CN102559591A

CN102559591A - 一种提取肺间充质干细胞的方法

Info

Publication number: CN102559591A
Application number: CN 201210042015
Authority: CN
Inventors: 白春学; 童琳; 宋元林
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明提供了一种提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：在肺泡内给药角质细胞生长因子-2(KGF-2)或角质细胞生长因子(KGF)以富集肺间充质干细胞，然后进行肺泡灌洗，将所得的灌洗液中的肺间充质干细胞分离后进行纯化，得到肺间充质干细胞。本发明的价值在于发现了KGF-2可富集肺间充质干细胞，从而方便用肺泡灌洗的方法提取，可以在正常动物肺组织中提取间充质干细胞，具有提取的细胞纯度高，活力好，应用方便等优点。该方法有望丰富临床干细胞治疗的细胞来源，为自体肺间充质干细胞的分离提供一种新的手段。

Description

一种提取肺间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大量提取肺间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞研究在近10余年有了快速的进展。干细胞治疗在许多动物疾病模型上显示出了良好的治疗效果。如间充质干细胞经气管内滴注或经静脉注射可以明显减轻LPS或细菌导致的急性肺损伤。间充质干细胞还可以减轻心肌梗塞导致的心肌缺血。体内研究发现，KGF-2具有抗纤维化作用，对博莱霉素诱导的肺纤维化有保护作用。体外研究发现，KGF-2对机械牵张力诱导的肺泡上皮细胞DNA损伤及凋亡具有保护作用，对过氧化物及石棉诱导的肺泡上皮细胞损伤也具有保护作用，且这种保护作用由MAPK信号通路介导。此外，研究还发现KGF-2可短效调节Na，K-ATP酶的活性。欧洲的一项7000例慢性阻塞性支气管炎的患者在接受干细胞治疗后6个月出现肺功能的改善。间充质干细胞在治疗效果上甚至还优于胚胎干细胞。从疗效和伦理的角度，间充质干细胞分离和培养有巨大的优势。

与异体干细胞相比，自体干细胞治疗更有优越性，如避免了可能存在的感染风险，以及潜在的免疫排斥反应等。自体干细胞分离和培养一般有几个途径，如骨髓的干细胞分离，脐带血的干细胞分离以及组织器官特异性的干细胞分离。有研究显示肺损伤后的修复主要来源于肺组织内的干细胞。组织原位的干细胞在调节炎症反应，组织修复，纤维化控制，血管再生等方面有重要作用。因此，对于肺部疾病的治疗，直接分离出肺的干细胞进行培养后回输治疗肺部疾病有特别的意义。

目前在动物实验上分离肺组织的干细胞往往需要先分离出肺组织，剪碎，研磨，培养，流式细胞仪筛选后继续培养，然后再进行干细胞的鉴定。过程复杂，更重要的是需要把肺切碎。另外一种方法是通过肺泡灌洗分离肺原位干细胞。这个方法已经在动物实验和志愿者身上进行了探索。动物实验的研究结果表明单纯支气管肺泡灌洗能得到的干细胞数目很少，对进行实验研究造成了极大的不便。如果能预处理肺脏，然后进行肺泡灌洗，明显提高原位干细胞分离效率的话，不仅是一个重要的新型技术，而且会有潜在的重要临床应用价值。

角质细胞生长因子-2(keratinocyte growth factor-2，KGF-2)是成纤维细胞生长因子家族中的23个成员之一，又称为成纤维细胞生长因子-10(fibroblast growthfactor-10，FGF-10)。人KGF-2是1997年Emoto等首先从人的肺中分离出的具有肝素结合特异性的单链多肽，因与1989年发现的KGF在结构、性质、功能等方面的同源性而得名。KGF-2包含208个氨基酸，其N端是由39个疏水氨基酸组成的信号肽序列，其分子结构与小鼠的同源性达96％。KGF-2由成纤维细胞和其它间充质来源的细胞分泌，特异性作用表达于上皮细胞表面的酪氨酸激酶受体，以间质-上皮相互作用的旁分泌方式有效地促进各种来源上皮细胞的增殖、移行和分化。

