CN101157910A

CN101157910A - 适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系

Info

Publication number: CN101157910A
Application number: CNA2007101129486A
Authority: CN
Inventors: 马立宪; 王刚; 邵丽华; 江渊; 王爱华
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2007-09-19
Filing date: 2007-09-19
Publication date: 2008-04-09

Abstract

本发明涉及一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系及其制备方法，杂交细胞系HepCHLine是由人原代肝细胞和筛选HGPRT阴性的HepG2作为亲本细胞，经融合杂交而得，是一种全新的物质。HepCHLine继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。本发明首次制备出适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系HepCHLine，很好地满足了对人HBV及其自然状态下感染宿主细胞研究的需要。

Description

适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系

技术领域

本发明涉及一种适应人乙肝病毒(HBV)自然感染和复制并可传代培养的杂交细胞系Hepatocyte hybrid line(简称为HepCHLine)及其制备方法，属于生命科学和医学中HBV细胞培养技术领域。

背景技术

乙型肝炎是我国的重要传染病之一。迄今对人乙肝病毒(HBV)病原学中HBV的早期感染和共价闭合环状DNA(cccDNA)的生成及调控机制尚不清楚。当前对HBV的认识大部分来自于其分子克隆，或其在外源性强启动子控制下部分基因的转染和表达；或鸭乙肝病毒(DHBV)感染原代鸭肝细胞的研究。这些技术手段和方法并不能满足对人HBV和其自然状态下感染宿主细胞研究的要求，因此当前对HBV的早期感染及cccDNA复制的有关认识是模糊的。然而明确这些认识对于揭示HBV的感染和复制规律甚为重要，对于乙型肝炎的防治具有重要意义。人原代肝细胞对HBV比较敏感，但是不能在体外长期传代培养；人肝肿瘤细胞能在体外长期培养但对HBV不敏感；外源性强启动子控制下部分HBV基因的转染和表达技术不能用于研究HBV自然状态下感染的过程；鉴于上述原因，需要一种既能对HBV敏感，又能在体外长期传代培养的细胞系，以满足对人HBV和其自然状态下感染宿主细胞研究的需要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种适应人乙肝病毒(HBV)自然感染和复制并可传代培养的杂交细胞系(Hepatocyte hybrid line，以下简称为HepCHLine)及其制备方法。本发明的技术任务如下：

(1)提供一种经人原代肝细胞和人肝胚瘤传代细胞(HepG2)融合杂交而产生的新生产物-杂交细胞系HepCHLine，它继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养；

(2)提供一种HepCHLine的制备方法；

(3)提供的HepCHLine可用于研究HBV自然感染和复制并可传代培养。

下面是本发明中使用的英文缩写说明：

HepCHLine：人原代肝细胞和人肝胚瘤传代细胞(HepG2)融合杂交而产生的杂交细胞系Hepatocyte hybrid line的英文简称。

HepG2：人肝胚瘤传代细胞。

HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。

HGPRT^-：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阴性。

HGPRT^-HepG2：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阴性的人肝胚瘤传代细胞。

HAT培养基：次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷培养基。

HT培养基：次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷培养基。

DMEM培养基：细胞基础培养基，可市场购买。

本发明的技术方案如下：

一、本发明的杂交细胞系

本发明的杂交细胞系HepCHLine是由人原代肝细胞和筛选HGPRT阴性的HepG2作为亲本细胞，经融合杂交而得，是一种全新的物质。HepCHLine继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。

二、本发明的杂交细胞系HepCHLine的制备

一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，包括步骤如下：

a.对HepG2细胞进行诱导突变，并筛选HGPRT阴性的HepG2作亲本细胞；

b.分离培养人原代肝细胞作亲本细胞；所述的人原代肝细胞选自非HBV感染并且无其它嗜肝病毒感染，由肝脏手术获得的肝细胞；或者来自于年龄＜50岁、血清病毒HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的乙肝病毒感染但无其它嗜肝病毒感染的HBV感染者，通过肝活检获得的肝细胞。

c.将步骤b.分离培养的人原代肝细胞和步骤a.筛选的HGPRT阴性HepG2相融合，得合胞体细胞；对该合胞体细胞进行筛选，得杂交细胞。

上述杂交细胞可在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞长椭圆形，可传代培养，传代一次约需3-5天。可冻存，经冻存复苏后可继续生长。

