CN111606990A - 活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用，本发明通过控制角蛋白酶的反应条件，从羊毛废弃物中提取了具有生物活性的大分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能够有效促进成纤维细胞的增殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能；该再生角蛋白粉末可自组装成水凝胶，能够诱导组织再生修复，有效促进伤口愈合，可作一种良好的医用生物敷料。本发明操作工艺简单，设备成本低廉，易于工业化生产；本方法以畜牧业及纺织工业中废弃羊毛、羊绒等纤维及不能用于纺织加工的羊毛短纤维为原料，既节约资源又保护环境；本方法使用角蛋白酶进行生物提取，提取过程绿色环保，不产生污染。

Description

活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用
技术领域
本发明涉及一种活性大分子角蛋白的制备方法及其作为生物敷料的应用，属于生物技术领域。
背景技术
羊毛加工在我国早已兴起，经过长时间发展，我国已成为羊毛进口与羊毛制品生产大国，但是国内毛纺企业每年羊毛加工产生的羊毛废弃物高达几十万吨，同时畜牧养殖和畜牧加工产业中也有大量废弃羊毛产生。如果不加以利用，这些废弃物会加深环境污染的同时，也是一种巨大的浪费。羊毛纤维中蛋白质含量高达99％，是一种优质的蛋白质资源。近年来，随着对角蛋白研究的深入，研究者们发现角蛋白是一种具有良好生物相容性和可生物降解性的天然生物材料。因此，角蛋白在组织工程和医学应用上表现出应用潜力，如促进伤口愈合和骨再生，种植体材料，止血敷料，和药物缓释等。本专利从羊毛废弃物中提取活性大分子角蛋白，不仅实现了羊毛纤维的回收再利用，也提供了一种有价值的生物活性材料。
羊毛纤维具有由二硫键、氢键和范德华力高度相交和连接的复杂立体结构，具有极强的抗性，难以溶解于水、弱酸弱碱、有机溶剂等，给角蛋白的提取再利用带来了极大的困难。传统提取活性大分子角蛋白的方法主要依赖于含巯基化合物，如巯基乙醇、巯基乙酸；或者含硫化合物，如亚硫酸盐、EDTA、DTT等有毒有害化学试剂，会对环境造成二次污染以及有毒试剂残留。角蛋白酶是公认的能够降解羊毛、羽毛等角蛋白质废弃物的生物酶，然而降解产品目前主要是氨基酸和低分子小肽，应用于肥料和饲料等领域，附加值较低。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明采用角蛋白酶，在温和的反应条件下从羊毛废弃物中提取了具有生物活性的大分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能够有效促进成纤维细胞的增殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能；该再生角蛋白粉末可自组装成水凝胶，能够诱导组织再生修复，有效促进伤口愈合，可作一种良好的医用生物敷料。
本发明的第一个目的是提供一种活性大分子角蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)将羊毛纤维洗净，用脱脂溶剂脱脂12～24h，清洗去除表面残留的脱脂溶剂，烘干剪碎，得到脱脂羊毛纤维；
(2)将步骤(1)的脱脂羊毛纤维分散在水中，调节pH至9～11，在65～95℃搅拌反应1～2h；
(3)将步骤(2)的反应液温度降低至45～50℃，加入100～200KU酶活的角蛋白酶液进行酶解48-60h；
(4)将步骤(3)酶解后的反应液进行离心，取上清液，进行透析、冷冻干燥，得到所述的角蛋白。
进一步地，在步骤(1)中，所述的脱脂溶剂为醚、苯、二硫化碳、丙酮、氯仿中的一种或多种混合。
进一步地，在步骤(1)中，清洗是采用水清洗，清洗温度为40～60℃。
进一步地，在步骤(1)中，脱脂羊毛纤维剪碎的长度为1～5cm。
进一步地，在步骤(2)中，脱脂羊毛纤维与水的固液比为1:10～30。
进一步地，在步骤(4)中，离心的条件为10000-14000rpm离心20～40min。
进一步地，在步骤(4)中，透析时，透析膜的截留分子量为8000～14000Da。
