CN102559657A - 两片段连接法进行hbv全基因组克隆的方法 - Google Patents
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Abstract
采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV DNA进行巢式PCR反应，然后分别对扩增出的HBV CS区和pSX区两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接，以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆。所述CS区为HBV基因组的nt 1821～nt 272，pSX区为nt 3194～nt 1825。
Description
技术领域：
本发明涉及一种采用两片段连接法进行乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法。
背景技术：
从患者血清中扩增并克隆HBV全基因组序列，将有助于体外实验评价抗病毒药物或免疫压力下低病毒含量的HBV复制力、基因突变特征和频率及体外感染力，对于监控抗病毒疗效及深入阐明HBV生物学活性具有重要意义。
以往对于患者血清中低病毒含量HBV全基因组研究大多限于某一基因片段的研究，通过PCR扩增个体内HBV基因群中的某些亚基因片段，然后直接测序，可在模板量较低的条件下得到亚基因片段扩增产物，但由于HBV基因内部有调控基因，基因片段间又相互重叠，很可能形成HBV不同基因群片段构成一个可供分析的HBV基因片段，使出现在单个基因分子上的突变复杂性及致病和传播的关系无法精确和全面分析。有研究发现，由于病毒体内存在不同变异株，这种直接测部分序列的方法不能准确地提示完整病毒基因结构与病因及传播的关系。
采取普通的PCR方法扩增两个片段，对于低病毒含量HBV DNA的扩增效果并不理想，特异性不强，且其采用两次克隆步骤，增加了实验的复杂程度和成本预算。因此，建立一种灵敏度高、特异性强、简单方便的低病毒含量HBV全基因组克隆的方法，很有必要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种可对低病毒含量血清样本中的HBV进行全基因组克隆的有效方法。
本发明的技术方案是：
一种采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV DNA进行巢式PCR反应，然后分别对扩增出的HBV核心区至S区(即CS区)和前S区至X区(即pSX区)两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接，以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆；其特征为：
所述CS区为HBV基因组的nt 1821～nt 272，pSX区为nt 3194～nt 1825；且进行巢式PCR反应时所用特异性引物的序列如下：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3是CS区的外引物序列；
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4是pSX区的外引物序列；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7是CS区的内引物序列；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8是pSX的内引物序列。
调整巢式PCR时的内外引物的浓度，可提高反应的灵敏度，使其能够进行一管式巢式PCR扩增。最佳的引物浓度为：外引物终浓度为10nmol/L；内引物终浓度为200nmol/L。
所述酶切，是扩增两个片段后，将产物纯化后分别使用内切酶进行酶切；内切酶优选使用XbaI。
所述连接，是使用连接酶进行，优选使用T4DNA连接酶。
本方法还可采用以下一种或几种手段进行优化，可使发明效果更好或达到最佳：
在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8序列中加入BspQ I酶切位点，扩增全长以后便于从载体上获得完全不含外源序列的HBV全长基因组。
若在PCR反应体系中以1∶10混合加入Pfu DNA聚合酶和普通Taq DNA聚合酶，既能提高扩增的特异性，又可显著降低成本。便于在实验室开展。
所述用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR技术，可减少污染，提高产量；且只需经过一次克隆，简化了操作步骤。
本发明的有益效果是：
1、可对血清样本中低含量的HBV进行全基因组克隆，扩增的HBV基因组具有生物学活性；
2、不仅可获得全长HBV DNA，在体外还检测到较强的病毒复制力(见实施例2)；
3、操作方法简便可行。