下面是对杂交细胞的验证：

(1)对上述杂交细胞进行染色体核型分析、鉴定；

(2)检测不同代次HepCHLine中的HBV标志物HBsAg、HBeAg和HBV的rcDNA、cccDNA。

如果是由非HBV感染者的原代肝细胞与筛选的HepG2杂交所产生HepCHLine，则在步骤(1)之后先用HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的血清感染后再进行步骤(2)的操作。

以上是杂交细胞系HepCHLine的制备的综述，各步骤中的具体操作可参照现有技术。

上述各步骤中，本发明优选的操作如下：

上述步骤a.是将HepG2细胞经0.3g/L乙基甲磺酸(EMS)诱导作用16小时，除去EMS，在DMEM培养基培养7-10天后加入6-巯基嘌呤(6-MP)使其终浓度为10mg/L，继续培养48小时。筛选出HGPRT阴性(HGPRT^-)的HepG2细胞。

上述步骤b.的具体操作如下：

取肝脏手术病人，或HBV感染者肝脏穿刺检查而获得的肝组织少许，用含双抗(青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)的PBS缓冲液冲洗3-4次，将肝脏组织剪成小块，加入5ml0.01％的VI型胶原酶，37℃消化15min，将含胶原酶的上清液移入离心管中，重复进行一次，收集上清，将剩余组织块在200目铜网上研磨，培养基冲洗，收集上清，将所有上清一起离心，500rpm离心5min，重复3次，去除血细胞。用肝细胞培养液重悬离心所得沉淀采用差异贴壁法分离肝实质细胞与成纤维细胞，通过台盼兰染色排除法确定肝细胞存活率大于90％，备用。

上述步骤c.中所述的融合是应用融合剂50％聚乙二醇(PEG)实现人原代肝细胞与HGPRT^-HepG2的融合。

上述步骤c.的具体操作如下：

用胰酶消化法将HGPRT^-HepG2细胞和人原代肝细胞制成细胞悬液，计数板计数，将HGPRT^-HepG2细胞和分离得到的人原代肝细胞以20∶1的比例混合，离心去除血清，缓慢加入1ml50％PEG，进行融合作用1分钟，离心弃上清，用完全培养基重悬后移入培养板，24小时后加HAT选择培养基，2-3天换液一次，2周后利用有限稀释法将融合后细胞进行克隆，直至每孔含一个细胞，等细胞稳定生长后换HT选择培养基，1周后换用含10％胎牛血清的DMEM培养基维持培养。倒置显微镜下观察可见存活的融合细胞，所得杂交细胞形态学上与HepG2细胞相似。未杂交的细胞或HGPRT阴性的HepG2同核体融合细胞在HAT培养基中不能存活。未融合的或融合的同核体原代肝细胞则不能传代。只有异核体-杂交细胞才能存活。

杂交细胞可在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞长椭圆形，可传代培养，传代一次需3-5天，经冻存复苏后可继续生长。以此培育出杂交细胞系HepCHLine。

更为重要详细的杂交细胞系HepCHLine的制备将在具体实施方式中进一步说明。

优良效果

本发明首次制备出适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系HepCHLine，HepCHLine是一种全新的物质，不是自然界天然存在的，此前也没有公开报道。本发明的HepCHLine继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。很好地满足了对人HBV及其自然状态下感染宿主细胞研究的需要。

