CN110638676A - 一种透明质酸注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种透明质酸注射液及其制备方法，包括按质量百分比计的如下组分：透明质酸0.1‑1.5%、氨基酸0.01‑1%、甘露醇0.1‑2%和矿物质0.05‑0.8%。本发明制备的透明质酸注射液能够补充皮肤胞外基质中的透明质酸和提高皮肤自身胶原蛋白的合成能力，使皱纹皮肤恢复光滑和弹性；本发明提供的透明质酸注射液成分安全、制备方法简便，成本低廉，适合产业化。
Description
技术领域
本发明属于医学美容领域，具体涉及一种透明质酸注射液及其制备方法。
背景技术
随着时间的推移，人体皮肤内部也会发生改变，例如胞外基质的减少和胶原蛋白的降解等，造成皮肤皱纹和松弛。要从根源上解决皮肤皱纹、松弛等问题，最直接有效的方法就是补充胞外基质和胶原蛋白。临床上常用的胶原蛋白注射填充剂包括人源胶原蛋白和非人源胶原蛋白，前者是取患者自体组织经培养、处理后，制备成注射填充剂，其优点在于自体来源无免疫风险，但费时费力，价格昂贵；非人源胶原蛋白主要为牛胶原，经过去抗原处理后仍有一定的免疫风险，注射前需经过皮试确定是否过敏，且该过敏反应的发生周期相对较长，大约在4个月到2年左右，不确定因素较多。由此可知，直接注射胶原蛋白填充剂并不是最优解决方案。
与直接补充胶原蛋白相比，采用皮下注射透明质酸及其盐以达到补充胞外基质、促进胶原蛋白合成的目的是常规手段。透明质酸填充剂具有成本较低，不会引起免疫反应，单次注射维持时间长等优势，但由于注射使用时，常会出现注射用透明质酸及其盐易降解、促胶原蛋白合成能力较弱等缺点，需要短期多次注射，加深了痛苦的同时，也加重了所需的成本。
CN201410379759.5提供一种纠正皮肤褶皱注射液，该方案通过添加较低量的氨基酸来促进皮肤胶原蛋白的合成，所起到的作用有限。
CN201610471164.1提供一种用于水光注射的透明质酸钠凝胶，该方案在补充透明质酸的同时通过添加甘露醇预防水肿，但未添加能够促进胶原蛋白合成的组分，只能单纯起到补充皮肤水分的作用。
针对现有技术中存在的问题，有必要提供一种成分安全、成本较低、制备简便且能够促进皮肤胶原蛋白合成的透明质酸注射液。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种透明质酸注射液及其制备方法，不仅具有传统填充材料具备的补充胞外基质的功能，还能促进自身胶原蛋白合成，解决皮肤皱纹、松弛等问题。
为实现上述目的，本发明提供一种透明质酸注射液，包含如下组分：透明质酸、氨基酸、甘露醇和矿物质。
进一步地，所述透明质酸在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.1-1.5%，所述氨基酸在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.01-1%，所述甘露醇在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.1-2%，所述矿物质在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.05-0.8%。
进一步地，所述透明质酸与所述氨基酸的质量比为1.5-10:1
进一步地，所述透明质酸与所述甘露醇的重量比为0.5-1:1。
进一步地，所述透明质酸为非交联透明质酸。
优选地，所述非交联透明质酸的分子量为130-200Da。
进一步地，所述氨基酸为脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或多种。
进一步地，所述矿物质为依地酸钙二钠。
本发明还提供一种透明质酸注射液的制备方法，包括如下步骤：
（1）将透明质酸、甘露醇加入水中，待完全溶解，得到混合液A；
（2）将氨基酸加入水中，待完全溶解，得到溶液B；
（3）溶液B经0.22um滤膜过滤后，加入溶液A中，待完全溶解混匀，得到混合液C；
（4）分装混合液C，121℃湿热灭菌8min，冷却至常温，即得所述透明质酸注射液。
本发明较现有技术的优势主要在于：
透明质酸具有极强的保水性能，存在于包括皮肤在内的大多数软结缔组织中。常用的透明质酸有交联和非交联两种形式，交联透明质酸降解周期较长，注射后维持的时间也比较长，适用于面部、额部等部位的填充塑型；非交联透明质酸质地较软，适用于眼部皮肤等表皮较薄部位的皱纹填充。
氨基酸是蛋白质的结构单元，脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸在胶原蛋白中含量最为丰富，补充这些氨基酸能为胶原蛋白的合成提供原料；亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸均是支链氨基酸，支链氨基酸的协同作用，能够保护肌肉组织，提供能量，加速骨骼、皮肤和肌肉组织的愈合。
甘露醇具有较强的抗氧化性能，可通过清除自由基延长透明质酸的降解周期，抑制胶原蛋白的糖基化反应。
依地酸钙二钠中的钙离子可以促进胶原蛋白的合成、延长其降解周期，同时还可以络合金属离子，提高产品稳定性。
本发明制备的透明质酸注射液能够补充皮肤胞外基质中的透明质酸和提高皮肤自身胶原蛋白的合成能力，使皱纹皮肤恢复光滑和弹性；本发明提供的透明质酸注射液成分安全、制备方法简便，成本低廉，适合产业化。
附图说明
图1为细胞毒性检测试验中，阳性对照的细胞毒性形态；
图2为细胞毒性检测试验中，阴性对照的细胞毒性形态；
图3为细胞毒性检测实验中，实施例1制备的透明质酸注射液的细胞毒性形态；
图4为细胞毒性检测实验中，实施例7制备的透明质酸注射液的细胞毒性形态；
图5为细胞毒性检测实验中，实施例9制备的透明质酸注射液的细胞毒性形态。