进一步地，在步骤(4)中，冷冻干燥的条件为在-80℃下冷冻6～12h，在冷冻干燥机上干燥48～72h。
本发明的第二个目的是提供所述的方法制备得到的角蛋白。
本发明的第三个目的是提供所述的角蛋白在制备生物敷料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明通过控制角蛋白酶的反应条件，从羊毛废弃物中提取了具有生物活性的大分子角蛋白，其分子量主要分布于45kDa和28kDa，该角蛋白能够有效促进成纤维细胞的增殖和迁移，且表现出明显的抗氧化性能；该再生角蛋白粉末可自组装成水凝胶，能够诱导组织再生修复，有效促进伤口愈合，可作一种良好的医用生物敷料。本发明操作工艺简单，设备成本低廉，易于工业化生产；本方法以畜牧业及纺织工业中废弃羊毛、羊绒等纤维及不能用于纺织加工的羊毛短纤维为原料，既节约资源又保护环境；本方法使用角蛋白酶进行生物提取，提取过程绿色环保，不产生污染。
附图说明
图1为再生角蛋白分子量表征，A.SDS-PAGE检测结果；B.HPLC检测结果。
图2为再生角蛋白结构表征，A.红外光谱；B.固体核磁碳谱；C.X射线衍射；D.圆二色谱。
图3为再生角蛋白生物活性表征，A.促细胞增殖作用；B.促细胞迁移作用。
图4为再生角蛋白抗氧化活性表征，A.ABTS自由基清除能力；B.细胞内活性氧ROS清除能力。
图5为再生角蛋白自组装成水凝胶。
图6为再生角蛋白水凝胶促伤口愈合效果评价。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)将羊毛纤维用去离子水洗净，用3倍羊毛体积的丙酮在索氏提取器中脱脂24h，再用40℃去离子水洗去表面残留的丙酮，烘干，将得到的羊毛纤维剪碎；
(2)将5g剪碎的脱脂羊毛分散在50mL水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至9，密封，升温至65℃，机械搅拌1h；
(3)将温度降至50℃，加入100KU酶活的角蛋白酶液进行酶解，持续机械搅拌降解60h；
(4)对步骤(3)中得到的羊毛和角蛋白的混合溶液进行离心处理，分离上清角蛋白溶液；
(5)对步骤(4)中得到的上清角蛋白溶液透析72h；
(6)透析完成后，将透析液在-80℃下冷冻6h，然后在冷冻干燥机上干燥72h，得到角蛋白固体；用粉碎机进一步将其粉碎，得到羊毛角蛋白粉末。
实施例2：
(1)将羊毛纤维用去离子水洗净，用4倍羊毛体积的丙酮在索氏提取器中脱脂24h，再用50℃去离子水洗去表面残留的丙酮，烘干，将得到的羊毛纤维剪碎；
(2)将5g剪碎的脱脂羊毛分散在100mL水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至10，密封，升温至70℃，机械搅拌1h；
(3)将温度降至50℃，加入150KU酶活的角蛋白酶液进行酶解，持续机械搅拌降解54h；
(4)对步骤(3)中得到的羊毛和角蛋白的混合溶液进行离心处理，分离上清角蛋白溶液；
(5)对步骤(4)中得到的上清角蛋白溶液透析72h；
(6)透析完成后，将透析液在-80℃下冷冻8h，然后在冷冻干燥机上干燥48h，得到角蛋白固体；用粉碎机进一步将其粉碎，得到羊毛角蛋白粉末。
实施例3：
(1)将羊毛纤维用去离子水洗净，用5倍羊毛体积的丙酮在索氏提取器中脱脂12h，再用50℃去离子水洗去表面残留的丙酮，烘干，将得到的羊毛纤维剪碎；
(2)将5g剪碎的脱脂羊毛分散在150mL水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至11，密封，升温至85℃，机械搅拌1h；
(3)将温度降至50℃，加入200KU酶活的角蛋白酶液进行酶解，持续机械搅拌降解48h；
(4)对步骤(3)中得到的羊毛和角蛋白的混合溶液进行离心处理，分离上清角蛋白溶液；
(5)对步骤(4)中得到的上清角蛋白溶液透析72h；
(6)透析完成后，将透析液在-80℃下冷冻12h，然后在冷冻干燥机上干燥48h，得到角蛋白固体；用粉碎机进一步将其粉碎，得到羊毛角蛋白粉末。
实施例4：
(1)将羊毛纤维用去离子水洗净，用5倍羊毛体积的丙酮在索氏提取器中脱脂24h，再用60℃去离子水洗去表面残留的丙酮，烘干，将得到的羊毛纤维剪碎；