附图说明

图1.经诱导突变后的HepG2细胞。

图2.经6-MP筛选的HGPRT阴性HepG2细胞与人肝原代细胞融合后形成杂交细胞HepCHLine。

图3.HepG2经MES诱变后，经6-MP筛选的HGPRT阴性HepG2细胞核型分析，显示53条染色体。

图4.经6-MP筛选的HGPRT阴性HepG2细胞与人肝原代细胞融合后形成杂交细胞HepCHLine的核型分析，显示99条染色体。

图5.HepCHLine的细胞生长曲线。横坐标：时间(天)，纵坐标：细胞数，×10⁴/ml。

图6.HepCHLine培养上清液中HBVrcDNA的检测结果。巢式PCR检测出融合细胞培养上清中HBVrcDNA，图中，1、阴性对照，2、融合细胞培养上清HBV rcDNA(C型，分子量120bp)，3、阳性对照(乙型肝炎患者血清HBV rcDNA B+C型，B型：278bp，C型：120bp)，4、分子量标准。

图7.HepCHLine细胞DNA提取物中HBV cccDNA的检测结果。图中1、阴性对照，2、融合细胞内cccDNA(294bp)，3、阳性对照(慢性乙型肝炎患者肝穿组织内cccDNA)，4、分子量标准。

具体实施方式

为筛选出需要的杂交细胞，根据HGPRT阴性HepG2细胞不能在HAT选择培养基中存活，而人原代肝细胞不能传代培养的原理：首先从HepG2细胞选出HGPRT^-HepG2，再将HGPRT^-HepG2与人原代肝细胞融合，融合后的杂交细胞可以含有来自后者的HGPRT，因而能在HAT选择培养基中存活。未融合的或融合的同核体HGPRT^-HepG2细胞不能在HAT选择培养基中存活，未融合的或融合的同核体人原代肝细胞能在HAT选择培养基中存活但不能传代，所以最后能存活下来的就是我们筛选出的杂交细胞。

1.HepG2细胞的诱导突变和HGPRT阴性HepG2的筛选

HepG2细胞经0.3g/L乙基甲磺酸(EMS)诱导作用16小时，除去EMS，DMEM培养基培养7-10天后加入6-巯基嘌呤(6-MP)使其终浓度为10mg/L，继续培养48小时，为防止回复突变，每3周左右加入6-MP重复筛选。筛选出次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶阴性(HGPRT^-)的HepG2细胞为最终得到的能耐受6-MP且不能在次黄嘌呤氨基喋呤胸腺嘧啶(HAT)选择培养基中生长的细胞，这表明经诱导后细胞中次黄嘌呤核苷酸焦磷酸化酶(IPP)的完全缺失。结果显示：HGPRT^-HepG2细胞的特性与野生型的HepG2细胞相似，例如形态学、细胞倍增时间和染色体数的均值(如图1所示)。

2.人原代肝细胞的分离与培养

人原代肝细胞选自非HBV感染并且无其它嗜肝病毒感染，由肝脏手术获得的肝细胞；或者来自于年龄＜50岁、血清病毒HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的乙肝病毒感染但无其它嗜肝病毒感染的HBV感染者，通过肝活检获得的肝细胞。。HBV感染者肝细胞不影响本研究结果。因为已感染细胞在与未感染细胞融合的同时可把病毒传播至未感染细胞，是病毒感染扩散的一种方式，如艾滋病毒、出血热病毒等。取肝脏手术病人，或HBV感染者肝脏穿刺检查而获得的肝组织少许，用含双抗(青霉素100u/ml、链霉素100u/ml)的PBS缓冲液冲洗3-4次，如系手术标本，修剪坏死及结缔组织，将肝脏组织剪成约5mm³的小块，加入5ml0.01％的VI型胶原酶，37℃消化15min，将含胶原酶的上清液移入离心管中，重复进行一次，收集上清，将剩余组织块在200目铜网上研磨，培养基冲洗，收集上清，将所有上清一起离心，500rpm离心5min，重复3次，去除血细胞。用肝细胞培养液重悬离心所得沉淀采用差异贴壁法分离肝实质细胞与成纤维细胞，通过台盼兰染色排除法确定肝细胞存活率大于90％，备用。

