CN104548214A

CN104548214A - 一种人工皮肤及其制备方法

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Publication number: CN104548214A
Application number: CN201510071024.0A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王一飞; 葛啸虎; 马岩岩; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-02-10
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-02-10
Also published as: CN104548214B

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种人工皮肤及其制备方法。该人工皮肤中包括：真皮层和表皮层；其中，真皮层与表皮层贴合；真皮层包括支架材料与成纤维细胞；表皮层包括支架材料与表皮细胞；支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛；表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。由于使用时不需要涂抹，且其结构更加符合患者自身情况，将其用于创面修复能够起到更好的治疗效果，皮肤愈合速度更快，愈合后，伤口更加平滑。并且，由于其具有较好的力学性能，使用时不易发生断裂。

Description

一种人工皮肤及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种人工皮肤及其制备方法。

背景技术

皮肤作为机体最大的器官，其功能是防止细菌侵蚀和感染、保护人体调节体温以及排泄体液等。皮肤可分为三层,即表皮层、真皮层和皮下组织层。皮肤具有较强的再生能力，但是，对于慢性溃疡、重度烧伤、严重外伤等造成的大面积皮肤损伤的修复和再生仍是目前医学领域面对的技术难题。除了患者自体植皮外，人们采用过同种异体植皮，以及其他相关修复材料来覆盖创面，但是无论自体或异体皮肤移植均受到供体来源和免疫排斥反应的限制。

因此，亟待寻找一种理想的无排斥反应、促进皮肤损伤修复、促进皮肤再生的材料。干细胞治疗被认为是临床上一种组织损伤修复的安全、有效的治疗方法。现有技术中，以骨髓或脐血充间质干细胞作为创面修复材料的技术已有报道。但是，骨髓充间质干细胞(BMSCs)存在病毒污染的隐患，且随着供者年龄增长，其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，不适合批量制备。而来源于脐血或胎盘的充间质干细胞虽然可以克服上述缺陷，却仅能在出生时保存，并非所有患者都能提供。从人体脂肪组织中分离出来的脂肪间充质干细胞(ADSCs)可通过分泌多种生长因子，控制和调节临近的受损细胞，发挥重要功能，而且ADSCs容易从吸脂的脂肪中获得，对患者创伤小，干细胞分离效率高，具有多能分化的能力，因此ADSCs近年来已经成为种子细胞的研究热点。

但是，将ADSCs用于制备创面修复材料首先面临的问题就是分化。现有技术中对ADSCs的成表皮细胞分化、和ADSCs成纤维细胞分化研究较少，仅有的研究结果显示，ADSCs分化成为表皮细胞所需的时间约在20天左右，时间较为漫长。

另外，现有技术中以干细胞为原料的创面修复材料多采用直接涂抹于创面的方式，在愈合的过程中难以形成光滑的表面，且涂抹的过程中难免发生涂抹不均的问题。将细胞与支架材料混合制成人工皮肤是解决涂抹过程中产生问题的有效手段，但是，现有的人工皮肤大多较为脆弱，力学性能不佳，使用过程中易产生断裂现象。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种力学性能、修复效果皆好的人工皮肤及其制备方法。

本发明提供的人工皮肤，包括：真皮层和表皮层；

其中，真皮层与表皮层贴合；

真皮层包括支架材料与成纤维细胞；

表皮层包括支架材料与表皮细胞；

支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛；

表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。

在本发明的实施例中，真皮层或表皮层的层数为一层或多层，根据患者创面情况及患者自身皮肤情况的不同而不同。

本发明提供的人工皮肤采用3D打印技术，根据患者伤口的情况和患者自身的皮肤情况，将真皮层和表皮层逐层打印，从而获得与患者自身皮肤相近的人工皮肤。由于使用时不需要涂抹，且其结构更加符合患者自身情况，将其用于创面修复能够起到更好的治疗效果，皮肤愈合速度更快，愈合后，伤口更加平滑。并且，由于其具有较好的力学性能，使用时不易发生断裂。

在本发明的实施例中，支架材料中各组分的质量分数为：I型鼠胶原0.8％～1.2％、壳多糖1％～3％，糖胺聚糖4％～6％，戊二醛0.2％～0.6％。

在一些实施例中，支架材料中各组分的质量分数为：I型鼠胶原1％、壳多糖2％，糖胺聚糖5％，戊二醛0.6％。

在本发明的实施例中，糖胺聚糖为6-硫酸软骨素、透明质酸或肝素。

支架材料的成分会影响表皮细胞和成纤维细胞形成皮肤，并且，支架材料的空间构建也会影响细胞向皮肤转化的效果。因此，支架材料的品质对人工皮肤的品质起着至关重要的作用。

本发明提供的人工皮肤的支架材料中以戊二醛作为交联剂，戊二醛用量的不同影响人工皮肤的力学性能、体外降解时间及组织学结构。本发明通过调整戊二醛的用量，制得的人工皮肤内部孔道均匀，尺度适宜细胞生长，抗拉伸能力较强，体外降解时间随戊二醛用量的增加而延长。I型鼠胶原又名鼠尾I型胶原蛋白(Collagenfromrattail,TypeI)，在支架材料中添加适当的含量，能够使支架材料形成凝胶状，凝固后能够使人工皮肤具有良好的弹性和抗拉伸能力，并使表皮细胞或成纤维细胞保持良好的生长状态。壳多糖(chitin)又称几丁质，具有良好的组织相容性，在支架材料中作为交联剂，其能够促进成纤维细胞和表皮细胞的生长，改善人工皮肤的力学性能使其具有良好的弹性和韧性，并且，壳多糖还能够起到一定的抗感染作用，且能够延长人工皮肤的降解时间。糖胺聚糖(glycosaminoglycan)是细胞外基质成分，可促进成纤维细胞的生长，并促进成纤维细胞粘附于支架材料。

