敷料,用于皮肤创面的修复和愈合。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种组合物,包括如下组分:
脂肪间充质干细胞可以有效促进皮肤创面愈合,它在体内外均可向皮肤表皮细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞分化,分泌多种生物活性分子限制炎症和凋亡,促进血管形成,参与损伤修复等,最终实现促进创面愈合的作用。
低免疫原性的脱细胞生物材料因具有天然特定的三维结构、富含活性因子等特点在一定程度上解决了脂肪细胞成活率低的问题。同时,支架材料也可以为脂肪间充质干细胞提供合适的生存和分化环境,选择合适的生物支架材料可以提高创面修复的效果。
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物包括如下组分:
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物包括如下组分:
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物包括如下组分:
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物中所述生物大分子物质为壳多糖;
所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白;
所述生长因子为EGF。
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物包括如下组分:
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物包括如下组分:
在本发明的一些具体实施方案中,所述的组合物还包括溶剂Lonza。所述组合物中各组分的质量百分含量之和为100%,所述溶剂的加入量为100%减去生物大分子物质、胶原蛋白和生长因子之后的余量。
本发明还提供了所述的组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
本发明还提供了一种3D敷料,包括所述的组合物。
本发明还提供了一种所述的3D敷料的制备方法,包括如下步骤:
步骤1:获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液,调整细胞浓度为0.9×105个/ml~1.1×106个/ml;
步骤2:取脂肪干细胞、生物大分子物质、胶原蛋白、生长因子、脂肪脱细胞基质和溶剂混合,调整pH值为7.2~7.4,制得支架材料溶液;
步骤3:取步骤1所述的单细胞悬液与步骤2制得的支架材料溶液按照配方混合。
具体的,获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液的方法为:取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打;1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
本发明提供一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法。含有该组合物的3D敷料能够有效修复创面。本发明利用3D打印和脂肪间充质干细胞、支架相结合的技术,快速打印出一种用于修复皮肤创面的3D打印敷料。该3D敷料机械强度良好,可用手术钳夹取,加入培养基后不松散,继续培养过程中未见破碎和大幅降解。
具体实施方式
本发明公开了一种组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的组合物、含有该组合物的3D敷料及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:人脂肪间充质干细胞分离
取供体皮下抽取的脂肪组织,用细胞清洗液清洗脂肪组织。补加细胞清洗液,
1500rpm离心5min。
0.1%I型胶原酶溶液,37℃、100R消化2h,直至脂肪完全消化。1500rpm离心5min。
细胞清洗液清洗沉淀,1500rpm离心5min。
离心结束后,倒弃上清,将适量的细胞接种于培养皿中,加入完全培养基。
转移至5%CO2、37℃、饱和湿度为95%的CO2培养箱中培养。
48h后,对原代细胞进行换液,获得人脂肪间充质干细胞原代细胞(P0),再经传代培养至细胞融合度达80-90%即得人脂肪间充质干细胞细胞。
实施例2:人脂肪间充质干细胞鉴定
取对数生长期第2代的细胞,吸出培养基后,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬均匀,调整细胞浓度约为105-106个/ml。
取上样管,每管加入500ul的单细胞悬液,1号管标为标准对照,加入5μlPE标记的小鼠IgG1抗体及5μl FITC标记的小鼠IgG1抗体;其他各管分别加入5μlFITC标记的CD90,CD54,CD45和CD38抗体,以及PE标记的CD73,CD105,CD34和CD44抗体工作液。
室温,避光,孵育20min。
PBS洗两遍,以去除未结合的抗体,500μl PBS重悬后,上流式细胞仪。实施例3:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) | 1×105个/ml |
壳多糖 | 2% |
I型胶原 | 0.5% |
EGF | 5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例4:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例一获得) | 5×105个/ml |
壳多糖 | 2% |
I型胶原 | 0.5% |
EGF | 5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例5:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) | 1×106个/ml |
壳多糖 | 2% |
I型胶原 | 0.5% |
EGF | 5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例6:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) | 0.9×105个/ml~1.1×105个/ml |
