CN114107377A - 一种乙肝病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种乙肝病毒载体及其用途。具体而言，本发明包括一种突变型乙型肝炎病毒表达载体，使用该乙型肝炎病毒表达载体制备的体外高感染感性C基因型乙肝病毒株。本发明的乙型肝炎病毒表达载体含有缺失5’端前S1区编码序列的C基因型乙型肝炎病毒的编码序列。试验表明，该表达载体可用于制备高感染性的C基因型乙型肝炎病毒分离株，可以用于基于体外感染实验的C基因型HBV与宿主的相互作用、cccDNA的形成和降解及抗HBV药物的筛选等相关研究。

Description

一种乙肝病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种乙肝病毒(乙型肝炎病毒)载体。具体而言，本发明涉及一种乙型肝炎病毒表达载体，使用该乙型肝炎病毒表达载体制备体外高感染感性C基因型乙肝病毒株，以及C基因型乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)临床分离株，可以用于基于体外感染实验的C基因型HBV与宿主的相互作用、cccDNA的形成和降解及抗HBV药物的筛选等相关研究。
背景技术
现有技术公开了乙型肝炎病毒感染是全球重大公共卫生问题。目前，约有2.5亿人慢性感染HBV，占全世界总人口的3.5％。持续慢性HBV感染会导致肝硬化、肝癌等恶性结局。在我国，60％的肝硬化及80％的肝癌患者均由HBV引起。HBV根据其全基因组序列的差异是否大于8％可分为10种基因型(A-J)。我国主要以B和C基因型HBV感染为主。
HBV的感染具有高度的种属和组织特异性，长期以来，由于对HBV受体缺乏认识，体外细胞实验难以建立稳定有效的感染，HepG2等肝癌细胞系仅支持HBV复制，体外无法自然感染HBV，仅高度分化的人原代肝细胞(primary human hepatocyte，PHH)和树鼩原代肝细胞(primary tupaia hepatocyte，PTH)可以支持完整的HBV感染和复制周期，是HBV体外研究最理想的细胞模型，但长期体外培养极易丢失肝细胞特性，最近，一项研究筛选到5种小分子组合(5C)，并利用5C成功实现了肝细胞功能在体外的长期维持，但原代肝细胞的应用仍受到了体外培养条件苛刻、无法扩增等缺点的限制。分化的HepaRG细胞也可以被HBV直接感染，作为一种肝脏前体细胞，HepaRG细胞保留了大量原代肝细胞的特性，其细胞色素P450的表达水平和固有免疫成分均与PHH类似，但感染前诱导分化过程耗时长，且感染效率低；2012年，NTCP被证明是HBV进入肝细胞的高亲和力受体，更有意义的是，当肝癌细胞系外源性表达NTCP后，可获得对HBV的易感性，但外源性表达NTCP的肝癌细胞系仍存在很多不足，如感染效率较低，仅高滴度病毒才可有效感染，并且感染过程常需PEG的辅助，虽然存在很多缺陷，外源性表达NTCP的肝癌细胞系仍因具有可体外无限增殖、不需长时间诱导等优点而被广泛用于体外感染实验。由此可见，对于大部分可用于HBV感染实验的细胞来说，体外感染效率较低是其共有的主要问题。
除细胞外，HBV感染过程中另一个重要因素是病毒。目前，在病毒来源方面，各实验室用于感染的病毒主要来自于稳定转染肝癌细胞系(HepAD38、HepDE19等)产生的病毒，即细胞培养来源的HBV(cell culture derived HBV，cHBV)，且cHBV均为D基因型，也就是说，现有基于感染实验得到的结论大部分来自于D基因型HBV。但不同基因型的HBV在分子生物学特点、与免疫系统相互作用和抗HBV药物应答等方面存在明显差异。目前缺乏可高效感染的B或C基因型HBV临床毒株，猜测可能与B和C基因型病毒体外感染性较低有关。因而，寻找一种具有体外高感染性的B或C基因型HBV模型毒株，用于体外感染实验，仍是有待解决的一个问题。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一株具有体外高感染性的HBV模型毒株的表达载体。