本发明通过实验证明，通过调整各组分的种类和比例，本发明提供的支架材料能够使人工皮肤具有良好的力学性能，具有良好的弹性和韧性以及足够长的体外降解时间。并且，可以与创面紧密贴附，不留气泡，提高了创面的恢复效果。

在本发明的实施例中，真皮层中支架材料的体积分数为60％～80％；成纤维细胞的浓度为2×10⁵个/mL～4×10⁵个/mL。

在一些实施例中，真皮层中支架材料的体积分数为70％；成纤维细胞的浓度为3×10⁵个/mL。

在本发明的实施例中，表皮层中支架材料的体积分数为60％～80％；表皮细胞的个数为2×10⁵个/mL～4×10⁵个/mL。

在一些实施例中，表皮层中支架材料的体积分数为70％；表皮细胞的浓度为3×10⁵个/mL。

表皮层或真皮层中的细胞浓度过低则达不到良好的愈合效果，但细胞浓度过大不仅会造成浪费，还会导致细胞因不能得到良好的营养而降低活性。本发明通过实验证明当人工皮肤中，当支架材料的体积分数为60％～80％，人工皮肤中细胞个数为2×10⁵个/mL～4×10⁵个/mL时，愈合效果最佳。

本发明的表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。脂肪干细胞在体内储量丰富、且分化为恶性肿瘤的风险更低。但受多种因素影响，目前，对脂肪干细胞成表皮细胞的分化诱导尚无快速有效的诱导方式，对脂肪干细胞成纤维细胞的分化诱导更是鲜有报道。

在本发明的实施例中，表皮细胞的制备方法为：将脂肪干细胞于EGF、bFGF、ATRA和IGF-1存在条件下诱导培养，得到表皮细胞。

EGF即为表皮生长因子，能够促进受损表皮的修复与再生。

bFGF为成纤维细胞生长因子，具有促进有丝分裂的作用，能够促进创伤组织愈合与组织修复，促进组织再生。

ATRA为全反式维甲酸，是动物体内维生素A的代谢中间产物，能够促进上皮细胞的分化与生长，维持上皮组织正常角化过程。

IGF-1为类胰岛素一号增长因子，能够促进有丝分裂和细胞分化。

本发明采用EGF、bFGF、ATRA和IGF-1作为诱导剂，诱导脂肪干细胞分化为表皮细胞。实验表明，经过7天的诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化，且与其他对照组相比分化速度更快。而现有技术中，将脂肪干细胞分化为表皮细胞需要20天左右的时间。

在一些实施例中，诱导培养的培养基为含有5wt％FBS的DMEM/F12培养基。

在一些实施例中，EGF的浓度为15～25ng/mL；bFGF的浓度为3～7ng/mL；ATRA的浓度为3～7μmol/L；IGF-1的浓度为3～7ng/mL。

在一些实施例中，EGF的浓度为10ng/mL；bFGF的浓度为5ng/mL；ATRA的浓度为5μmol/L；IGF-1的浓度为5ng/mL。

本发明通过实验表明，生长因子的种类、浓度对脂肪干细胞成表皮分化速度的影响十分显著，改变生长因子的种类或浓度会导致分化速度的下降。

在一些实施例中，诱导培养的培养基中还包括地塞米松。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.01～0.2μmol/L。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.1μmol/L。

地塞米松作为抗炎剂使用。

在一些实施例中，脂肪干细胞在诱导培养前，经胰蛋白酶消化、融合。

具体的，脂肪干细胞的胰蛋白酶消化、融合为：取第三代～第五代的脂肪干细胞，加入质量分数为0.25％胰蛋白酶和质量分数为0.02％EDTA进行消化，以血清终止消化后1200r/min离心5min，以DMEM/F12培养基重悬细胞，调整密度为1×10⁴/mL，培养至40％～50％融合。

在一些实施例中，诱导培养过程中每2天更换诱导培养基。

在一些实施例中，诱导培养的时间为7d，温度为37℃，CO₂体积分数5％，饱和湿度95％。

在一些实施例中，第三代～第五代的脂肪干细胞的制备方法包括：将脂肪组织经PBS缓冲液冲洗，以胶原酶消化后，经离心取细胞沉淀后以脂肪干细胞完全培养基培养至80％融合，以胰蛋白酶消化后传代培养至第三代～第五代。