壳多糖 | 1.5~2.5% |
I型胶原 | 0.4~0.6% |
EGF | 4.5~5.5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例7:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) | 5×105个/ml |
壳多糖 | 1.5~2.5% |
I型胶原 | 0.4~0.6% |
EGF | 4.5~5.5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例8:敷料
取P3代脂肪间充质干细胞,吸去培养基,加入消化液进行消化,之后用适量血清终止消化,轻轻吹打成单细胞悬液。
1500rpm,离心5min,弃上清,用4℃PBS洗涤细胞3次后重悬混匀,调整细胞浓度约为107个/ml。
在50ml离心管中,按配方先后加入壳多糖、I型胶原、EGF、Lonza,每一步充分搅拌混匀,并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4,形成支架材料溶液。
组分 | 含量 |
P3代脂肪干细胞(实施例1获得) | 1×106个/ml~1.1×106个/ml |
壳多糖 | 1.5~2.5% |
I型胶原 | 0.4~0.6% |
EGF | 4.5~5.5ng/ml |
Lonza(溶剂) | 余量 |
单细胞悬液与支架材料溶液按配方浓度混匀。
实施例9:3D敷料制备
(1)3D建模
利用CAD/CAM等矢量建模软件,实现3D建模。
利用3D打印机内置的激光器对需修复伤口处进行扫描,获得伤口的大小、形状、厚薄及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据,然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑,使之产生一个连续的表面图像;利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件,使扫描后的溃疡表面图像转变为一个虚拟立体图像(或模块),可以用来直接打印出对应的敷料。
(2)3D打印敷料
利用已经建好的3D敷料模具,将细胞和支架材料混合液一层一层喷涂在基材上,打印的层数和具体的量根据不同患者以及患者的不同部位而变化,打印完成后,等待其凝固,形成3D敷料。
(3)打印后处理
待敷料凝固后,将敷料从基材上剥离下来,并放在培养基(Lonza、10%FBS,0.1%青、链霉素)中于37℃、5%CO2、饱和湿度培养。
实施例10:3D敷料评价
(1)3D敷料质量检测:
对实施例3~8制得的医用敷料进行微生物检测和内毒素检测检测。其中,微生物检测(细菌、真菌)根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1100进行检测;内毒素检测根据2015年版中华人民共和国药典第4部通则1143进行检测。
检测结果:实施例3~8制得的敷料在细菌、真菌和内毒素的检测中,均呈阴性。说明了该干细胞制剂的质量合格,可用于创口的修复。
(2)力学性能评价
利用镊子夹,观察实施例3~8制得的3D敷料是否破碎,以此来判断敷料的弹性和韧性;并且观察刚打印的敷料和培养10天后的敷料在形状、厚度、弹性上是否有明显的变化。
结果显示:实施例3~8制得的3D敷料机械强度良好,可用手术钳夹取,加入培养基后不松散,继续培养过程中未见破碎和大幅降解。
实施例11:3D敷料的创伤修复效果检测
取70只小鼠,将小鼠常规饲养3d后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉,每100g体重注射1ml 10%水合氯醛。剃去背部毛,在背部制成一个深入皮下的1cm*1cm的创面,造成小鼠创伤模型。将小鼠分为7组,其中一组为对照组,其余6组为实验组。阴性对照组用无菌纱布包扎伤口,其余6组小鼠分别用实施例3~8制得的3D敷料进行治疗,7天后观察小鼠的伤口愈合程度,结果如表1所示:
表1
*表示与对照组相比具有显著性差异,P<0.05。
表1试验结果表明,本发明实施例3~8制备的3D敷料与对照组相比,显著(P<0.05)提高了小鼠的伤口愈合程度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种组合物,其特征在于,包括如下组分:
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括如下组分:
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括如下组分:包括如下组分:
4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括如下组分:
5.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括如下组分:
6.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,包括如下组分:
7.根据权利要求1至6任一项所述的组合物,其特征在于,所述生物大分子物质为壳多糖;
所述胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白;
所述生长因子为EGF。
8.根据权利要求1至7任一项所述的组合物在制备创伤修复的药物和/或制剂中的应用。
9.一种3D敷料,其特征在于,包括如权利要求1至7任一项所述的组合物。
10.一种如权利要求9所述的3D敷料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:获得脂肪间充质干细胞的单细胞悬液,调整细胞浓度为0.9×105个/ml~1.1×106个/ml;
步骤2:取脂肪干细胞、生物大分子物质、胶原蛋白、生长因子、脂肪脱细胞基质和溶剂混合,调整pH值为7.2~7.4,制得支架材料溶液;
步骤3:取步骤1所述的单细胞悬液与步骤2制得的支架材料溶液按照配方混合。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170104 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |