CN106474527A - 一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，所述制备方法包括毛发角蛋白的制备、细胞悬液的制备以及敷料的制备。本发明的工程敷料是一种效果极佳的创面覆盖物，其有效阻止细菌感染，加速创面愈合，具有良好的生物相容性，控制和吸收创面渗液，透气性强，适合气体和水蒸气透过，保护新生组织，无毒副作用等优势；更重要的是，该工程敷料能自行溶解被机体吸收，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。

Description

一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法
技术领域
本发明涉及一种敷料，具体涉及一种应用于创面的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法。
背景技术
人体和动物体的创伤随处可见，各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。而目前主要是通过西药等治疗，临床上还没有通过生物材料等来修复创伤。
成纤维细胞是创面愈合的主要修复细胞，它在创面修复过程中活化、增殖、合成胶原。本申请拟以角蛋白生物材料作为支架系统，复合成纤维细胞，构建模拟机体组织和功能的组织工程化敷料，重建或恢复皮肤屏障，形成具有生物敷料性质的创面覆盖物，起到皮肤屏障功能的部分作用；同时，随着创伤慢慢愈合和自身皮肤生长，它能自行溶解被机体吸收，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，所述制备方法包括毛发角蛋白的制备、细胞悬液的制备以及敷料的制备，具体方法如下：
(1)毛发角蛋白的制备，该毛发角蛋白为毛发角蛋白颗粒或毛发角蛋白凝胶：
①毛发角蛋白颗粒的制备
S1：脱脂与软化：称取毛发进行脱脂和软化；
S2：脱色：将软化后的毛发放置于脱色溶液中进行脱色，所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠3～5重量份、过硫酸钾1～2重量份、双氧水70～90体积份、浓氨水22～33体积份以及水350～450体积份；
S3：清洗、烘干：将脱色后的毛发进行清洗，并且干燥；
S4：粉末制备：在干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到长度为0.1～2mm的毛发粗粉；将粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，旋转，球磨，直至粒径50μm～90μm为止，则为毛发角蛋白颗粒匀浆；
S5：离心：在匀浆中加入生理盐水进行离心，弃去上清液，并去除沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，加生理盐水混匀继续离心，重复上述操作2～4次，最后仍然取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，则得到为高纯度的毛发角蛋白泥；
S6：灭菌：包装，密封，采用钴60辐照法灭菌，保存，待用；
②毛发角蛋白凝胶的制备
将步骤S6中灭菌后的毛发角蛋白泥加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育2-3小时，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到毛发角蛋白凝胶；
(2)细胞悬液的制备
A.骨髓间充质细胞的分离以及细胞原代培养：将骨髓血离心，吸取单核细胞层，离心，弃去上清，在培养液中重悬细胞，接种，在培养箱内进行原代培养；
B.传代细胞的扩增培养：移去培养液，胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；制成单细胞悬液，以1:2传代，待梭形细胞逐渐长成单层并达到70～90％融合时，胰酶消化，按1:2或1:4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液；
(3)敷料的制备：将步骤(1)中制备的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的细胞悬液混合均匀，得到工程辅料。
进一步地，所述毛发角蛋白与细胞悬液的重量比为1～2:3～5。
进一步地，步骤(1)的S1中，所述脱脂和软化的方法为：用乙醇浸泡20～60分钟，浸泡过程中每间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；冲洗后，将毛发放置于次氯酸钠与水配制的溶液中浸泡20～60分钟，在该浸泡过程中间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗。