在一些实施例中，诱导培养后，还包括扩增培养、传代的步骤。

在一些实施例中，扩增培养、传代的培养基为表皮细胞无血清培养基SFM。

在一些实施例中，扩增培养、传代过程中，每2天更换培养基。

在一些实施例中，扩增培养、传代的条件为温度为37℃，CO₂体积分数5％，饱和湿度95％。

经试验证明，采用本发明提供的方法，培养7天后细胞形态发生明显改变，由梭形的脂肪干细胞变化为椭圆形或圆形，CK10的表达量升高11倍，CK19的表达量升高78倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方法，诱导7天后能够成功将脂肪干细胞诱导分化成为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的表皮细胞。

在本发明的实施例中，成纤维细胞的制备方法为：将脂肪干细胞于磷酸维生素C和bFGF存在条件下诱导培养，得到成纤维细胞。

磷酸维生素C，又名维生素C磷酸酯，能够促进胶原蛋白生成。

本发明采用磷酸维生素C和bFGF作为诱导剂，诱导脂肪干细胞分化为成纤维细胞。实验表明，经过7～10天的诱导脂肪干细胞向成纤维细胞分化，且与其他对照组相比分化速度更快。

在一些实施例中，bFGF的浓度为5～15μg/mL；磷酸维生素C的浓度为0.5～1.5mmol/L。

在一些实施例中，bFGF的浓度为10μg/mL；磷酸维生素C的浓度为1mmol/L。

本发明通过实验表明，生长因子的种类、浓度对脂肪干细胞成纤维细胞分化速度的影响十分显著，改变生长因子的种类或浓度会导致分化速度的下降。

在一些实施例中，诱导培养的培养基中还包括地塞米松。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.01～0.2μmol/L。

在一些实施例中，地塞米松的浓度为0.1μmol/L。

地塞米松作为抗炎剂使用。

在一些实施例中，诱导培养过程中每2天更换诱导培养基。

在一些实施例中，诱导培养的时间为7d～10d，温度为37℃，CO₂体积分数5％，饱和湿度95％。

在一些实施例中，扩增培养、传代的培养基为成纤维细胞无血清培养基SFM。

经试验证明，采用本发明提供的方法，培养7～10天后细胞仍呈梭形或漩涡形状，虽然形状上与脂肪干细胞十分相似，但是对I型胶原的表达情况检测结果表明，培养后的细胞中I型胶原的表达量升高了124倍，显著优于对照组。说明，采用本发明提供的方法成功将脂肪干细胞诱导分化称为成纤维细胞，且分化速度优于对照组。继续扩增培养、传代过程中，细胞进一步的分化、扩增，从而能够获得更大量的成纤维细胞。

本发明提供的人工皮肤的制备方法包括：

步骤1：扫描患者伤口，获得伤口数据及正常皮肤数据；

步骤2：根据伤口数据建立立体模具；

步骤3：根据正常皮肤数据将真皮层和表皮层打印至立体模具，凝固后经培养，获得人工皮肤；

真皮层包括支架材料与成纤维细胞；

表皮层包括支架材料与表皮细胞；

支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醇；

表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。

在本发明的实施例中，支架材料的制备方法为：0℃～4℃，依次向DMEM/F12培养基中加入I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛，然后调节pH值为7.2～7.4，制得支架材料。

在本发明的实施例中，真皮层的制备方法为：以PBS缓冲液重悬成纤维细胞使密度为0.7×10⁶个/mL～1.3×10⁶个/mL制得成纤维细胞悬液；将成纤维细胞悬液加入支架材料，获得真皮层。

在本发明的实施例中，表皮层的制备方法为：以PBS缓冲液重悬表皮细胞使密度为0.7×10⁶个/mL～1.3×10⁶个/mL制得表皮细胞悬液；将表皮细胞悬液加入支架材料，获得表皮层。

在本发明的实施例中，培养的培养基为：含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，其中FBS的质量分数为10％，双抗的质量分数为1％。

所述双抗为青霉素和链霉素的混合物。

在本发明的实施例中，培养的温度为37℃；条件为5％CO₂，饱和湿度；时间为9～11天。

作为优选，扫描伤口采用3D打印机内置的激光器。

作为优选，伤口数据包括伤口的大小、形状、薄厚。

作为优选，正常皮肤数据包括患者正常皮肤的真皮层厚度和患者正常皮肤的表皮层厚度。

作为优选，建立立体模具利用Srudio软件将图像转化为立体光刻文件，据此制备立体模具。

具体的，本发明提供的人工皮肤的制备方法包括：利用3D打印机内置的激光器对患者的皮肤伤口进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的伤口图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，据此建立立体模具。将真皮层和表皮层放进不同的喷墨盒中，根据伤口数据和正常皮肤数据将真皮层和表皮层逐层喷涂在立体模具上，打印完成后使至凝固50min～60min后，从基材上剥离下来，放在培养基(DMEM/F12，10％FBS，1％双抗)中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天后获得人工皮肤。