具体实施方式
以下将结合具体实施方式对本发明技术方案做进一步的说明。
实施例1
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸0.8%、氨基酸0.25%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.1%；其中，所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.1%、甘氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例还提供一种透明质酸注射液的制备方法，包括如下步骤：
（1）将透明质酸、甘露醇加入水中，待完全溶解，得到混合液A；
（2）将氨基酸加入水中，待完全溶解，得到溶液B；
（3）溶液B经0.22μm滤膜过滤后，加入溶液A中，待完全溶解混匀，得到混合液C；
（4）分装混合液C，121℃湿热灭菌8min，冷却至常温，即得所述透明质酸注射液。
实施例2
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸0.8%、氨基酸0.35%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.1%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.2%、甘氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸0.8%、氨基酸0.35%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.2%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.2%、甘氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸0.1%、氨基酸0.01%、甘露醇0.1%、依地酸钙二钠0.2%；其中所述氨基酸为脯氨酸。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1.5%、氨基酸1%、甘露醇2%、依地酸钙二钠0.8%；其中所述氨基酸为脯氨酸。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1%、氨基酸0.8%、甘露醇1.5%、依地酸钙二钠0.5%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.5%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例7
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1%、氨基酸0.4%、甘露醇1.5%、依地酸钙二钠0.5%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.05%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例8
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1%、氨基酸0.35%、甘露醇1.5%、依地酸钙二钠0.5%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.05%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1.5%、氨基酸0.9%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.3%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.6%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1.5%、氨基酸0.9%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.5%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.6%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
实施例11
本实施例提供一种透明质酸注射液，包括以质量百分比计的如下组分：透明质酸1.5%、氨基酸0.9%、甘露醇1%、依地酸钙二钠0.7%；其中所述氨基酸包括以质量百分比计的如下组分：脯氨酸0.6%、甘氨酸0.05%、丙氨酸0.05%、精氨酸0.05%、亮氨酸0.05%、异亮氨酸0.05%、缬氨酸0.05%。
本实施例中透明质酸注射液的制备方法与实施例1相同。
对实施例1至实施例11所制备的透明质酸注射液进行细胞毒性验证和细胞胶原蛋白含量测定，得到结果如下。
（1）细胞毒性检测
细胞毒性检测参考《GB/T16886.5-2017 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》和《GB/T 16886.12-2017 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照材料》文件，采用MTT法和细胞形态观察法评价样品的细胞毒性。毒性评定标准按照表1，将细胞相对增殖率转化为0~5级反应来评定样品的毒性程度，其中阳性对照、阴性对照为上述国家标准中规定的对照材料，阳性对照为二乙基二硫代氨基甲酸锌（ZDEC），阴性对照材料为高密度聚乙烯。细胞毒性评价中，细胞相对增殖率越高、反应分级级别越低，说明毒性越低，当反应分级大于2级时被认为有细胞毒性作用。