进一步地，步骤(1)的S2中，将软化后的毛发放置于脱色溶液中2-3个小时，在脱色过程中间隔10～30分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗，洗掉脱色溶液为止；所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠4重量份、过硫酸钾1.5重量份、双氧水80体积份、浓氨水27.5体积份以及水400体积份。
进一步地，步骤(1)的S3中，将脱色后的毛发在水中浸泡，浸泡完毕用水冲洗，过滤，在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜。
进一步地，步骤(1)的S1中，所述次氯酸钠与水的体积比为1～5:9，所述次氯酸钠为10％次氯酸钠；
进一步地，步骤(1)的S2中，将放置有毛发的脱色溶液置于37℃恒温中进行脱色；所述焦磷酸钠为99％焦磷酸钠，过硫酸钾为99.5％过硫酸钾，双氧水为30％双氧水，浓氨水为25％浓氨水。
进一步地，步骤(1)的S4中，球磨：将粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml，球磨1～3小时，在显微镜下观察粒径大小，再加入生理盐水5ml继续研磨，直至形成粒径约60μm-80μm；所述玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗；
进一步地，步骤(1)的S6中，将得到的高纯度的毛发角蛋白泥包装采用钴60辐照法灭菌，剂量12Kg。
进一步地，步骤(1)的②中，毛发角蛋白泥加入水充分混匀，放置于37℃温箱孵育2-3小时。
进一步地，所述毛发角蛋白凝胶还能够通过以下方法制备：(1)毛发角蛋白成盐：①称取毛发，在毛发中加入乙醇和水的混合溶液，加热，逐渐升高温度至溶液开始回流，边回流边滴加碱溶液，至pH值为6.5～7.5时，回流与滴加同时结束，结束后，继续搅拌，使反应完全，得到成盐毛发角蛋白；②将所得到的成盐毛发角蛋白滤出，洗液冲洗，洗涤至不呈碱性，干燥，得到毛发角蛋白磺酸盐；③将所得到的毛发角蛋白磺酸盐粉碎至微米级，冻干，得到毛发角蛋白磺酸盐粉末；(2)毛发角蛋白凝胶的制备：称取毛发角蛋白磺酸盐粉末，加入水，充分混匀，放置于温箱中，至呈现较为均一的颜色和性状为止，采用钴60 辐照法灭菌，得到毛发角蛋白凝胶。
进一步地，所述毛发包括人头发或动物毛发；步骤(2)的A中所述的骨髓血包括猪骨髓血和鼠骨髓血中的任意一种，则相应地，所述骨髓间充质细胞包括猪骨髓间充质细胞和鼠骨髓间充质细胞的任一种。
进一步地，步骤(2)的A的原代培养中，吸取单核细胞层后，加入LG-DMEM，常温离心，洗涤，弃去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶内，置于37℃，5％CO2，相对湿度70％的培养箱内进行原代培养。
进一步地，步骤(2)的B的传代培养中，：原代细胞培养至细胞融合为单层，细胞融合率达80％时，移去培养液，洗涤，加入0.25％胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；用吸管吹打成单细胞悬液，以1∶2传代，每隔2-3天换液一次，逐渐除去血细胞，待梭形细胞逐渐长成单层并达到80％融合时，0.25％胰酶消化，按1：2或1：4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液。
本发明提供了一种应用于创伤部位的毛发角蛋白复合细胞悬液工程化敷料的制备方法，其主要具有的有益效果为：
本发明的工程敷料是一种效果极佳的创面覆盖物，(1)其有效阻止细菌感染，(2)加速创面愈合，(3)具有良好的生物相容性，(4)控制和吸收创面渗液，(5)透气性强，适合气体和水蒸气透过，(6)保护新生组织，(7)无毒副作用，无免疫原性，不会过敏等优势；更重要的是，该工程敷料能自行溶解被机体吸收，免除了解除时流血多及病人的痛苦，也不会留下碎屑而延缓伤口的愈合，为促进皮肤的再生提供一个有利于创面愈合的环境。该工程敷料能够极好的应用于人体或动物体的创伤面处。
附图说明
下面根据附图对本发明作进一步详细说明。
图1是本发明实施例所述的将工程敷料敷于创面的动物模型示意图；
图2是本发明实施例所述的21天以后创面恢复后的示意图；
图3是本发明实施例所述的第8周后填充部位皮肤免疫组织化学染色观察情况示意图；
图4是本发明实施例所述的10％凝胶化的毛发角蛋白的性状示意图；
图5是本发明实施例所述的4％凝胶化的毛发角蛋白的性状示意图；
图6是本发明实施例所述的健康成纤维细胞状态的示意图；