本发明提供了一种人工皮肤及其制备方法，该人工皮肤中包括：真皮层和表皮层；其中，真皮层与表皮层贴合；真皮层包括支架材料与成纤维细胞；表皮层包括支架材料与表皮细胞；支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛；表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。本发明提供的人工皮肤采用3D打印技术，根据患者伤口的情况和患者自身的皮肤情况，将真皮层和表皮层逐层打印，从而获得与患者自身皮肤相近的人工皮肤。由于使用时不需要涂抹，且其结构更加符合患者自身情况，将其用于创面修复能够起到更好的治疗效果，皮肤愈合速度更快，愈合后，伤口更加平滑。并且，由于其具有较好的力学性能，使用时不易发生断裂。其中表皮细胞和成纤维细胞的制备采用脂肪干细胞分化，采用本发明提供的诱导方法，脂肪干细胞成表皮细胞分化或成纤维细胞分化的速度更快。

附图说明

图1示原代培养脂肪干细胞的倒置显微镜(100×)观察结果，其中，图1-a示原代培养48h后观察结果；图1-b示原代培养5天后观察结果；

图2示流式细胞仪检测扩增培养至第三代的脂肪干细胞表面抗原表达情况；

图3示脂肪干细胞成表皮细胞诱导培养后以倒置显微镜放大40倍观察细胞形态结果；其中图3-a示诱导培养前脂肪干细胞形态，图3-b示实验组细胞诱导培养后形态；图3-c示对照组1细胞诱导培养后形态；图3-d示对照组2细胞诱导培养后形态；图3-e示对照组3细胞诱导培养后形态；图3-f示对照组4细胞诱导培养后形态；

图4示免疫荧光染色检测诱导分化后细胞CK19的表达情况；其中，图4-a示实验组细胞CK19表达情况；图4-b示对照组1细胞CK19表达情况；图4-c示对照组2细胞CK19表达情况；图4-d示对照组3细胞CK19表达情况；图4-e示对照组4细胞CK19表达情况；

图5示脂肪干细胞成纤维细胞诱导培养后以倒置显微镜放大40倍观察细胞形态结果；其中图5-a示诱导培养前脂肪干细胞形态，图5-b示实验组细胞诱导培养后形态；图5-c示对照组1细胞诱导培养后形态；图5-d示对照组2细胞诱导培养后形态；图5-e示对照组3细胞诱导培养后形态；

图6示免疫荧光染色检测诱导分化后细胞I型胶原的表达情况；其中，图6-a示实验组细胞I型胶原表达情况；图6-b示对照组1细胞I型胶原表达情况；图6-c示对照组2细胞I型胶原表达情况；图6-d示对照组3细胞I型胶原表达情况；

图7实施例6制得的人工皮肤的电镜图；

图8示人工皮肤修复裸鼠皮肤缺损实验术后一个月的实施例6提供的人工皮肤组织学观察(40×)。

具体实施方式

本发明提供了一种人工皮肤及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，脂肪干细胞完全培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司；

成纤维细胞无血清培养基购自广州仪涛科学仪器有限公司；

表皮细胞无血清培养基SFM购自广州仪涛科学仪器有限公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1人脂肪干细胞(ADSCs)的分离与培养

通过脂肪抽吸术获取的人体腹部皮下脂肪组织抽提液(术前己排除内分泌疾病及传染病)800g离心，用PBS缓冲液冲洗，浸泡，再800gx4min洗涤3次。

剔除肉眼可见的血管及结蹄组织，用眼科剪将其充分剪碎后放入50ml离心管，加入2倍体积0.5％胶原酶、1倍体积1％BSA和双抗，混匀，封口，放入摇床中37℃消化50min，至糊状为止。

加入等体积的含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM终止消化，1800r/min离心10min，离心后分为3层，上层为油脂及未消化完全的脂肪组织，中层为上清液，下层为脂肪干细胞和红细胞等混合细胞的沉淀。

弃上层和中层，下层加入完全培养基重悬细胞沉淀，70um细胞筛网过滤，

将滤过后的滤液调整细胞浓度为5x10⁵单核细胞/mL接种于T-25cm²培养瓶中，37℃、5％CO₂、饱和湿度培养。

48h后换液，加入脂肪干细胞完全培养基继续培养。

细胞培养至80％融合时，采用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化传代至第三代～第五代。

期间用倒置显微镜观察，观察结果如图1所示，结果显示：原代细胞培养24h后，可见少量细胞贴壁；48h后(图1-a)，倒置显微镜下见圆形、短梭形、不规则形细胞；换液后，细胞迅速生长，梭形细胞明显增多，部分细胞可见多个突起，4-5天(图1-b)开始单层融合，呈成纤维样细胞，生长迅速，3天传代一次，随着代数增多，细胞形态逐渐均一。

实施例2人脂肪干细胞(ADSCs)表面标记的鉴定

取对数生长期第3代的细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。

1000rpm,离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁵-10⁶个/ml。

取2个上样管，每管加入500ul的单细胞悬液，离心后1号管标为标准对照，2号各加入2μlFITC或PE标记的小鼠抗人细胞表面分子CD59、CD45、CD34、CD105抗体工作液。