表1 细胞毒性反应分级标准
| 细胞相对增殖率(RGR) | 反应分级 | 毒性程度 |
| ≥100 | 0级 | 无 |
| 75-99 | 1级 | 轻微 |
| 50-74 | 2级 | 轻度 |
| 25-49 | 3级 | 中度 |
| 1-24 | 4级 | 重度 |
| 0 | 5级 | 极重 |
评价结果见表2。
表2 样品细胞毒性检测结果
| 组别 | 细胞相对增殖率 | 细胞毒性反应分级 |
| 阴性对照 | 100% | 0级 |
| 阳性对照 | 20% | 4级 |
| 实施例1 | 91.53% | 1级 |
| 实施例2 | 92.53% | 1级 |
| 实施例3 | 90.12% | 1级 |
| 实施例4 | 91.63% | 1级 |
| 实施例5 | 91.06% | 1级 |
| 实施例6 | 90.76% | 1级 |
| 实施例7 | 92.62% | 1级 |
| 实施例8 | 91.48% | 1级 |
| 实施例9 | 90.57% | 1级 |
| 实施例10 | 92.58% | 1级 |
| 实施例11 | 91.60% | 1级 |
由细胞毒性检测结果可知，实施例1至实施例11所制备的透明质酸注射液的细胞毒性反应分级均为1级，说明实施例1至实施例11制备的透明质酸注射液无细胞毒性作用，使用安全。
进一步以实施例1至实施例11制备的透明质酸注射液与阳性对照（图1）、阴性对照（图2）的细胞毒性检测中细胞毒性形态进行观察，以实施例1（图3）、实施例7（图4）、实施例9（图5）为例，显微镜下可见本发明制备的透明质酸注射液处理的细胞生长良好，接近阴性对照处理的细胞，进一步证实本发明制备的透明质酸注射液对细胞无毒性作用。
（2）细胞胶原蛋白测定
胶原蛋白测定使用小鼠成纤维细胞L929作为培养对象，实施例1至实施例11制备的透明质酸注射液作为测试对象，生理盐水作为对照。
实验组：将实施例1至实施例11制备的透明质酸注射液分别用含10%新生牛血清的DMEM培养基稀释5倍后，培养小鼠成纤维细胞L929，分别按照实施例1至实施例11进行编号。
对照组：将生理盐水用DMEM培养基稀释5倍后，培养小鼠成纤维细胞L929，作为对照组。
培养48h，取上清培养液，测定胶原蛋白含量。
检测方法为Woessner法。
测定结果如表3所示。
表3细胞胶原蛋白测定
| 组别 | 胶原蛋白的相对含量% |
| 对照组 | 100 |
| 实验组1 | 274 |
| 实验组2 | 303 |
| 实验组3 | 323 |
| 实验组4 | 180 |
| 实验组5 | 380 |
| 实验组6 | 353 |
| 实验组7 | 327 |
| 实验组8 | 321 |
| 实验组9 | 350 |
| 实验组10 | 363 |
| 实验组11 | 371 |
由表3测定结果可知，实施例1至实施例11制备的透明质酸注射液均能明显促进细胞胶原蛋白的合成。
本领域技术人员应知道，以上实施例仅用于更好地理解本发明技术方案，不能理解为对本发明技术方案保护范围的限定；对本发明技术方案进行的任何无需付出创造性劳动的改动和替换，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种透明质酸注射液，其特征在于，包括如下组分：透明质酸、氨基酸、甘露醇和矿物质。
2.根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述透明质酸在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.1-1.5%，所述氨基酸在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.01-1%，所述甘露醇在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.1-2%，所述矿物质在所述透明质酸注射液中的质量百分比为0.05-0.8%。
3.根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述透明质酸与所述氨基酸的质量比为1.5-10:1
根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述透明质酸与所述甘露醇的重量比为0.5-1:1。
4.根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述透明质酸为非交联透明质酸。
5.根据权利要求5所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述非交联透明质酸的分子量为130-200Da。
6.根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述氨基酸为脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的透明质酸注射液，其特征在于，所述矿物质为依地酸钙二钠。
8.一种如权利要求1所述的透明质酸注射液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将透明质酸、甘露醇加入水中，待完全溶解，得到混合液A；
将氨基酸加入水中，待完全溶解，得到溶液B；
溶液B经0.22um滤膜过滤后，加入溶液A中，待完全溶解混匀，得到混合液C；
分装混合液C，121℃湿热灭菌8min，冷却至常温，即得所述透明质酸注射液。
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