KGF-2生物学功能广泛。研究发现，它不仅可以直接作用于上皮细胞促进伤口边缘细胞再生和损伤修复，还可通过间接刺激其它细胞因子的分泌促进肉芽组织的形成，减少疤痕的形成。KGF-2在整个脊椎动物的胚胎发育过程中起着不可替代的作用，参与并调控多种组织和器官的形成和分化，如在四肢、肺、支气管、牙龈、胰腺、脑垂体、眼睑和皮肤及下颌腺等器官的发育和成熟过程中的重要作用。美国人类基因组公司(Human GenomeSciences，HGSI)开发的Repifermin(KGF-2)针对难治性上皮损伤(化疗引起的口腔粘膜炎、糖尿病静脉溃疡、溃疡性结肠炎等)进行的多项临床试验，证实了KGF-2无论是局部用药还是静脉注射均具有良好的稳定性及安全性[Robson MC，Phillips TJ，Falanga V，etal.Randomized trial of topically applied repifermin(recombinant humankeratinocyte growth factor-2)to accelerate wound healing in venous ulcers.WoundRepair Regen.2001，9(5)：347-52.][Sandborn WJ，Sands BE，Wolf DC，et al.Repifermin(keratinocyte growth factor-2)for the treatment of active ulcerativecolitis：a randomized，double-blind，placebo-controlled，dose-escalation trial.Aliment Pharmacol Ther.2003，17(11)：1355-64.]。目前新生源公司生产的rhKGF-2正在进行应用于创伤愈合的III期临床试验。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取肺原位间充质干细胞的新方法，该方法具有较高的干细胞分离效率，使用该方法得到的干细胞具有较高的纯度。

为了达到上述目的，本发明提供了一种提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：在肺泡内给药角质细胞生长因子-2(KGF-2)或角质细胞生长因子(KGF)以富集肺间充质干细胞，然后进行肺泡灌洗，将所得的灌洗液中的肺间充质干细胞分离后进行纯化，得到肺间充质干细胞。

优选地，所述的肺泡内给药方法为经气管内药物滴注。

优选地，所述的肺泡灌洗在肺泡内给药1～5天后进行。

更优选地，所述的肺泡灌洗在肺泡内给药3天后进行。

优选地，所得的肺间充质干细胞采用流式细胞仪进行鉴定，特异性的干细胞标记物包括CD73、CD90、CD29、CD45和CD34，其中，CD73、CD90和CD29中的两种以上染色阳性，CD45和CD34均为染色阴性。

与已知的肺间充质干细胞提取方法相比，本发明的价值在于发现了KGF-2可富集肺间充质干细胞，从而方便用肺泡灌洗的方法提取，可以在正常动物肺组织中提取间充质干细胞，具有提取的细胞纯度高，活力好，应用方便等优点。该方法有望丰富临床干细胞治疗的细胞来源，为自体肺间充质干细胞的分离提供一种新的手段。

附图说明

图1是灌洗所得细胞接种于培养皿后48小时，可见贴壁生长的体积较大的不规则形态的

细胞(肺间充质干细胞)及体积较小的圆形细胞(肺泡巨噬细胞)。

图2是培养第14天肺间充质干细胞形成集落，细胞呈鱼群状或漩涡状排列。

图3是透射电镜观察分离培养的肺间充质干细胞。

图4a是肺间充质干细胞诱导向成骨细胞分化，茜素红染色显示钙结节形成。

图4b是肺间充质干细胞诱导向成骨细胞分化，免疫荧光染色显示Osteocalcin表达阳性。

图5a是肺间充质干细胞诱导向软骨细胞分化，H&E染色显示软骨基质形成。

图5b是肺间充质干细胞诱导向软骨细胞分化，免疫荧光染色显示Aggrecan表达阳性。

图6a是肺间充质干细胞诱导向脂肪细胞分化，油红0染色显示细胞内脂滴形成。

图6b是肺间充质干细胞诱导向脂肪细胞分化，免疫荧光染色显示FABP4表达阳性。

图7是流式细胞仪分析显示，肺间充质干细胞表达CD29阳性(a线为同型对照，b线为CD29)。

图8是流式细胞仪分析显示，肺间充质干细胞表达CD73阳性(a线为同型对照，b线为CD73)。

图9是流式细胞仪分析显示，肺间充质干细胞表达CD90阳性(a线为同型对照，b线为CD90)。

图10是流式细胞仪分析显示，肺间充质干细胞表达CD34阴性(a线为同型对照，b线为CD34)。

图11是流式细胞仪分析显示，肺间充质干细胞表达CD45阴性(a线为同型对照，b线为CD45)。具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。本发明所述的角质细胞生长因子-2是重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)，为上海新生源医药有限公司基因重组的纯化多肽产物(专利号CN 1888066A)。根据药理作用，KGF与KGF-2一样会对干细胞有原位富集作用，故本发明的保护范围不限于特定的角化上皮生长因子。不同浓度的KGF与KGF-2皆具有干细胞富集作用，故本发明的保护范围不限于实施例中提到的具体浓度。

实施例

步骤1、KGF-2预处理：角质细胞生长因子-2的给药途径为肺内局部用药，是由无创的人工气道直接滴注给药。将大鼠麻醉后固定于合适大小的平板上，打开口腔，看到声门后，将气管插管迅速置入声门下1厘米左右，为避免损伤局部粘膜，动作应迅速而轻柔。置管完成后，将大鼠倾斜放置，与地面呈60度角，经气管插管向气道内缓慢滴注浓度为2mg/ml的rhKGF-2水溶液，剂量为5mg rhKGF-2/kg体重，滴注完毕后向气道内注入2ml空气，反复注入空气共3次，使管腔内液体充分分布至小气道。滴注完毕后，改变大鼠体位数次，使肺内药物尽量均匀分布。