3.细胞融合和杂交细胞的筛选

根据HGPRT^-HepG2细胞不能在HAT选择培养基中存活，而人原代肝细胞不能传代培养的原理，只有融合杂交细胞能在HAT选择培养基中存活和传代。用胰酶消化法将HGPRT^-HepG2细胞和人原代肝细胞制成细胞悬液，计数板计数，将HGPRT^-HepG2细胞和分离得到的人原代肝细胞以20∶1的比例混合，离心去除血清，缓慢加入1ml50％PEG，(利用50％PEG)进行融合作用一分钟，离心弃上清，用完全培养基重悬后移入培养板，24小时后加HAT选择培养基，2-3天换液一次，2周后利用有限稀释法将融合后细胞进行克隆，直至每孔含一个细胞，等细胞稳定生长后换HT选择培养基，1周后换含10％胎牛血清的DMEM维持培养。倒置显微镜下观察可见融合细胞，发现杂交细胞形态学上与HepG2细胞相似(如图2所示)。杂交细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞长椭圆形，可传代培养，传代一次约需3-5天，经冻存复苏后可继续生长。同步进行人原代肝细胞培养作为对照，结果显示人原代肝细胞经历短暂，少量增殖后渐趋老化，平均寿命约20天，未发现人原代肝细胞能传代培养。

4.杂交细胞的染色体核型分析

取对数生长期的野生型HepG2细胞、HGPRT^-HepG2细胞和杂交细胞，加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，在37℃下作用4h，离心收集细胞，用0.075mol/L KCL低渗处理25min使细胞膜膨胀减少染色体相互缠绕、重叠程度，使染色体分散良好，以甲醇：冰乙酸配制固定液进行固定处理后吹片制备染色体标本，再利用常规胰蛋白酶G显带技术处理染色体标本，得到分散良好的中期染色体分裂相。分别对野生型HepG2细胞、HGPRT^-HepG2细胞和杂交细胞的20个分裂相的染色体进行计数，所得的众数分别是：51条、53条(如图3所示)和99条(如图4所示)，这表明所得的杂交细胞是一融合细胞株，为人原代肝细胞(46条染色体)与HGPRT^-HepG2细胞(53条染色体)的融合杂交细胞。

5.杂交细胞的生长曲线

取生长状态良好的杂交细胞消化制成0.2×10⁴/ml的细胞悬液，接种于24孔培养板中，从接种后第二天每日计数3个孔中的细胞数连续7天，绘制生长曲线。杂交细胞仍在传代培养过程中，培养至第11代时以0.2×10⁴/孔接种孔板，经过约1天的滞留期后进入对数生长期，在第4天达到生长高峰，第7天有细胞开始死亡，此后进入平台期，生长曲线如图5所示。

6.融合细胞分泌成熟HBV病毒颗粒的检测——巢式PCR检测融合细胞培养上清中HBVrcDNA

将经融合并筛选后的杂交细胞进行传代培养，视细胞生长情况给予换液或传代处理。收集每次传代及换液时的细胞培养上清液进行巢式PCR检测，在第1代及至传代培养第11代的细胞培养上清液中可检测到HBV rcDNA的存在(如图6所示)，对照的HepG2培养上清HBV DNA检测呈阴性。该结果提示杂交细胞中存在HBV DNA的复制和分泌现象。

引物：

第一轮引物：——根据pre-S1到S基因区的保守核酸序列设计

P1-1：5′-TCA CCA TAT TCT TGG GAA CAA GA-3′

(第2823到2845位核苷酸)

P1-2：5′-CGAACC ACT GAA CAAATG GC-3′

(第685到704位核苷酸)

第二轮公用上游引物：

P2-1：5′-GGC TCA AGT TCA GGA ACA GT-3′

(第67到86位核苷酸)