图7是本发明实施例所述的骨髓间充质细胞P0代的生长状况示意图；
图8是本发明实施例所述的骨髓间充质细胞P2代的生长状况示意图；
图9是本发明实施例所述的骨髓间充质细胞P3代的生长状况示意图；
图10是本发明实施例所述的骨髓间充质细胞P5代的生长状况示意图。
具体实施方式
本发明实施例所述的一种工程化敷料的制备方法。下面以具体实验案例为例来说明具体实施方式，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种工程化敷料的制备方法，所述制备方法包括毛发角蛋白的制备、细胞悬液的制备以及敷料的制备，具体方法如下：
(1)毛发角蛋白的制备：
S1：脱脂与软化：称取毛发进行脱脂和软化；
S2：脱色：将软化后的毛发放置于脱色溶液中进行脱色，所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠3～5重量份、过硫酸钾1～2重量份、双氧水70～90体积份、浓氨水22～33体积份以及水350～450体积份；
S3：清洗、烘干：将脱色后的毛发在水中浸泡，浸泡完毕用水冲洗，过滤，在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜
S4：粉末制备：在干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到长度为0.1～2mm的毛发粗粉；将粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，旋转，球磨，直至粒径50μm～90μm为止，则为毛发角蛋白颗粒匀浆；
S5：离心：在匀浆中加入生理盐水进行离心，弃去上清液，并去除沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，加生理盐水混匀继续离心，重复上述操作2～4次，最后仍然取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，则得到为高纯度的毛发角蛋白泥；
S6：灭菌：包装，密封，采用钴60辐照法灭菌，剂量12Kg，保存，得到颗粒状或粉末状的毛发角蛋白，待用；
(2)细胞悬液的制备
A.骨髓间充质细胞的分离以及细胞原代培养：将骨髓血离心，吸取单核细胞层，离心，弃去上清，在培养液中重悬细胞，接种，在培养箱内进行原代培养；
B.传代细胞的扩增培养：移去培养液，胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；制成单细胞悬液，以1:2传代，待梭形细胞逐渐长成单层并达到70～90％融合时，胰酶消化，按1:2或1:4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液；
(3)敷料的制备：将步骤(1)中制备的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的细胞悬液混合均匀，得到工程辅料。
作为进一步优选地实施方式，所述毛发角蛋白与细胞悬液的重量比为1～2:3～5，优选1:4。
作为进一步优选地实施方式，步骤(1)的S1中，所述脱脂和软化的方法为：用乙醇浸泡20～60分钟，浸泡过程中每间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；冲洗后，将毛发放置于次氯酸钠与水配制的溶液中浸泡20～60分钟，在该浸泡过程中间隔3～10分钟搅拌一次,浸泡完毕后流水冲洗；
作为进一步优选地实施方式，步骤(1)的S2中，将软化后的毛发放置于脱色溶液中2-3个小时，在脱色过程中间隔10～30分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗，洗掉脱色溶液为止；所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠4重量份、过硫酸钾1.5重量份、双氧水80体积份、浓氨水27.5体积份以及水400体积份。
作为进一步优选地实施方式，步骤(1)的S1中，所述次氯酸钠与水的体积比为1～5:10，优选1:9，所述次氯酸钠为10％次氯酸钠。
作为进一步优选地实施方式，步骤(1)的S2中，将放置有毛发的脱色溶液置于37℃恒温中进行脱色；所述焦磷酸钠为99％焦磷酸钠，过硫酸钾为99.5％过硫酸钾，双氧水为30％双氧水，浓氨水为25％浓氨水。
作为进一步优选地实施方式，步骤(1)的S4中，球磨：将粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml，球磨1～3小时，在显微镜下观察粒径大小，再加入生理盐水5ml继续研磨，直至形成粒径约60μm-80μm，优选70μm；所述玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗。