步骤2、肺间充质干细胞提取：3天后，腹腔注射20wt％乌拉坦7.5ml/kg体重麻醉大鼠；固定大鼠，酒精消毒皮肤，分离股动脉，放血；消毒颈部及胸部皮肤，剪开颈部皮肤，分离气管，插入气管插管，丝线固定；从腹腔开胸，剪断肋软骨。以10ml注射器抽取4℃预冷灌洗液，连接气管插管，进行全肺灌洗，反复抽吸共3次，每次灌洗液在肺内停留约5秒，收集灌洗液于无菌50ml离心管中，反复灌洗共5次，收集灌洗液45ml左右，置于冰上保存，整个灌洗过程在超净台上进行，遵循无菌操作原则。所述的灌洗液为含5wt％胎牛血清、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2.5ug/ml两性霉素B、0.02wt％EDTA的DMEM/F-12培养基，配制方法为：将DMEM/F-12培养基(Gibco，#11330)与胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B以及EDTA按比例混合。

步骤3、干细胞分离：灌洗液以800rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀以1ml完全培养液重悬，计数每管细胞密度及总数。所述的完全培养液为含10％胎牛血清、2mmol/l L-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素、2.5ug/ml两性霉素B的DMEM/F-12培养基，配制方法为：将DMEM/F-12培养基(Gibco，#11330)与L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素和两性霉素B按比例混合。将细胞按照一定密度接种于培养板上：60mm培养皿接种7×10⁵个细胞(3.6×10⁴/cm²)。细胞贴壁24小时后换培养液，用培养液洗去未贴壁细胞，之后每3天换一次培养液，所述培养液皆为上述的完全培养液。

步骤4、干细胞纯化：如图1所示，培养48小时可观察到贴壁生长体积较大的不规则形细胞，如图2所示，培养14天，可观察到间充质干细胞生长形成集落，予0.25％胰酶消化传代。传代2-3次后细胞纯度可达95％以上。流式细胞检测显示CD45阳性率＜5％，即巨噬细胞数量少于5％，可说明细胞纯度。原理是肺泡灌洗液中的细胞主要为肺泡巨噬细胞和肺间充质干细胞，而巨噬细胞无增殖能力，随着培养时间延长而逐渐凋亡，肺间充质干细胞增殖力强，呈优势生长，故无须特殊传代方法，常规胰酶消化传代2-3次后细胞即可得到逐步纯化。

步骤5、鉴定：如图3所示，所得的干细胞通过透射电镜观察可见细胞核内疏松的染色质和核仁，细胞表面具有丰富的微绒毛。应用R&D公司生产的大鼠间充质干细胞功能鉴定试剂盒(Rat Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit，#SC020)，将分离的肺间充质干细胞分别向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞进行诱导分化，经上述细胞特异表达蛋白的免疫荧光染色及特殊化学染色鉴定结果显示，分离的肺间充质干细胞具有向成骨细胞(图4a和4b)、软骨细胞(图5a和5b)、脂肪细胞(图6a和6b)分化的潜能，如图7-图11所示，流式细胞仪分析显示CD73、CD90、CD29均为阳性，CD45和CD34均为阴性。

本说明书中所说明和讨论的实施方案仅仅是用于向本领域的技术人员演示发明人已知的使用本发明的最佳方式。说明书中的任何内容均不能认为是对本发明范围的限定。可以对以上实施方案进行修改而不超出本发明的范围，通过以上说明，这对于本领域的技术人员是显而易见的。因此应当理解，在权利要求书及其等同物的范围内，可以与以上具体描述不同的方式实施本发明。

Claims

1.一种提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：在肺泡内给药角质细胞生长因子-2或角质细胞生长因子以富集肺间充质干细胞，然后进行肺泡灌洗，将所得的灌洗液中的肺间充质干细胞分离后进行纯化，得到肺间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的肺泡内给药方法为经气管内药物滴注。

3.如权利要求1所述的提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的肺泡灌洗在肺泡内给药1～5天后进行。

4.如权利要求3所述的提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的肺泡灌洗在肺泡内给药3天后进行。

5.如权利要求1所述的提取肺间充质干细胞的方法，其特征在于，所得的肺间充质干细胞采用流式细胞仪进行鉴定，特异性的干细胞标记物特异性的干细胞标记物包括CD73、CD90、CD29、CD45和CD34，其中，CD73、CD90和CD29中的两种以上染色阳性，CD45和CD34均为染色阴性。