本发明要解决的另一个技术问题是提供上述具有体外高感染性的HBV模型表达载体的制备方法和应用。
本发明提供了一种乙型肝炎病毒表达载体，所述的乙型肝炎病毒载体含有缺失5’端前S1区编码序列的C基因型乙型肝炎病毒的编码序列。
所述的乙型肝炎病毒表达载体可以使用各种常规的肝炎病毒表达载体制备。
本发明筛选53例高HBV DNA载量的B或C基因型慢性HBV感染者血清HBV的体外感染性，发现大部分标本感染性均较低，仅一例血清在HepG2/NTCP和分化的HepaRG两种细胞中均呈现高感染性。经研究后发现，该血清中的乙型肝炎病毒株的5’端前S1(preS1)区缺失。
为了构建高感染性的HBV表达质粒，我们构建了缺失5’端前S1(preS1)区的乙型肝炎病毒表达载体。同时，抽提高感染患者血清HBV DNA，挑选全基因克隆，连接入载体pcDNA3.1 zeo(-)，构建HBV 1.1倍体表达质粒。其中，以克隆42.5为野生型HBV毒株，以克隆42.5-18为缺失型HBV毒株。用相同拷贝数的HBV 1.1倍体表达质粒转染肝源细胞，比较其中乙型肝炎病毒的抗原量。
目前，由于HBV体外感染效率较低，用ELISA方法检测可分泌的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)成为判断感染强弱最简单有效的方法。通过本发明构建的高感染性乙型肝炎病毒表达载体获得的病毒与临床分离的缺失型病毒，感染相同的细胞后分泌的抗原相当。野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP和分化的HepaRG细胞，克隆42.5-18感染后第15天上清中分泌的HBeAg(图1)和HBsAg(图2)水平均明显强于野生型克隆42.5。
本发明还提供了上述乙型肝炎病毒表达载体的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)构建5’端前S1区缺失突变的乙型肝炎病毒编码核酸序列；
(2)将步骤(1)获得的乙型肝炎病毒编码序列连接入表达载体，获得乙型肝炎病毒表达质粒；
(3)表达步骤(2)获得的乙型肝炎病毒表达质粒。
较好的，所述制备方法中，步骤(1)包括：
分离获得C基因型乙肝病毒5’端的编码序列；
构建C基因型乙肝病毒5’端前S1区缺失突变的核酸片段；和/或
使用C基因型乙肝病毒5’端前S1区缺失突变的核酸片段代替C基因型乙肝病毒5’端的编码序列。
所述的替代，可以是使用双酶切的方法，将缺失突变的序列替代野生型序列。也可以根据缺失突变的C基因型乙肝病毒5’端的编码序列，使用人工/化学合成方法，获得目标序列。
较好的，所述制备方法中，步骤(2)中所述的表达载体是pcDNA3.1 zeo(-)。
本发明还提供了所述的乙型肝炎病毒表达载体的应用，包括：
制备高感染性的乙型肝炎病毒株；
检测C基因型乙型肝炎病毒与宿主的相互作用；
检测cccDNA的形成和降解；或者
筛选抗分析研究的药物。
其中，所述的制备高感染性的乙型肝炎病毒株包括以下步骤：
将含有上述乙型肝炎病毒表达载体的质粒转染细胞；
换液，收集培养液的上清；
离心获得乙型肝炎病毒，冷藏过夜；
加入不含血清和沉淀剂的培养基，充分溶解。
较好的，所述的高感染性的乙型肝炎病毒株的制备方法如下：
将乙型肝炎病毒株表达质粒转染肝源细胞，转染后每隔2天换液，收集转染后第2-5天培养上清；
低温高速离心，取上清，加入PEG，混匀后冰上放置过夜；其中，整个步骤最好均在冰上操作，离心速度一般大于8000rpm，时间为3分钟以上；
再次低温高速离心，弃上清，再次低温高速离心，保留沉淀物；
加入FBS(-)/PEG(-)/RM或FBS(-)/PEG(-)/diffRG，冰上放置使其充分溶解。