作为进一步优选地实施方式，步骤(2)的A的原代培养中，吸取单核细胞层后，加入LG-DMEM，常温离心，洗涤，弃去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶内，置于37℃，5％CO2，相对湿度70％的培养箱内进行原代培养。
作为进一步优选地实施方式，步骤(2)的B的传代培养中，：原代细胞培养至细胞融合为单层，细胞融合率达80％时，移去培养液，洗涤，加入0.25％胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；用吸管吹打成单细胞悬液，以1∶2传代，每隔2-3天换液一次，逐渐除去血细胞，待梭形细胞逐渐长成单层并达到80％融合时，0.25％胰酶消化，按1：2或1：4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液。
作为进一步优选地实施方式，所述毛发包括人头发或动物毛发，所述动物毛发包括羊毛等；所述骨髓间充质细胞，包括猪和鼠骨髓间充质细胞的任一种。
实施例1
一种工程化敷料的制备方法，所述制备方法包括毛发角蛋白的制备、细胞悬液的制备以及敷料的制备，具体方法如下：
(1)毛发角蛋白的制备：
S1：脱脂：称取5g头发，放在1000ml烧杯中。加入99.7％无水乙醇浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次，流水冲洗；
S2：软化：将清洗后的头发放置于≥10％次氯酸钠10ml和蒸馏水90ml配置的溶液中，常温浸泡30分钟，间隔5分钟用玻璃棒搅拌一次,流水冲洗；
S3：脱色：按5g头发的重量，称取99％焦磷酸钠(Na4P2O7)4g，99.5％过硫酸钾(K2S2O8)1.5g，30％双氧水(H2O2)80ml，25％浓氨水27.5ml，蒸馏水400ml，配置成脱色溶液，将软化的头发置于此溶液中，放置37℃恒温水槽中，每隔20分钟用玻璃棒搅拌1次，观察头发颜色至浅黄色，这一过程用时一般2-3个小时，比传统方法短很多；将脱色后的头发放置在筛网上，流水冲洗，直至洗掉脱色溶液。
S4：清洗、烘干：取去离子水浸泡上述脱色后的头发12小时以上，去除残留试剂；去离子水冲洗，过滤后放置在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜；
S5：研磨：将烘干后的头发用剪刀剪碎后放在陶瓷研钵中，加入液氮冷冻研磨，至头发成1mm长，得到头发粗粉；
S6：球磨：称取头发粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml,460转/min，球磨2小时，倒置电子显微镜下观察粒径的大小，再加入生理盐水5m继续研磨1-2个小时，直至形成粒径约60μm-80μm的人发角蛋白颗粒匀浆，优选70μm；上述的玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗；
S7：装管：在上述匀浆中加入生理盐水30ml，将球磨罐中的液体清洗转移至50ml离心管中；
S8：离心：将离心管放在离心机的离心杯中，离心速度3000转/min，离心20min，弃去上清液，用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，加生理盐水40ml混匀，继续离心一次，弃去上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，再加生理盐水40ml混匀，再次离心，弃上清液，再用钥匙去除角蛋白沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的角蛋白移至新离心管中，得到高纯度的角蛋白泥，即毛发角蛋白颗粒；暂时放置在4℃保存；
S9：灭菌：将得到的高纯度角蛋白泥装于塑料袋中，密封好，用纸箱包装后送到辐射中心进行Co60照射灭菌，剂量12Kg，照射完成后拿回实验室，放置在4℃冰箱，待用；
(2)细胞悬液的制备
①猪骨髓间充质细胞的分离以及细胞原代培养
无菌条件下，将猪骨髓血5ml(1：50肝素抗凝)与同体积Ficoll淋巴细胞分离液置于15ml的离心管中(注意将骨髓血轻置于分离液的上层)，常温离心20min，离心后管中混合物分为四层，从下至上依次为：红细胞层、淋巴细胞分离液、单核细胞层和血清层。用5ml无菌吸头吸取单核细胞层，置于另一个15ml的离心管中，加入5mlLG-DMEM，常温离心5min(1500rpm)，洗涤2次，弃去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培养基重悬细胞，接种于25cm2培养瓶内，置于37℃，5％CO2，相对湿度70％的培养箱内培养，逐日观察。3天后首次换液，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3天换液一次。