附图说明：
图1是HBV DNA CS区的扩增结果1666bp；
图2是HBV DNA pSX区的扩增结果1846bp；
图3是两片段连接后HBV全基因组扩增结果3215bp；
具体实施方式：
以下所用的主要实验材料来源如下：
Pfu和Taq DNA聚合酶及病毒DNA提取试剂盒：为北京天恩泽基因科技有限公司产品。内切酶Xba I，T4 DNA连接酶：为NEB公司产品。
实施例1 HBV全基因组克隆
扩增引物设计：从GenBank中选取729条HBV全长基因组序列，其中中国人特有的B和C基因型序列209条，用NTI软件进行比对分析HBV CS区和pSX区保守区设计引物，全长引物参考文献设计，并加入酶切位点，有助于下一步的复制力的分析。
表1 PCR反应使用的引物序列
一.巢式PCR扩增HBV的CS区和pSX区
第一轮PCR反应(总体系25μL)
使用引物1和3扩增CS区片段长1948bp(体系如下)。当用相同体系扩增pSX区片段时(产物长1894bp)，使用引物2和4，替换引物1和3。
说明：
1、巢式PCR第一轮反应时，25μL标准反应体系中，外引物浓度配置成10μmol/L的储存液，用水稀释10倍后取0.25μL加入25μL反应体系中。
2、为提高反应特异性，体系中加入普通Taq DNA聚合酶(终浓度达到0.1U/μL)的同时按照10∶1的比例加入Pfu DNA聚合酶(终浓度达到0.01U/μL)。
3、第一轮PCR反应参数：
94℃5min预变性，
94℃45s，59℃50s，72℃100s 2个循环，
94℃45s，57℃50s，72℃100s 2个循环，
94℃45s，55℃50s，72℃100s 2个循环，
94℃45s，53℃50s，72℃100s 2个循环，
94℃45s，51℃50s，72℃100s 2个循环，
94℃45s，56℃50s，72℃100s 30个循环，
72℃5min，68℃5min最后降到4℃。
第二轮PCR反应(总体系50μL，包括25μL新配缓冲液和25μL模板)使用引物5和7扩增CS区片段长1666bp(体系如下)，当用相同体系扩增pSX区片段时(产物长1846bp)，使用引物6和8，替代引物5和7。
说明：
1、巢式PCR第一轮25μL产物全部作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR引物浓度配置成10μmol/L的储存液，取0.5μL加入50μL体系中，将配制好的二轮反应液直接加到第一管25μL反应液中，完成单管巢式PCR反应。
2、第二轮PCR反应参数：94℃3min预变性，94℃40s，55℃45s，72℃90s 35个循环，72℃5min，68℃5min最后降到4℃。
取3μLPCR终产物，用1％琼脂糖进行电泳。其余47μLPCR终产物纯化回收(按照Qiagen PCR产物纯化试剂盒说明书进行)。
二、HBV的CS区和pSX区的酶切纯化及连接
1.酶切体系如下：
说明：酶切条件：37℃过夜。为增加酶切效率，酶切前要纯化巢式PCR产物。酶切后产物要电泳，按照Qiagen胶回收试剂盒进行产物回收纯化。
2.连接体系如下：
说明：连接条件：4℃过夜。HBV的CS区和pSX区的巢式PCR产物都仅存在单一的XbaI酶切位点，所以二者可以定向连接为完整的HBV全基因组。
三、HBV全基因组扩增
反应体系：
说明
1、在全基因组扩增时，25μL标准反应体系中，引物浓度配置成10μmol/L的储存液，用水稀释5倍后取1μL加入25μL反应体系中。
2.反应参数：
94℃5min预变性；
94℃40s，60℃1min40s，72℃5min 10个循环；
94℃40s，60℃1min40s，72℃6min 10个循环；
94℃40s，60℃1min40s，72℃7min 15个循环；
72℃10min，最后降到4℃
四、PCR产物末端加A
反应体系：
说明：反应条件：72℃20min。由于LA Taq酶本身具有外切酶活性，为提高T-A克隆效率需对PCR产物进行纯化，以除去LA Taq酶对连接的影响。
五、连接
反应体系
说明：连接条件：4℃过夜。经过实验优化，DNA∶pGEM T-easy载体体积比为3∶1时连接效率较高。
六、转化
用20μL X-gal，100μL IPTG混匀涂板放入温箱备用。
取感受态细胞冰上放置5min，融解备用，5μL连接产物中加入25μL感受态细胞(冰上操作)，冰浴20min，42℃热击1min，冰浴2min后，加入500μL预热的SOC培养基，37℃130rpm/min培养1小时，1000g离心10min后200μL涂板，37℃培养过夜，挑选白色菌斑摇菌(LB液体培养基)测序分析。
七、结果 获得1条HBV全长基因组克隆序列，提交GenBank，Accession Number：GQ372968
实施例2 HBV全基因组的克隆及复制力分析
一、乙型肝炎病毒样本的获得
从慢性乙肝患者血清中提取得到HBV DNA。
慢性乙肝患者诊断标准：2000年西安病毒性肝炎诊断标准【中华医学会感染病和寄生虫病学会；中华肝脏病学会：病毒性肝炎诊断和治疗标准.中华肝脏病杂志2000；6：324-329.】。