室温，避光，孵育20min。

PBS洗两遍，以去除未结合的抗体，500ul的1640培养基重悬后，上流式细胞仪鉴定表面标记。

鉴定结果如图2所示，以未加抗体的实验为对照，流式细胞仪检测ADSCs表面抗原显示：扩增第3代的ADSCs CD59、CD90呈阳性表达，而HLA-DR、CD45呈阴性表达，符合干细胞的特性。

实施例3人脂肪干细胞向表皮细胞的诱导分化

取实施例1制得的取第三代～第五代的ADSCs，吸去培养上清后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化。1200r/min离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密度为1x104/ml，接种于6孔板中，每孔2ml。当细胞达到40％-50％融合时，应用表1所示培养基，同样环境下诱导培养，每2天更换诱导培养基，培养7天后，取部分细胞检测相关指标，其余细胞用表皮细胞无血清培养基SFM继续培养、传代，每2天更换完全培养基一次。

表1 脂肪干细胞成表皮细胞诱导分化实验设计

培养后以倒置显微镜观察细胞形态结果如图3所示，结果显示和诱导前相比较，诱导培养7天后，对照组1的细胞形态未发生明显改变；对照组2、对照组3和对照组4部分细胞发生形态改变，由梭形变成圆形或椭圆形，细胞大小不一；实验组大部分细胞呈圆形或椭圆形，排列成典型的铺路石状，说明实验组诱导7d后，细胞已分化为表皮细胞，而对照组1未分化，对照组2、对照组3和对照组4只有部分细胞分化。

采用Real-time PCR检测CK10及CK19表达情况，以免疫荧光法检测CK19表达从而鉴定细胞分化效果。具体方法为：

一、Real-time PCR检测CK10及CK19表达情况

1、细胞总RNA抽提

将诱导前、对照组及实验组的细胞利用胰酶消化后，离心收集细胞沉淀，加入500μL硕盟TRIzol试剂，在室温下放置5min使其充分裂解；向裂解液中加入100μL氯仿，漩涡振荡器震荡，使溶液充分混匀，室温静置3min；4℃，10000rpm离心15min；离心后取出离心管，样品分为三层，小心将上层清水相吸至新的EP管中；向上清水相中加入等体积的异丙醇，漩涡振荡器震荡混匀，室温静置5min,4℃，10000rpm离心15min；倒掉上清，缓慢加入1mL75％的预冷乙醇，轻轻混匀洗涤沉淀；用枪头小心吸去液体，加入50μL的DEPC水后漩涡振荡器混匀，充分溶解RNA沉淀；取RNA样品2μL，利用核酸蛋白分析仪器测定样品的浓度。

2、细胞cDNA获取

利用TAKARA公司的Prime Script^TM RT reagent Kit逆转录试剂盒在较短时间内高效合成Real Time PCR用cDNA，具体步骤如下：

按照表2组分配制RT反应液(反应液配制必须在冰上进行)。

表2反应液

试剂	使用量	终浓度
			5*Prime Script Buffer(for Real Time)	2μL	1*
Prime Script RT Enzyme	0.5μL
			Oligo dT Primer(50μM)	0.5μL	25pmol
Random 6mers(100μM)	0.5μL	50pmol
			Total RNA	5uL
RNase Free dH₂O	up to 10μL

将反应液分装到PCR管中，放入PCR仪中，按下列条件进行逆转录反应反转录反应条件如表3

表3 反转录条件

循环步骤	温度	时间
			反转录反应	37℃	15min
反转录酶的失活反应	85℃	5sec
				4℃	保持

将逆转录后得到的cDNA稀释，每10μL体系中加入65μLDEPC水放于4℃保存备用。

3、Real-time PCR检测因子表达

GAPDH、CK10及CK19因子Real-time PCR特异性引物序列由网站NCBI提供，由上海生物工程有限公司合成。其中GAPDH作为内参，所有的引物序列都经过验证显示具有良好的特异性和敏感性。引物序列如表4：

表4 引物序列

基因	Primer F(上游引物)	Primer R(下游引物)
			GAPDH	5’-GTCATTGAGAGCAATGCCAG-3’	5’-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3’
CK10	5’-TTAACACCAGCCGTGAAAAATG-3’	5’-AGAACTCTACCGTCGGGCG-3’
			CK19	5’-AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3’	5’-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3’

得到引物后进行短暂离心，根据离心管上的要求加入一定量的DEPC水溶解引物并将其稀释成10μM储存于-20℃备用。

以反转录后的cDNA作为模板，采用BIO-RAD公司的SsoFast^TM EvaGreenSupermix试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增炎症因子，具体步骤如下：

(1)按照下列组分配制Real-timePCR反应液

表5 Real-timePCR反应液

试剂	使用量	终浓度
			SsoFast EvaGreen supermix	5μL	1*
Forward primer	0.5μL	300-500nM
			Reverse primer	0.5μL	300-500nM
DNA template	4μL
			Total volume	10μL

将反应液混匀后加入96孔Real-time PCR板中，每孔10μL，设为4个复孔。将反应板放入BIO-RAD CFX96^TMReal-time system仪器中，按照下列反应条件进行Real-time PCR，最后根据得到的C_(t)值，以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量：