(2)将5g剪碎的脱脂羊毛分散在150mL水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至10，密封，升温至95℃，机械搅拌1h；
(3)将温度降至45℃，加入200KU酶活的角蛋白酶液进行酶解，持续机械搅拌降解48h；
(4)对步骤(3)中得到的羊毛和角蛋白的混合溶液进行离心处理，分离上清角蛋白溶液；
(5)对步骤(4)中得到的上清角蛋白溶液透析72h；
(6)透析完成后，将透析液在-80℃下冷冻10h，然后在冷冻干燥机上干燥72h，得到角蛋白固体；用粉碎机进一步将其粉碎，得到羊毛角蛋白粉末。
实施例5：
(1)将羊毛纤维用去离子水洗净，用5倍羊毛体积的丙酮在索氏提取器中脱脂24h，再用50℃去离子水洗去表面残留的丙酮，烘干，将得到的羊毛纤维剪碎；
(2)将5g剪碎的脱脂羊毛分散在100mL水中，用1mol/L NaOH溶液调节pH值至10，密封，升温至85℃，机械搅拌1h；
(3)将温度降至45℃，加入150KU酶活的角蛋白酶液进行酶解，持续机械搅拌降解54h；
(4)对步骤(3)中得到的羊毛和角蛋白的混合溶液进行离心处理，分离上清角蛋白溶液；
(5)对步骤(4)中得到的上清角蛋白溶液透析72h；
(6)透析完成后，将透析液在-80℃下冷冻10h，然后在冷冻干燥机上干燥60h，得到角蛋白固体；用粉碎机进一步将其粉碎，得到羊毛角蛋白粉末。
实施例6：再生角蛋白结构表征
(1)分子量表征
将得到的再生角蛋白粉末溶于去离子水中，分别通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高效液相(HPLC)法检测其分子量。如图1所示，蛋白胶图显示蛋白质主要分布于45kDa和28kDa两个区域；高效液相结果与蛋白胶结果相一致，在10-60kDa之间出现两条峰，证明该法获得了分子量较高的可溶性角蛋白。
(2)红外光谱检测
通过红外光谱(FTIR)对再生角蛋白的结构变化进行了表征。FTIR分析(图2A)在约1000cm-1处发现一个新的峰，属于S-O振动带，与半胱胺磺酸盐R-S-SO3相对应(1023cm-1)。这个化学官能团的产生证明了二硫键的裂解。1500cm-1处代表酰胺II(1580-1480cm-1)对C-N的拉伸振动和N-H的弯曲振动的峰值明显减弱，从而证明了角蛋白酶对羊毛肽键的破坏。
(3)固体核磁碳谱检测
通过固体核磁碳谱(13C NMR)对再生角蛋白的结构变化进行了表征。如图2B所示，能够观察到角蛋白中典型的酰胺羰基碳原子的峰(172ppm-174ppm)，以及α-碳原子(52-56ppm)和β-碳原子(40ppm)。可以发现，50–65ppm区域的峰值发生了变化，这可能是由于二硫键和氢键的破坏。在大约100ppm处产生了一个新的峰，属于支链氨基酸(Leu,Val,Ile等)和芳香氨基酸的双链碳或苯环碳。这些氨基酸最初可能被包裹在羊毛结构中，然后通过酶解释放出来，所以它们可以在角蛋白溶液中检测到。
(4)X射线衍射检测
通过X射线衍射(XRD)对再生角蛋白的结构变化进行了表征。图2C表明，α-螺旋结构(2θ＝9°)的羊毛纤维溶解过程中被破坏，而β-折叠结构(2θ＝19°)增加，证明了肽键的断裂使得多肽链变得松散和延展。
(5)圆二色谱检测
通过圆二色谱(CD)对再生角蛋白的结构变化进行了表征。进一步从CD光谱中确定羊毛角蛋白提取物的二级结构(图2D)。温度从37℃升高到50℃、70℃和90℃，然而温度的增加并没有导致二级结构的显著变化，表明酶解引起了角蛋白酶α-螺旋结构相对彻底的破坏，使得羊毛角蛋白分子从有序变得无序，从紧密结构变得松散延展的。因此，二级结构相对稳定，受温度影响较小。
实施例7：再生角蛋白生物活性表征
(1)促细胞增殖能力检测
通过CCK-8实验评估了再生角蛋白对小鼠成纤维细胞L929促增殖作用。将不同剂量的再生角蛋白粉末溶于细胞培养基进行细胞培养。将角蛋白溶解在完全培养基中，配置成不同浓度(终浓度分别为200ng/μl、400ng/μl、600ng/μl、800ng/μl、1000ng/μl)；在96孔板中加入100μL的细胞悬液(细胞浓度约在104)。向孔中加入10μL不同浓度的角蛋白溶液(每组6个平行孔)。将培养板在培养箱孵育一段时间(6、12、24、36、48小时)。向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续在培养箱内孵育1-4小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，从而计算细胞增殖活力。