②传代细胞的扩增培养
原代细胞培养10天左右，待细胞融合为单层，细胞融合率达80％，移去培养液，PBS洗涤2次，加入0.25％胰酶消化。倒置显微镜下观察，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；用吸管吹打成单细胞悬液，以1∶2传代分为2瓶，即为P1。以后每隔2-3天换液一次，逐渐除去血细胞，待梭形细胞逐渐长成单层并达到80％融合时，0.25％胰酶消化，按1∶2或1∶4进行传代培养。如图7～10所示，图7～10不同周期骨髓间充质细胞培养图片。
敷料的制备：将步骤(1)中制备的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的细胞悬液按照1:4的重量比混合，制备组织工程敷料。
本实施例中的猪骨髓血可用鼠骨髓血代替，则得到的是鼠骨髓间充质细胞，具体方法与上述方法一样，这里不再重复限定。
实施例2
本发明中的毛发角蛋白的制备方法(如实施例1)还可以通过下述方法代替：
将实施例1中步骤S9中灭菌后得到的高纯度角蛋白泥加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育2-3小时，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白；
然后该凝胶化的毛发角蛋白与本发明的细胞悬液复合，制成本发明的工程敷料。例如：含有5×105Fbs的200ulPBS与200ul凝胶的毛发角蛋白混合组成。
采用该方法与实施例1中的方法的原料相同，所起作用以及达到的效果均类似，可相互替换。
实施例3
本发明中的毛发角蛋白的制备方法，如实施例1中的方法，还可以通过下述方法代替：
S1：称取10g羊毛或人头发，放入装有180ml无水乙醇和20ml蒸馏水的混合溶液的三口烧瓶中，加热15分钟后升温至75℃，溶液开始回流；然后，边回流边滴加2ml的NaOH溶液，至氧化角蛋白的pH值为7，回流与滴加同时结束，时间持续90分钟；滴加和回流结束后，在25℃继续搅拌5小时，使反应完全，得到成盐毛发角蛋白。
S2：将成盐毛发角蛋白滤出，并用洗液冲洗，该洗液为无水乙醇与等量蒸馏水混合，除去未反应的NaOH，用pH试纸检测是否呈碱性，洗涤至不呈碱性，放入60℃鼓风干燥箱中干燥6小时，得到干燥的毛发角蛋白磺酸盐；
S3：经过上述处理而得到的毛发角蛋白磺酸盐呈脆性，在流星式球磨罐中粉碎得到角蛋白粉末，控制球磨条件(球料比，研磨时间，转速等)使毛发角蛋白磺酸盐粉末的颗粒在50μm左右，冻干；
S4：凝胶化的毛发角蛋白：在超净台里操作，取40mg步骤S3中得到的冻干后的毛发角蛋白磺酸盐粉中加入5ml无菌水，先采用搅拌器手工混匀材料，再用斡旋混匀机充分混匀，放置于37℃温箱孵育约2-3小时，则得到颜色和性状较为均一的毛发角蛋白凝胶，然后，采用钴60辐照法灭菌，得到凝胶化的毛发角蛋白，图4为10％凝胶化的毛发角蛋白的性状，图5是浓度为4％的凝胶化的毛发角蛋白的性状；毛发角蛋白的浓度越低，其性状越稀，本实施例的浓度显示的凝胶化的毛发角蛋白基本呈糊状。
然后该凝胶化的毛发角蛋白与本发明的细胞悬液混合制成本发明的工程敷料。
采用该方法与实施例1中的方法的原料相同，所起作用以及达到的效果均类似，可相互替换。
实施例4
本发明的细胞悬液能够通过动物皮肤细胞代替，该动物包括猪或鼠，该动物皮肤细胞的细胞组织制备方法如下：
①细胞原代培养：A：将猪或鼠的皮肤组织置于含有双抗的PBS缓冲液(即保护液)；操作时，从保存液中取出皮肤组织块，置于玻璃器皿中，加生理盐水冲洗3遍，去掉多余的脂肪和血液；转移至直径35mm的培养皿中，加入分离酶酶消化液(含4％的分离酶)4℃过夜；B：去表皮，得组织块，将组织块置于直径60mm培养皿中，并将组织块剪成小块，加胶原酶消化液(含7％的I型胶原酶)5ml 37℃消化；消化2.5小时后，吹打消化液并将消化液转移置15ml离心管中，1200转/min 12min离心。C：离心后去掉上清液，用含15％血清DMEM悬浮细胞，种在新直径60mm培养皿中，每隔2天换液一次。
②传代细胞的扩增培养
A：去掉培养皿中的上清液，生理盐水冲洗细胞2次，加0.1％胰蛋白酶2ml消化，显微镜下观察细胞收缩至圆球形时，去掉消化酶，加入含10％血清的DMEM悬浮细胞，以1:3的比例扩增细胞至相应的培养皿中。每隔2天换含血清5％DMEM一次。B：传代细胞扩增至培养皿面积的70％左右时(一般7天左右)，再继续传代培养，按照(7个大皿/毫升细胞，每个大皿的培养液体积约为8～10mL)的标准直至传够要求的大皿数量，每隔两天换含液血清5％DMEM一次，间隔两周左右可以收集细胞，即为得到的猪或鼠的真皮成纤维细胞悬液，健康成纤维细胞状态如图6所示。