本发明的乙型肝炎病毒表达载体的质粒转染细胞后，以胞内HBVDNA水平作为HBV进入肝细胞后有效复制强弱的检测指标。对于HBV体外感染实验，用Southern Blot方法检测感染后胞内复制水平较困难，但感染后胞内HBV DNA水平是HBV进入肝细胞后有效复制强弱的金标准，因而其检测具有重要意义。用相同拷贝数野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP和分化的HepaRG细胞，克隆42.5-18感染后第15天胞内HBV DNA复制水平均明显强于野生型克隆42.5(图3)。
cccDNA作为HBV的起始转录模板，对乙肝病毒的复制及感染状态的建立十分重要。当用相同拷贝数野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP细胞，克隆42.5-18感染后早期(第3天)和稍晚期(第15天)胞内cccDNA水平均明显强于野生型克隆42.5(图4)，提示HBV毒株42.5-18感染后形成cccDNA能力更强，更易于检测，该毒株更适合用于cccDNA的形成和降解等相关研究。
本发明还提供了一种乙型肝炎病毒的分离株，所述的乙型肝炎病毒的分离株是C基因型。
较好的，所述乙型肝炎病毒的分离株的5’端前S1区缺失突变。
实验表明，选用使用本发明的缺失preS1的乙型肝炎病毒表达载体构建的毒株42.5-18作为C基因型HBV体外感染实验的模型毒株，感染后分泌的HBeAg和HBsAg水平、胞内HBV DNA复制和cccDNA水平均明显增强，更易于被检测，因而可用于C基因型HBV与宿主的相互作用、cccDNA的形成和降解及抗HBV药物的筛选等相关研究。
目前缺乏可高效感染的B或C基因型乙型肝炎病毒(HBV)临床毒株，猜测可能与其体外感染性较低有关。因而，制备一种具有体外高感染性的B或C基因型HBV模型毒株，用于体外感染实验，仍是有待解决的一个问题。本发明筛选到一株C基因型HBV临床分离株(克隆42.5-18)，发现其具有体外高感染性，选用该毒株作为C基因型HBV体外感染实验的模型毒株，感染后分泌的HBeAg和HBsAg水平、胞内HBV DNA复制和cccDNA水平均明显增强，更易于被检测，因而可用于C基因型HBV与宿主的相互作用、cccDNA的形成和降解及抗HBV药物的筛选等相关研究。
附图说明
图1是野生型和克隆42.5-18感染后第15天上清中分泌的HBeAg图。
图2是野生型和克隆42.5-18感染后第15天上清中分泌的HBsAg图。
图3是野生型和克隆42.5-18感染细胞后HBV DNA的检测结果。
图4是野生型和克隆42.5-18感染细胞后ccc DNA的检测结果。
具体实施方式
实施例1.cHBV制备
本发明筛选53例高HBVDNA载量的B或C基因型慢性HBV感染者血清HBV的体外感染性，发现大部分标本感染性均较低，仅一例血清在HepG2/NTCP和分化的HepaRG两种细胞中均呈现高感染性。随后，从该血清中同时分离到野生型HBV和5’端前S1(preS1)区缺失突变HBV。
为了构建HBV表达质粒，我们抽提该患者血清HBV DNA，挑选全基因克隆，连接入载体pcDNA3.1 zeo(-)，构建HBV 1.1倍体表达质粒。其中，克隆42.5为野生型HBV毒株，克隆42.5-18为缺失型HBV毒株(即++++++本发明中高感染性临床分离株)。
具体制备方法如下：
1)2μg 1.1倍体质粒转染HepG2细胞，分别于转染后第1天和第3天换液，收集转染后第2-5天培养上清；
2)10000rpm 4℃离心5min，取上清，加入适量40％PEG(PEG终浓度为6％)，充分混匀后冰上放置16小时；
3)9500rpm 4℃离心60min，弃去上清，10000rpm 4℃离心1min，完全去除残留液体；
4)加入适量FBS(-)/PEG(-)/RM或FBS(-)/PEG(-)/diffRG，冰上放置过夜使其充分溶解。
从而获得本发明中高感染性临床分离株。
实施例2.感染实验
cHBV在FBS(-)/PEG(-)/RM中充分溶解后，加入适量40％PEG调节inoculum中PEG终浓度为4％，取相同拷贝数cHBV在4％PEG条件下感染细胞，一般细胞与病毒共孵育16-20小时。
3.感染后可检测指标：上清可分泌的HBeAg和HBsAg水平、胞内HBV DNA复制和cccDNA水平。