细胞活力*(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
结果如图3A所示，添加了角蛋白的实验组的细胞增殖率是空白组的1.5倍，即使在低剂量组，也表现出明显的增长优势。
(2)促细胞迁移能力检测
通过小室迁移实验评估了再生角蛋白对小鼠成纤维细胞L929促迁移作用。将不同剂量的再生角蛋白粉末溶于不含FBS的细胞培养基，置于小室下方，将细胞接种于小室内部。将传代培养的细胞用胰酶消化后用饥饿培养基(无血清)重悬，制备成密度为5х105的细胞悬液。取100μl细胞悬液加入Transwell小室内，小室下部的孔板内加入600μl含20％FBS的培养基，实验组加入不同浓度的角蛋白溶液(终浓度分别为200ng/μl、400ng/μl、800ng/μl)；放入培养箱中孵育24h后观察细胞迁移情况。24h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗两遍，甲醛固定30min，将小室适当风干，用0.1％结晶紫染色30min，用面前轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍，显微镜下观察迁移细胞数量。
结果如图3B所示，角蛋白表现出明显的促细胞迁移作用，且角蛋白用量越大，效果越明显。
实施例8：再生角蛋白抗氧化活性表征
研究了再生角蛋白对ABTS自由基和细胞内活性氧ROS的清除能力。
配置2.6mM的过硫酸钾溶液(0.134g过硫酸钾定容至100mL)，7.4mM ABTS溶液(0.0384g ABTS定容到10mL)，分别量取10mL在避光储存12h制成ABTS+自由基溶液。将配置好的ABTS+自由基溶液用无水乙醇稀释至合适倍数，使其吸光度在734nm为0.700±0.025，取1mL样品溶于1mL去离子水中，再与4mL稀释后的自由基溶液发生反应，进行40min，反应每5min进行吸光度测定，取1mL去离子水与4mL稀释后的自由基溶液混合作为空白样。
利用公式计算其自由基消除率，消除率越高，抗氧化性能越强。
Figure BDA0002522658560000091
A0：空白样吸光度；A1：反应后吸光度
如图4A所示，羊毛角蛋白可以在10分钟内迅速消除ABTS自由基，0.01％的角蛋白清除率为20％；0.1％的角蛋白清除率为50％；1％的角蛋白清除率为80％以上，与1％维生素C清除效果几乎相当。
此外，检测角蛋白清除胞内过量活性氧的效果。为了评估羊毛角蛋白对细胞发生氧化应激反应时的保护作用，分别用不同浓度的H2O2处理细胞，使其产生过量的ROS(活性氧)，添加再生角蛋白和抗坏血酸维生素C(阳性对照)抵抗ROS造成的细胞损伤，通过流式细胞仪测定胞内ROS含量。在96孔板中以104个细胞/孔的密度接种并置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入0.25％的胰酶，37℃消化2min，加入培养基终止消化，制成细胞悬液，1000g离心5-10min收集细胞，用PBS洗涤1-2次，更换分别添加了0/500/1000/5000μM H2O2的PBS，同时加入100nM的DCFH-DA，制成细胞悬液，实验组中加入1mg/ml的羊毛角蛋白，阳性对照组中加入1mg/ml的抗坏血酸维生素C，37℃孵育60min。1000g离心5-10min收集细胞，用PBS洗涤1-2次去除多余探针染料，重悬后进行流式细胞仪检测。
加载ROS检测探针DCFH-DA后，将细胞注射到流式细胞仪中，检测与细胞内ROS含量成正比的荧光强度。结果表明，角蛋白可以有效去除细胞内过量的ROS，从而有效降低荧光强度(图4B)。
实施例9：再生角蛋白自组装成水凝胶