采用该方法与实施例1中的方法所起作用以及达到的效果均类似，可相互替换。
实施例5：
一、创面修复实验
取健康SD大鼠，戊巴比妥麻醉(30mg/kg)，在其背部脊柱一侧旁开1cm，利刀全层切除皮肤，形成一个直径1.8cm、面积2.54cm2的圆形全层皮肤切除创面，对侧对称部位皮肤作为正常自身对照。将制备的毛发角蛋白和成纤维细胞悬液复合而成的本发明的工程敷料均匀敷于创面，纱布覆盖创面，打包法处理伤口，如图1所示。
观察：实验组动物伤后3d天创面有所缩小，可见新生肉芽组织生成。伤后21－28d，大部分创面愈合，如图2所示。
HE染色组织切片观察：测真皮层增厚，4周时平均厚度约0.58mm，可见大量的角蛋白颗粒真皮下聚集，角蛋白之间有细胞及纤维组织生长，有少量多核巨细胞，内吞噬有角蛋白颗粒。
免疫组织化学染色观察：切片中鼠真皮成纤维细胞大量分泌Ⅰ型胶原蛋白，胶原纤维排列紧密，染色呈褐色，Ⅰ型胶原蛋白与组织细胞交错分布；第8周后填充部位皮肤免疫组织化学染色观察图如图3所示，图中染色显示Ⅰ型胶原蛋白分泌情况。
细菌感染观察：在受伤至痊愈后未见明显细菌感染情况。
结论：本发明的角蛋白和成纤维细胞悬液工程敷料效果非常显著，在没有任何用药的情况下，未出现明显发炎，且伤后21－28d，绝大部分创面愈合，12周时角蛋白凝胶可基本降解。
具体地，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。
毛发角蛋白生物材料具有利于细胞渗入、粘附和增殖的三维支架结构，在细胞粘附和增殖方面具有明显优于其他材料的特性，同时具有神经诱导性，在止血方面也显示出很好的效果。
二、研究结果
毛发角蛋白颗粒毒性及相容性的体外实验研究：
试样浸提液制备：毛发漂白试样取1g加入10ml生理盐水中，经液氮冷冻固化后粉碎，取1g加入10ml生理盐水中，振荡混匀后在细胞培养孵箱中37℃放置7d，离心后吸出上清液，制备毛发浸提液原液(初始100％浓度毛发材料100mg∶浸液1ml＝100mg/ml)，过滤除菌，备用。
体外急性全身毒性试验：对制备的组织工程敷料制备过程中可能造成的急性毒性加以初步评价。
结果显示：按照急性毒性试验的标准方案，对实验小鼠进行常规灌胃，并与术后不同时间点进行观察。结果显示，小鼠一般情况较好，7天观察期内无死亡，72h观察期内各组动物未见中毒症状或不良反应，无死亡，体重增长正常，方差分析表明两试验组与生理盐水组之间小鼠体重变化不存在明显差异，这表明毛发角蛋白颗粒和凝胶化的毛发角蛋白两种形式材料浸提液均无急性毒性作用。
细胞毒性试验：MTT法法测定细胞相对数和相对活力：
表1粉体MTT结果统计分析
结果显示：毛发角蛋白颗粒形式材料的不同浓度浸提液在三个时间点测得的细胞相对增殖率均达80％以上，细胞毒性分级为一级，具有良好的细胞相容性，无细胞毒性，说明在加工过程中并为造成毛发自身性质和相容性的改变。见表1：
小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验：评价材料可能的遗传毒性。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率(‰)表示。
结果显示：粉体匀浆组的微核发生率与阴性对照组无显著差异(P>0.05),而与阳性对照组比较差异显著(P<0.01)，受试物小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验呈阴性，说明毛发角蛋白颗粒组无致染色体畸变毒性作用。见表2
表2骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验结果
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括毛发角蛋白的制备、细胞悬液的制备以及敷料的制备，具体方法如下：
(1)毛发角蛋白的制备，该毛发角蛋白为毛发角蛋白颗粒或毛发角蛋白凝胶：
①毛发角蛋白颗粒的制备
S1：脱脂与软化：称取毛发进行脱脂和软化；
S2：脱色：将软化后的毛发放置于脱色溶液中进行脱色，所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠3～5重量份、过硫酸钾1～2重量份、双氧水70～90体积份、浓氨水22～33体积份以及水350～450体积份；
S3：清洗、烘干：将脱色后的毛发进行清洗，并且干燥；
S4：粉末制备：在干燥后的毛发剪碎，并加入液氮冷冻研磨，得到长度为0.1～2mm的毛发粗粉；将粗粉放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水，旋转，球磨，直至粒径50μm～90μm为止，则为毛发角蛋白颗粒匀浆；