下游引物：

P2-2B：5′-CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A-3′

(B型下游引物)(第324到345位核苷酸)最终反应产物应为278bp。

P2-2C：5′-GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G-3′

(C型下游引物)(第165到186位核苷酸)最终反应产物应为120bp。

收集HepCHLine培养上清，1000rpm离心10分钟，去除沉淀后煮沸裂解10分钟，

15000rpm离心10分钟，取上清作为第一轮PCR反应的模板。

反应体系：

第一轮：

总体积	50μl
总体积	50μl	模板Mg²⁺dNTPs10×PCR BufferP1-1	10μl3μl4μl5μl1μl

P1-2Taq酶DDW

1μl0.5μl25.5μl

反应条件：

94℃预变性3分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃60秒，30个循环；72℃7分钟。

第二轮(以第一轮PCR反应的产物作为模板)：

总体积	50μl
总体积	50μl	模板Mg²⁺dNTPs10×PCR BufferP2-1P2BP2CTaq酶DDW	5μl3μl4μl5μl1μl1μl1μl0.5μl29.5μl

反应条件：

94℃预变性3分钟；94℃30秒，57℃30秒，72℃60秒，35个循环；72℃ 7分钟

反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察结果：HepCHLine培养上清可见HBVrcDNA。如图6所示。

7.融合细胞内HBV复制中间体的检测——巢式PCR检测融合细胞内HBV cccDNA

为了提高cccDNA检测的特异性，采用了以下方法：由于HBV基因负链DNA的5’末端包含一个单链的缺口和短的三链区域。这些部位均对单链特异性核酸酶如绿豆核酸酶敏感，而cccDNA则对该酶有抗性。绿豆核酸酶可以水解单链的HBV DNA。同时使用“缺口引物法”选择性地检测cccDNA。这一检测的引物选择那些三链区域和缺口区域两端的序列来设计，由于rcDNA正链的缺口使之不能扩增。由此提高cccDNA检测的特异性。由于cccDNA的水平太低难以用普通的PCR的方法来检测，所以选用了巢式PCR。

引物：cccDNA引物设计时参照的基因序列是ncbi AY123424 HBV DNA序列(gi：22203511)

引物P1-1(第1443到1462位核苷酸，CTGAATCCCGCGGACGACCC)；

引物P1-2(第1891到1871位核苷酸，ACCCAAGGCACAGCTTGGAGG)；

引物P2-1(第1553到1573位核苷酸，GTC TGT GCC TTC TCA TCT GCC)；

引物P2-2(第1846到1823位核苷酸，AGA TGA TTA GGC AGA GGT GAA AAA)。

第二轮PCR产物：约294bp。

收集约10⁴个融合细胞，提取细胞基因组DNA，溶于30μl TE中。首先用绿豆核酸酶对HBV DNA的单链区域，及约1923到1934碱基处基因组DNA三链不连续区域处进行降解，37℃作用15分钟，立即置于冰水浴，作为PCR反应的模板。

绿豆核酸酶的反应体系：

总体积	15μl
总体积	15μl	细胞基因组DNA	12μl

绿豆核酸酶(100U/μl)10×BufferDDW

0.5μl1.5μl1μl

PCR反应体系如下：

第一轮：

总体积	50μl
总体积	50μl	模板Mg²⁺dNTPs10×PCR BufferP1-1P1-2Taq酶DDW	5μl4μl4μl5μl1μl1μl0.5μl29.5μl

反应条件：

94℃预变性3分钟；94℃30秒，51℃30秒，72℃60秒，35个循环；72℃7分钟。

第二轮(以第一轮PCR反应的产物作为模板)：

总体积	50μl
总体积	50μl	模板Mg²⁺dNTPs10×PCR BufferP2-1P2-2Taq酶DDW	5μl4μl4μl5μl1μl1μl0.5μl29.5μl