表6 Real-time PCR程序

检测结果如表7所示：

表7 检测结果

	CK10相对表达量	CK19相对表达量
			诱导前	1	1
实验组	11**	78**
			对照组1	1.2	0.9
对照组2	5**	35**
			对照组3	4**	28**
对照组4	7**	62**

注，**示存在显著性差异(p<0.01)

ADSCs向表皮细胞诱导分化7天后，抽取细胞RNA并反转录成cDNA后利用荧光定量PCR仪检测CK10及CK19的表达情况，如下图所示，和诱导前相比较，对照组1的CK10和CK19的表达量无明显变化；对照组2的CK10表达量升高5倍，对照组3的CK10表达量升高4倍，对照组4的CK10表达量升高7倍，实验组的表达量升高11倍；对照组2的CK19表达量升高35倍，对照组3的CK19表达量升高28倍，对照组4的CK19表达量升高62倍，实验组的CK19表达量升高78倍。CK10和CK19的表达量升高说明脂肪干细胞已向表皮细胞分化，而且实验组明显比对照组1和对照组2的诱导分化速度快。

二、免疫荧光染色检测诱导分化后细胞表面的CK19的表达

将对照组及实验组的细胞悬液接种到6孔板中培养至50-60％融合，PBS洗涤3次，每次5min。

4％的多聚甲醛室温固定10min，PBS洗涤3遍，每次5min。

用0.2％TritonX-100对细胞透化处理10min，PBS洗涤3遍，每次5min。

加10％血清，37℃孵育15min，倾去血清，PBS洗涤两遍，加入小鼠抗人CK19抗体工作液50ul，室温孵育1h，阴性对照用PBS代替抗体。

PBS洗涤3次，每次5min，滴加荧光标记的二抗工作液37℃孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min。

加入0.5ug/mlDAPI染色10min，PBS洗涤3次，每次5min。

50％甘油封片，在荧光显微镜下观察实验结果并拍照。结果如图4所示：结果显示：ADSCs向表皮细胞诱导分化7天后，利用免疫荧光染色法检测CK19的表达情况，发现对照组1免疫荧光染色呈阴性，对照组2和实验组免疫荧光染色呈阳性，但是实验组的免疫荧光染色的细胞数要比对照组2的细胞数量多。

实施例4人脂肪干细胞向成纤维细胞的诱导分化及鉴定

取实施例1制得的第三代～第五代的ADSCs，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化。

1200rpm离心5min，脂肪干细胞完全培养基重悬，调整密度为1x10⁴/ml，接种于6孔板中，每孔2ml。

当细胞达到40％-50％融合时，应用表8所示培养基，同样环境下诱导培养，每2天更换诱导培养基，培养7～10天后，取部分细胞检测相关指标，其余细胞用成纤维细胞完全培养基继续培养、传代，每2天更换完全培养基一次。

表8 脂肪干细胞成表皮细胞诱导分化实验设计

培养后以倒置显微镜观察细胞形态结果如图5所示，ADSCs诱导分化10天后，细胞形态无明显变化，细胞仍呈梭形及旋涡状生长。这是因为成纤维细胞形态与脂肪干细胞的形态十分相近。

采用Real-time PCR和免疫荧光法检测I型胶原表达情况，检测方法如实施例3记载，其中：

GAPDH、I型胶原Real-time PCR特异性引物如表9：

表9 Real-time PCR特异性引物

基因	Primer F(上游引物)	Primer R(下游引物)
			GAPDH	5’-GTCATTGAGAGCAATGCCAG-3’	5’-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3’
I型胶原	5’-CTGGTACGGCGAGAGCAT-3’	5’-CAGGCTCCGGTGTGACTC-3’

以诱导前细胞中基因的表达量为参照，计算诱导后细胞中目的基因相对于诱导前的表达量，如表10所示：

表10 检测结果

	I型胶原相对表达量
		诱导前	1
实验组	124**
		对照组1	1.1
对照组2	78**
		对照组3	57**

注，**示存在显著性差异(p<0.01)

ADSCs向成纤维细胞诱导分化10天后，抽取细胞RNA并反转录成cDNA后利用荧光定量PCR仪检测I型胶原的表达情况，如下图所示，和诱导前相比较，对照组1的I型胶原的表达量无明显变化；对照组2的I型胶原表达量升高78倍；对照组3的I型胶原表达量升高57倍；实验组的表达量升高124倍，说明脂肪干细胞已向成纤维细胞分化，而且实验组明显比对照组1、对照组2和对照3的诱导分化速度快。

免疫荧光染色检测诱导分化后细胞I型胶原的表达情况如图6所示：ADSCs向成纤维细胞诱导分化10天后，利用免疫荧光染色法检测I型胶原的表达情况，发现对照组1免疫荧光染色呈阴性，对照组2、对照组3和实验组免疫荧光染色呈阳性，但是实验组的免疫荧光染色的细胞数要比对照组2、对照组3的细胞数量多。