按上述标准选择了3例慢性乙肝患者，采样时血清HBV DNA载量信息见表2：
表2 三例慢性乙肝患者血清HBV DNA载量
二、血清样本中提取的HBV全基因组克隆
1、按实施例1方法分别PCR扩增CS区和pSX区；
2、按实施例1方法HBV全长基因组克隆：具体步骤同实施例1。
3、1.0倍HBV基因组细胞转染：
1.酶切：因引物5和8合成时在5’端分别引入一个BspQ I酶切位点，Teasy载体上含有一个Sca I酶切位点，用BspQ I和Sca I(购于NEB公司)过夜酶切含有HBV全长基因组的T-easy载体，胶回收3.2kb的HBV序列，获得不含外源序列的完整HBV全长因组，紫外分光光度计测量其浓度。
2.转染：将HepG2细胞按1×105/孔分养到12孔板中，37℃，5％CO2培养24小时后让其充分贴壁，1×PBS洗2-3遍，加入无FBS(胎牛血清)的培养液，每孔加入1μg胶回收的质粒与2μL Fugene HD(购于Roche公司)，培养4-5小时后1×PBS洗2-3次，加入含FBS的DMEM完全培养液，37℃，5％CO2培养72小时后收获细胞。
4、ELISA(酶联免疫)方法检测培养上清分泌HBsAg：按照乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA检测试剂盒(购于北京科卫生物技术有限公司)说明书进行。
三、复制力分析
荧光定量PCR测定HBV基因组复制力：转染72小时后的HepG2细胞用0.5％NP-40冰上裂解20分钟，裂解液离心弃沉淀，加入20U DNase和10U RNase 37℃水浴过夜，加入蛋白酶K消化液37℃水浴消化4小时，加入等体积的苯酚和氯仿抽提HBV DNA，异丙醇和乙醇沉淀，最后溶解在30μL蒸馏水中，取3μL用HBV荧光定量(SYBGreen I)检测试剂盒(购于杭州博日科技有限公司)定量检测。
四、实验结论
1、本发明方法具有可行性，扩增的HBV基因组具有生物学活性。
不同HBV DNA载量乙型肝炎病毒全基因组的表面抗原分析：应用两片段法从3例低病毒载量患者血清得到的6条全长HBV基因组克隆分别转染HepG2细胞，收集上清酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原(见表3)，OD值介于0.13～0.58之间。提示：通过两片段法拼接的HBV全基因组，转染入肝细胞后可自行完成整个病毒生活周期，成功分泌表面抗原。
2、本发明方法不仅可获得全长HBV DNA，还具有较强的复制力
同HBV DNA载量的HBV全基因组的荧光定量PCR分析：裂解转染细胞，提取HBVDNA，进行荧光定量分析(见表3)。提示：通过两片段法拼接得到的HBV全基因组，HBV DNA复制力介于6.82×106～5.82×107拷贝/mL。
表3两片段法扩增得到的全序列克隆转染HepG2细胞72小时后培养上清乙肝表面抗原结果和细胞裂解液中HBV DNA定量结果
表中克隆编号是：6380-3是从患者1血清获得的HBV全长克隆；Z3-1和Z3-2是从患者2血清获得的2个HBV全长克隆，Z31-1、Z31-6和Z31-22是从患者3血清获得的3个HBV全长克隆。
Claims (5)
1.一种采用两片段连接法进行HBV全基因组克隆的方法，先将HBV的DNA进行巢式PCR反应，然后分别对扩增出的HBV CS区和pSX区两个片段进行酶切，并将两个酶切片段连接，以此连接产物为模板用PCR方法扩增该全基因组后进行克隆；其特征为：
所述CS区为HBV基因组的nt 1821～nt 272，pSX区为nt 3194～nt 1825；
且进行巢式PCR反应时所用特异性引物的序列如下：
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3是CS区的外引物序列；
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4是pSX区的外引物序列；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7是CS区的内引物序列；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8是pSX的内引物序列。
2.权利要求1所述的方法，在引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8序列中加入BspQ I酶切位点。
3.权利要求1或2所述的方法，所述连接，是使用T4 DNA连接酶进行。
4.权利要求1或2所述的方法，进行巢式PCR反应时，调整内外引物的浓度至：外引物终浓度为10nmol/L，内引物终浓度为200nmol/L。
5.权利要求1或2所述的方法，用PCR方法扩增出两个片段时，采用一管式巢式PCR方法。
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