使用ELISA方法检测可分泌的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。用相同拷贝数野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP和分化的HepaRG细胞，克隆42.5-18感染后第15天上清中分泌的HBeAg(图1)和HBsAg(图2)水平均明显强于野生型克隆42.5。
对于HBV体外感染实验，用Southern Blot方法检测感染后胞内复制水平较困难，但感染后胞内HBV DNA水平是HBV进入肝细胞后有效复制强弱的金标准，因而其检测具有重要意义。用相同拷贝数野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP和分化的HepaRG细胞，克隆42.5-18感染后第15天胞内HBV DNA复制水平均明显强于野生型克隆42.5(图3)。
cccDNA作为HBV的起始转录模板，对乙肝病毒的复制及感染状态的建立十分重要。当用相同拷贝数野生型病毒(克隆42.5)和缺失型病毒(克隆42.5-18)感染HepG2/NTCP细胞，克隆42.5-18感染后早期(第3天)和稍晚期(第15天)胞内cccDNA水平均明显强于野生型克隆42.5(图4)。HBV毒株42.5-18感染后形成cccDNA能力更强，更易于检测，该毒株更适合用于cccDNA的形成和降解等相关研究。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种乙型肝炎病毒表达载体，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒载体含有缺失5’端前S1区的乙型肝炎病毒的编码序列。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表达载体，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒表达载体编码C基因型乙型肝炎病毒。
3.权利要求1所述的乙型肝炎病毒表达载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：
(1)构建5’端前S1区缺失突变的乙型肝炎病毒编码核酸序列；
(2)将步骤(1)获得的乙型肝炎病毒编码序列连接入表达载体，获得乙型肝炎病毒表达质粒；
(3)表达步骤(2)获得的乙型肝炎病毒表达质粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：
分离获得C基因型乙肝病毒5’端的编码序列；
构建C基因型乙肝病毒5’端前S1区缺失突变的核酸片段；和/或
使用C基因型乙肝病毒5’端前S1区缺失突变的核酸片段代替C基因型乙肝病毒5’端的编码序列。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的表达载体是pcDNA3.1 zeo(-)。
6.权利要求1所述的乙型肝炎病毒表达载体的应用，其特征在于，所述的应用包括：
制备高感染性的乙型肝炎病毒株；
检测C基因型乙型肝炎病毒与宿主的相互作用；
检测cccDNA的形成或者降解；或者
筛选抗乙型肝炎病毒的药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制备高感染性的乙型肝炎病毒株包括以下步骤：
将含有权利要求1所述的乙型肝炎病毒表达载体的质粒转染细胞；
换液，收集培养液的上清；
离心获得乙型肝炎病毒，冷藏过夜；
加入不含血清和沉淀剂的培养基，充分溶解。
8.一种乙型肝炎病毒的分离株，其特征在于，所述的乙型肝炎病毒的分离株是C基因型。
9.根据权利要求8所述的乙型肝炎病毒的分离株，其特征在于，所述乙型肝炎病毒的分离株的5’端前S1区缺失突变。
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