实施例5～8人工皮肤的制作

1、表皮层、真皮层的制备

在50ml离心管中，在冰浴条件下向DMEM/F12培养基中先后加入表11中所述成分，每一步充分搅拌混匀，然后以DMEM/F12培养基定容至70ml，并用1mol/L氢氧化钠调pH值至7.2-7.4制成支架材料溶液。

表11 实施例5～8支架材料

实施例	I型鼠胶原(g)	壳多糖(g)	糖胺聚糖(g)	戊二醛(g)
					5	0.8	1	4	0
6	1	2	5	0.2
					7	1.2	3	6	0.4
8	1	2	5	0.6

将实施例3制备的表皮细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm,离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁶个/ml，制成表皮细胞悬液30mL。

将20～40mL表皮细胞悬液迅速加入60～80mL支架材料溶液中，混匀，制得100mL表皮层。

将实施例4制备的成纤维细胞，吸出培养基后，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA的消化液进行消化，之后用适量血清终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液。1000rpm，离心10min，弃上清，用4℃遇冷的PBS洗涤细胞3次后重悬均匀，调整细胞浓度约为10⁶个/ml，制成表皮细胞悬液30mL。

表12 实施例5～8

2、人工皮肤的打印

利用3D打印机内置的激光器对患者的皮肤伤口进行扫描，获得伤口的大小、形状、薄厚以及患者正常皮肤的表皮真皮厚度等数据，然后利用PlyEdit软件对扫描后的图像进行消除数字噪音等处理并对其进行编辑，使之产生一个连续的表面图像；利用Studio4.0软件将图像转化为立体光刻(.STL)文件并导入至Solid Works软件，使扫描后的伤口图像转变为一个虚拟立体图像(或模块)，可以用来直接打印出对应的皮肤。

利用已经建好的3D人工皮肤磨具，根据“逐层打印”的原理将表12中制备的表皮层和真皮层一层层喷涂在基材上，打印的层数根据不同的患者的正常皮肤情况而不同，打印完成后使之凝固50-60min，待凝固后，人工皮肤从基材上剥离下来，并放在培养基(DMEM/F12，10％FBS，1％双抗)中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天，制得人工皮肤，可直接用于患者。

对比例1～4

1、表皮层、真皮层的制备

表13 实施例1～4支架材料

对比例	I型鼠胶原(g)	壳多糖(g)	糖胺聚糖(g)	戊二醛(g)
					1	0.8	1	4	0
2	1	2	5	0.2
					3	1.2	3	6	0.4
44	1	2	5	0.6

表14 对比例1～4

将对比例1～4的表皮层和真皮层涂抹至立体模具，使之凝固50-60min，待凝固后，人工皮肤从基材上剥离下来，并放在培养基(DMEM/F12，10％FBS，1％双抗)中于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养10天，制得人工皮肤，可直接用于患者。

实施例9人工皮肤体外评价

取实施例5～8及对比例1～4制备的人工皮肤检测力学特性、降解特性，并进行组织学观察：

1、力学性能评价

利用镊子夹，观察3D人工皮肤是否破碎，以此来判断人工皮肤的弹性和韧性；并且观察刚打印的人工皮肤和培养10天后的人工皮肤在形状、厚度、弹性上是否有明显的变化。结果显示，实施例5～8制备的人工皮肤，低温下呈液态流动性良好，可用移液器吸取；当其打印成人工皮肤后静置50-60min后，复合物成胶；固态的人工皮肤机械强度良好，可用手术钳夹取，加入培养基后不松散，在板中培养10天后仍保持形状完整，未见破碎与大幅降解。而对比例1～4制备的人工皮肤虽然也具有良好的流动性，但机械强度明显不佳，用手术钳夹取会出现分层现象，加入培养基培养10天后，有断裂及破碎现象产生。

2、体外降解性评价

称取2mg支架材料置于盛有1.9mL Tris-CaCl₂缓冲液(pH7.6)的试管中，并加入新配置的2mL胶原酶溶液，置于37℃温育，定时观察，每次三个平行实验，记下样品完全澄清的时间，取平均值。结果如表15所示：

表15 人工皮肤体外降解时间

	实施例5	实施例6	实施例7	实施例8
					降解时间/h	27.0	34.9	38.7	45.2

本发明提供的人工皮肤体外降解时间随交联剂的用量不同，可控制在比较宽的范围，可满足各类人群对支架材料降解速率的不同要求。

3、组织学观察

取培养10天的3D人工皮肤，用2.5％戊二醛固定，4℃，24h以上。PBS漂洗3遍，每次10min后加入2％的锇酸固定2h。50％、70％、90％、100％的酒精梯度脱水3次，每次10min。浸透、用环氧树脂包埋，做常规超薄切片,透射电镜观察、拍照。其中，实施例6制得的人工皮肤的电镜图如图7所示，结果显示：人工皮肤内部孔道均匀，尺度适宜细胞生长；细胞在内部呈梭形生长。其他实施例制得的人工皮肤电镜检测结果与此相似。

实施例10人工皮肤修复裸鼠皮肤缺损实验

1、裸鼠缺损模型构建

利用BALB/C裸鼠30只，体重20-25g，随机分为5组，每组6只。实验组：应用实施例5～8制备的人工皮肤修复皮肤缺损；对照组：应用对比例1～4制备的人工皮肤修复皮肤缺损。