S5：离心：在匀浆中加入生理盐水进行离心，弃去上清液，并去除沉淀的表层和底层，取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，加生理盐水混匀继续离心，重复上述操作2～4次，最后仍然取中段颗粒大小均匀的毛发角蛋白，则得到为高纯度的毛发角蛋白泥；
S6：灭菌：包装，密封，采用钴60辐照法灭菌，保存，待用；
②毛发角蛋白凝胶的制备
将步骤S6中灭菌后的毛发角蛋白泥加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育2-3小时，至呈现较为均一的颜色和性状为止；灭菌，得到毛发角蛋白凝胶；
(2)细胞悬液的制备
A.骨髓间充质细胞的分离以及细胞原代培养：收取骨髓血离心，吸取单核细胞层，离心，弃去上清，在培养液中重悬细胞，接种，在培养箱内进行原代培养；
B.传代细胞的扩增培养：移去培养液，胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；制成单细胞悬液，以1:2传代，待梭形细胞逐渐长成单层并达到70～90％融合时，胰酶消化，按1:2或1:4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液；
(3)敷料的制备：将步骤(1)中制备的毛发角蛋白与步骤(2)中得到的细胞悬液混合均匀，得到工程辅料。
2.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：所述毛发角蛋白与细胞悬液的重量比为1～2:3～5。
3.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(1)的S1中，所述脱脂和软化的方法为：用乙醇浸泡20～60分钟，浸泡过程中每间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；冲洗后，将毛发放置于次氯酸钠与水配制的溶液中浸泡20～60分钟，在该浸泡过程中间隔3～10分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗；
步骤(1)的S2中，将软化后的毛发放置于脱色溶液中2-3个小时，在脱色过程中间隔10～30分钟搅拌一次，浸泡完毕后流水冲洗，洗掉脱色溶液为止；所述脱色溶液的成分为焦磷酸钠4重量份、过硫酸钾1.5重量份、双氧水80体积份、浓氨水27.5体积份以及水400体积份；
步骤(1)的S3中，将脱色后的毛发在水中浸泡，浸泡完毕用水冲洗，过滤，在鼓风干燥箱中37℃烘干过夜。
4.根据权利要求3所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(1)的S1中，所述次氯酸钠与水的体积比为1～5:9，所述次氯酸钠为10％次氯酸钠；
步骤(1)的S2中，将放置有毛发的脱色溶液置于37℃恒温中进行脱色；所述焦磷酸钠为99％焦磷酸钠，过硫酸钾为99.5％过硫酸钾，双氧水为30％双氧水，浓氨水为25％浓氨水。
5.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(1)的S4中，球磨：将粗粉2g，放在球磨罐中，放入玛瑙珠，加入生理盐水10ml，球磨1～3小时，在显微镜下观察粒径大小，再加入生理盐水5ml继续研磨，直至形成粒径约60μm-80μm；所述玛瑙珠的数量：直径1cm玛瑙珠20颗，直径60mm玛瑙珠100颗；
步骤(1)的S6中，将得到的高纯度的毛发角蛋白泥包装采用钴60辐照法灭菌，剂量12Kg。
6.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(1)的②中，毛发角蛋白泥加入水充分混匀，放置于37℃温箱孵育2-3小时。
7.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：所述毛发角蛋白凝胶的制备方法还能够通过以下方法制备：
(1)毛发角蛋白成盐：称取毛发，加入乙醇和水的混合溶液，加热，回流，边回流边滴加碱溶液，至pH值为6.5～7.5时结束，然后继续搅拌，使反应完全，过滤得到成盐毛发角蛋白，干燥，碎至微米级，冻干，即得到毛发角蛋白磺酸盐粉末；
(2)毛发角蛋白凝胶的制备：称取毛发角蛋白磺酸盐粉末，加入水，充分混匀，放置于温箱中孵育，灭菌，得到毛发角蛋白凝胶。
8.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(2)的A的原代培养中，吸取单核细胞层后，加入LG-DMEM，常温离心，洗涤，弃去上清，采用含10％FBS的LG-DMEM培养基重悬细胞，接种于培养瓶内，置于37℃，5％CO2，相对湿度70％的培养箱内进行原代培养。