反应条件：

94℃预变性3分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃60秒，35个循环；72℃7分钟。反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后观察结果：HepCHLine细胞提取的DNA模板中可检出HBV cccDNA。如图7所示。

8.融合细胞分泌蛋白功能的检测——检测融合细胞培养上清中HBsAg与HBeAg

三次换液后，收集培养上清，1000rpm离心10分钟，去除沉淀，送山东大学齐鲁医院检验科免疫室，电化学发光法检测上清中HBsAg与HBeAg(Roche公司，Elecsys2010全自动电化学发光免疫分析仪)

检测结果：

HBsAg：60.80(＞1为阳性)，

HBeAg：1.69(＞1为阳性)。

Claims

1.一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系，其特征在于是由人原代肝细胞和筛选HGPRT阴性的HepG2作为亲本细胞，经融合杂交而得，该杂交细胞系继承了亲代人肝细胞对HBV感染的敏感性和HepG2能接种动物或传代培养的特性，既能适应HBV的自然感染又能长期传代培养。

2.一种适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

b.分离培养人原代肝细胞作亲本细胞；所述的人原代肝细胞选自非HBV感染并且无其它嗜肝病毒感染，由肝脏手术获得的肝细胞；或者来自于年龄＜50岁、血清病毒HBV载量＞1.0×10⁷cp/ml的乙肝病毒感染但无其它嗜肝病毒感染的HBV感染者，通过肝活检获得的肝细胞；

3.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤c.所得杂交细胞在培养瓶中单层贴壁生长，细胞长椭圆形，传代一次3-5天。

4.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤a.中对HepG2细胞进行诱导突变是将HepG2细胞经0.3g/L乙基甲磺酸(EMS)诱导作用16小时，除去EMS，在DMEM培养基培养7-10天后加入6-巯基嘌呤(6-MP)使其终浓度为10mg/L，继续培养48小时。

5.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤b.的分离培养人原代肝细胞作亲本细胞，操作如下：

取肝脏手术病人，或HBV感染者肝脏穿刺检查而获得的肝组织少许，用含双抗(青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)的PBS缓冲液冲洗3-4次，将肝脏组织剪成小块，加入5ml0.01％的VI型胶原酶，37℃消化15min，将含胶原酶的上清液移入离心管中，重复进行一次，收集上清，将剩余组织块在200目铜网上研磨，培养基冲洗，收集上清，将所有上清一起离心，500rpm离心5min，重复3次，去除血细胞；用肝细胞培养液重悬离心所得沉淀采用差异贴壁法分离肝实质细胞与成纤维细胞，通过台盼兰染色排除法确定肝细胞存活率大于90％，备用。

6.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，步骤c.中所述的融合是应用融合剂50％聚乙二醇实现人原代肝细胞与HGPRT^-HepG2的融合。

7.如权利要求2所述的适应人乙肝病毒自然感染复制并可传代培养的杂交细胞系的制备方法，其特征在于，上述步骤c.的具体操作如下：

用胰酶消化法将HGPRT^-HepG2细胞和人原代肝细胞制成细胞悬液，计数板计数，将HGPRT^-HepG2细胞和分离得到的人原代肝细胞以20∶1的比例混合，离心去除血清，缓慢加入1ml50％PEG，进行融合作用1分钟，离心弃上清，用完全培养基重悬后移入培养板，24小时后加HAT选择培养基，2-3天换液一次，2周后利用有限稀释法将融合后细胞进行克隆，直至每孔含一个细胞，等细胞稳定生长后换HT选择培养基，1周后换用含10％胎牛血清的DMEM培养基维持培养；倒置显微镜下观察可见存活的融合细胞，所得杂交细胞形态学上与HepG2细胞相似；未杂交的细胞或HGPRT阴性的HepG2同核体融合细胞在HAT培养基中不能存活；未融合的或融合的同核体原代肝细胞则不能传代；只有异核体-杂交细胞才能存活。