将制备所得的再生角蛋白粉末溶解于超纯水，角蛋白溶液可以在不添加任何化学交联剂的情况下自组装成可注射的水凝胶。分别将0.25g、0.5g、0.75g、1g再生角蛋白溶于5mL去离子水中，40℃条件下搅拌溶解，配置成5％、10％、15％、20％的角蛋白溶液；持续搅拌直至形成均一的溶液，分别于4℃和37℃下放置30min至3h进行交联，得到角蛋白水凝胶。
结果表明，凝胶化过程与温度和浓度有关，温度和浓度对凝胶化过程有促进作用。当浓度为5％时，37℃下3h可形成水凝胶，但在4℃时需要更长时间；而当浓度为10％时，37℃下30min可形成水凝胶，但在4℃时需要3h可完成凝胶化过程；而当浓度为20％时，在4℃和37℃条件下，均可在30min内迅速形成可注射角蛋白水凝胶(图5)。
实施例10：再生角蛋白水凝胶促进伤口愈合效果评价
通过小鼠全层皮肤切除实验评价角蛋白水凝胶促进创面愈合效果。以一种商品化的壳聚糖水凝胶作为阳性对照。健康成年雄性ICR/JCL小鼠30只，体质量20-30g，正常喂养以适应环境；一周后，造背部全层皮肤缺失模型：将小鼠随机分为3组,分别为空白对照组，实验组(角蛋白凝胶)和阳性对照组(壳聚糖凝胶)，每组12只小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠，背部剪毛处理后，将小鼠置于俯卧位，四肢伸展，用胶带将其四肢固定在操作板上，使背部皮肤较平坦。常规手术消毒，在小鼠的背部以脊椎为中轴线做了一个1cm x 1cm全厚的开放性切口。伤后每只小鼠单笼饲养，避免细菌感染。分别于伤后3d、6d、9d和12d观察小鼠伤口愈合情况。
图6A、B记录了各组术后创面愈合情况。第3天，空白组创面大面积开放，壳聚糖水凝胶(CH)组创面有一定程度的肿胀，而角蛋白水凝胶(KH)组创面与正常组织融合良好，无渗血或红肿现象。第6天，角蛋白水凝胶对创面愈合有明显的促进作用。KH组创面明显缩小，闭合率约80％。第12天，KH组几乎完全愈合，创面平整，无疤痕形成，而CH组创面闭合度约为90％，空白组创面闭合度约为85％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种活性大分子角蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将羊毛纤维洗净，用脱脂溶剂脱脂12～24h，清洗去除表面残留的脱脂溶剂，烘干剪碎，得到脱脂羊毛纤维；
(2)将步骤(1)的脱脂羊毛纤维分散在水中，调节pH至9～11，在65～95℃搅拌反应1～2h；
(3)将步骤(2)的反应液温度降低至45～50℃，加入100～200KU酶活的角蛋白酶液进行酶解48-60h；
(4)将步骤(3)酶解后的反应液进行离心，取上清液，进行透析、冷冻干燥，得到所述的角蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的脱脂溶剂为醚、苯、二硫化碳、丙酮、氯仿中的一种或多种混合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，清洗是采用水清洗，清洗温度为40～60℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，脱脂羊毛纤维剪碎的长度为1～5cm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，脱脂羊毛纤维与水的固液比为1:10～30。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，离心的条件为10000-14000rpm离心20～40min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，透析时，透析膜的截留分子量为8000～14000Da。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，冷冻干燥的条件为在-80℃下冷冻6～12h，在冷冻干燥机上干燥48～72h。
9.一种权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的角蛋白。
10.权利要求9所述的角蛋白在制备生物敷料中的应用。
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