9.根据权利要求1所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：步骤(2)的B的传代培养中，原代细胞培养至细胞融合为单层，细胞融合率达80％时，移去培养液，洗涤，加入0.25％胰酶消化，骨髓干细胞呈圆形时终止消化；用吸管吹打成单细胞悬液，以1∶2传代，每隔2-3天换液一次，逐渐除去血细胞，待梭形细胞逐渐长成单层并达到80％融合时，0.25％胰酶消化，按1：2或1：4进行传代培养，得到骨髓间充质细胞的细胞悬液细胞悬液。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的毛发角蛋白复合细胞组织工程化敷料的制备方法，其特征在于：所述毛发包括人头发或动物毛发；所述骨髓间充质细胞包括猪骨髓间充质细胞和鼠骨髓间充质细胞的任一种。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684231A (zh) * 2019-10-06 2020-01-14 武汉纺织大学 一种柔性羊毛角蛋白纤维气凝胶及其制备方法
CN111606990A (zh) * 2020-06-03 2020-09-01 江南大学 活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699557A (zh) * 2005-05-26 2005-11-23 南开大学 一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法
CN101530636A (zh) * 2008-03-12 2009-09-16 章庆国 可注射人发角蛋白软组织填充材料的制备方法
CN102205148A (zh) * 2011-05-17 2011-10-05 吉林大学 一种修复疤痕的蛋白生物填充材料及制备方法
US8273702B2 (en) * 2006-02-17 2012-09-25 Wake Forest University Health Sciences Wound healing compositions containing keratin biomaterials
CN105079859B (zh) * 2015-08-20 2018-01-26 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种敷料及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1699557A (zh) * 2005-05-26 2005-11-23 南开大学 一种骨髓间充质干细胞的分离及培养方法
US8273702B2 (en) * 2006-02-17 2012-09-25 Wake Forest University Health Sciences Wound healing compositions containing keratin biomaterials
CN101530636A (zh) * 2008-03-12 2009-09-16 章庆国 可注射人发角蛋白软组织填充材料的制备方法
CN102205148A (zh) * 2011-05-17 2011-10-05 吉林大学 一种修复疤痕的蛋白生物填充材料及制备方法
CN105079859B (zh) * 2015-08-20 2018-01-26 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种敷料及其制备方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684231A (zh) * 2019-10-06 2020-01-14 武汉纺织大学 一种柔性羊毛角蛋白纤维气凝胶及其制备方法
CN110684231B (zh) * 2019-10-06 2022-02-25 武汉纺织大学 一种柔性羊毛角蛋白纤维气凝胶及其制备方法
CN111606990A (zh) * 2020-06-03 2020-09-01 江南大学 活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用
CN111606990B (zh) * 2020-06-03 2023-02-21 江南大学 活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用

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