裸鼠称重，3.5％水合氯醛行腹腔内注射麻醉。75％酒精消毒裸鼠背部皮肤，于背部正中标记的皮肤剪除范围。

取眼科剪沿切口线剪除皮肤、肉膜，形成基底为肌肉的创面。

取实施例5～8构建的人工皮肤，用PBS清洗后，覆盖于裸鼠背部创面，用丝线缝合固定于深层肌肉，防止创面周围皮肤收缩。

用绸辅料、纱布覆盖术区，缝线包压。

裸鼠清醒后，继续进行饲养。并与1个月后检测各个项目指标。

2、皮肤缺损修复情况：

术后1个月，观察对照组、实验组裸鼠背部皮肤缺损修复情况。结果显示，30只裸鼠手术过程顺利，29只裸鼠生存至实验结束。其中对照组老鼠死亡1只。术后1个月，将裸鼠背部的敷料拆除。结果表明：对照组裸鼠背部创面未愈合，仍覆盖薄层痂皮，创伤边缘轻度收缩；而实验组裸鼠的皮肤成活良好，无毛发生长，色泽与周围正常皮肤相似。

3、组织学观察：

术后1个月，实验组裸鼠背术区皮肤取材，10％甲醛固定，脱水，石蜡包埋，组织切片，苏木精染色，蒸馏水漂洗，丙酮、二甲苯脱水，封片。显微镜下观察组织结构特点。其中，实施例6制得人工皮肤的检测结果如图8所示：术后1个月，光镜下可见人工皮肤的结构与正常皮肤相似。真皮的胶原纤维排列与表皮平行，其内可见散在的毛细血管和大量呈长梭形的成纤维细胞，无毛囊和汗腺等结构。表皮细胞为矮柱状或立方状，胞核呈圆形。其他实施例制得的人工皮肤检测结果与此相似。

实施例11人工皮肤修复人体溃疡面实验

招募6名患有皮肤溃疡的志愿者。以实施例6提供的真皮层和表皮层，根据患者的伤口打印出人工皮肤，并将其移植到志愿者的溃疡面，观察移植后人工皮肤临床情况。皮肤移植后患者即可自由活动，精神、食欲正常。移植的组织工程皮肤均存活，外观较平整，移植后第7天，移植的复合皮颜色变暗，术后创周皮肤无一例出现红肿、渗出，所有创面愈合良好,移植物下无出血、积脓、坏死等不良反应。无一移植区出现过敏反应，无急性排斥反应。实验结束时无一例移植区皮肤坏死，移植创面平整，弹性好，与周围皮肤融为一体，颜色与正常皮肤相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种人工皮肤，其特征在于，包括：真皮层和表皮层；

所述真皮层与所述表皮层贴合；

所述真皮层包括支架材料与成纤维细胞；

所述表皮层包括支架材料与表皮细胞；

所述支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛；

所述表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。

2.根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，所述支架材料中各组分的质量分数为：I型鼠胶原0.8％～1.2％、壳多糖1％～3％，糖胺聚糖4％～6％，戊二醛0～0.6％。

3.根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，所述真皮层中支架材料的体积分数为60％～80％；成纤维细胞的浓度为2×10⁵个/mL～4×10⁵个/mL。

4.根据权利要求1所述的人工皮肤，其特征在于，所述表皮层中所述支架材料的体积分数为60％～80％；表皮细胞的个数为2×10⁵个/mL～4×10⁵个/mL。

5.如权利要求1～4任一项所述的人工皮肤的制备方法，其特征在于，包括：

步骤1：扫描患者伤口，获得伤口数据及正常皮肤数据；

步骤2：根据所述伤口数据建立立体模具；

步骤3：根据所述正常皮肤数据将所述真皮层和所述表皮层打印至所述立体模具，凝固后经培养，获得人工皮肤；

所述真皮层包括支架材料与成纤维细胞；

所述表皮层包括支架材料与表皮细胞；

所述支架材料包括：DMEM/F12培养基、I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醇；

所述表皮细胞和成纤维细胞由脂肪干细胞分化制得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述支架材料的制备方法为：0℃～4℃，依次向DMEM/F12培养基中加入I型鼠胶原、壳多糖、糖胺聚糖和戊二醛，然后调节pH值为7.2～7.4，制得支架材料。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述真皮层的制备方法为：以PBS缓冲液重悬成纤维细胞使密度为0.7×10⁶个/mL～1.3×10⁶个/mL制得成纤维细胞悬液；将成纤维细胞悬液加入支架材料，获得真皮层。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表皮层的制备方法为：以PBS缓冲液重悬表皮细胞使密度为0.7×10⁶个/mL～1.3×10⁶个/mL制得表皮细胞悬液；将表皮细胞悬液加入支架材料，获得表皮层。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养的培养基为：含有FBS和双抗的DMEM/F12培养基，其中FBS的质量分数为10％，双抗的质量分数为1％。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃；条件为5％CO₂，饱和湿度；时间为9～11天。