CN104946794A - 一种hiv-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种hiv-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HIV-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括检测待测HIV-1基因组的基因型和耐药突变位点的成套引物；所述成套引物包括扩增引物对和测序引物组。通过实验证明：本发明的检测试剂盒保证了低频突变毒株的检测能力，极大地弥补了类似国外进口试剂盒存在的对中国HIV流行毒株扩增效率差、检出率低、低频突变检测率低的不足，并且具有操作简便快速、高效、经济、高通量等特点，不仅为HIV耐药检测试剂国产化打下了坚实基础，而且为国内大规模检测HIV病毒株耐药情况开拓了广阔的前景。

Description

一种HIV-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种HIV-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
自1981年美国首先发现艾滋病(AIDS)由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染引起以来，艾滋病已在全球迅速蔓延开来。据联合国艾滋病计划署和世界卫生组织联合发布的全球艾滋病流行情况的报道中显示：截止到2009年，全世界感染总人数3340万人，新增感染人数约为270万人，死亡人数200万人，210万年龄小于15岁的感染者，全世界每天有超过7400例新增感染者。而我国HIV感染人数每年以3％的速度增长，流行发展趋势严峻。根据卫生部2011年发布的中国艾滋病疫情估计报告显示，截止到2011年底，中国存活艾滋病病毒感染者和艾滋病病人(PLHIV)78万人。其中AIDS病人15.4万人。
20世纪90年代以来，抗艾滋病病毒药物有了突飞猛进的发展。自1987年第一个抗艾滋病毒药物齐多夫定上市以来，已发展到18个品种，目前向美国FDA申请的新药有100个之多。抗艾滋病病毒药物大致可以分为核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂及蛋白酶抑制剂三大类。随着高效抗逆转录病毒联合疗法(HAART)的开展，对于延长艾滋病感染者的寿命，提高生存质量起到了积极作用。在我国，自从2004年以来已有多个地区对艾滋病患者实施免费的高效抗逆转录病毒治疗，为我国艾滋病患者带来了福音。然而，HIV耐药病毒株的出现和传播给艾滋病的抗病毒治疗带来了极大的困难，已经成为影响艾滋病治疗效果的重要原因。对耐药性HIV毒株进行研究及检测，已经成为艾滋病临床治疗中非常重要的一个环节，对于减缓耐药株的产生及传播，以及指导患者个体化临床用药有着重要现实意义。
目前，HIV耐药检测主要有两种方法：表型耐药检测和基因型耐药检测。而基因型耐药检测最常用，也是最早用于HIV耐药检测的方法之一。基因型耐药检测主要是通过PCR扩增的方法对HIV基因组中与耐药相关的突变的进行检测，其中基于测序的方法对耐药突变位点进行分析的方法较为流行。HIV-1耐药位点的研究主要集中于Pol基因的蛋白酶基因区、逆转录酶基因区和整合酶基因区。其中，对于蛋白酶基因区和逆转录酶基因区的耐药位点研究较为深入，蛋白酶基因区对应蛋白酶抑制剂耐药位点(protease inhibitor resistance mutations,PIs)，逆转录酶基因区对应核苷类逆转录酶抑制剂耐药位点(nucleoside RT inhibitor resistance mutations,NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂耐药位点(non-nucleoside RT inhibitor resistance mutations,NNRTIs)。现有的基于测序的HIV基因型耐药检测体系主要有三大类，包括了雅培公司的ViroSeqTM HIV分型系统、Bayer公司的TRUGENETM HIV-1基因分析系统以及国内外一些大学或研究机构建立的In-house方法。这些检测方法的原理大致相同，主要方法是提取HIV核酸，通过单套或多套引物系统对病毒基因组中包含蛋白酶和部分逆转录酶的基因片段进行RT-PCR，对PCR产物进行测序分析。前两者已经出现商业化检测试剂盒，并被美国FDA批准上市，已经成功应用于HIV耐药检测相关临床研究。然而，这两种检测系统主要是针对欧美流行的B亚型病毒株进行建立的，对于中国主要流行的CRF01_AE亚型、B亚型、B′亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型以及其它流行重组型病毒株的耐药检测效果并不理想。此外，这两款商业化的耐药检测试剂盒价格昂贵，不利于在我国大规模临床应用。而国内一些研究机构自建的In-house方法，虽然对国内的HIV耐药检测起到了一定的作用，但是这些In-house方法操作繁琐，更重要的是操作过程和分析方法不统一，难以真正有效的用于大规模的临床检测。基于以上原因，研制开发一种适用于我国HIV耐药检测的方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物。
本发明提供的检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物6、序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成。
本发明提供的检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物由扩增引物对和测序引物组组成；
所述扩增引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；
或所述扩增引物对由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列8所示的引物8组成；
所述测序引物组由序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物6、序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成。
上述成套引物中，所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B′亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
所述耐药突变位点位于HIV-1基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
所述耐药突变位点为I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、L10I、L10V、L74V、V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、G190S、G190A、T69A/T或T69D/N。
本发明的另一个目的是提供一种检测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的试剂盒。
本发明提供的检测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的试剂盒为1)或2)：
1)包括上述成套引物；
2)包括RT-PCR扩增试剂A、RT-PCR扩增试剂B、RT-PCR扩增试剂C和测序扩增试剂组成；
所述RT-PCR扩增试剂A为2×Reaction Mix溶液；
所述RT-PCR扩增试剂B由上述成套引物中的引物1、上述成套引物中的引物2、dUTP和Dnase/Rnase-free ddH2O组成；
所述RT-PCR扩增试剂C由III RT/Platinum Taq Mix和AntarcticThermolabile UDG组成；
所述测序扩增试剂由测序扩增试剂1、测序扩增试剂2、测序扩增试剂3、测序扩增试剂4、测序扩增试剂5和测序扩增试剂6组成；
所述测序扩增试剂1是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物3组成；
所述测序扩增试剂2是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物4组成；
所述测序扩增试剂3是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物5组成；
所述测序扩增试剂4是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物6组成；
所述测序扩增试剂5是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物7组成；
所述测序扩增试剂6是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物8组成。
上述试剂盒中，所述引物1和所述引物2的物质的量相同；所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7和所述引物8的物质的量相同；
所述引物1或所述引物2与所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7或所述引物8的物质的量的比为5:3.2。
上述试剂盒还包括PCR扩增试剂D、PCR产物纯化试剂、测序产物纯化试剂1、测序产物纯化试剂2、阳性对照品和阴性对照品；
所述PCR扩增试剂D由上述成套引物中的引物3、上述成套引物中的引物8和Dnase/Rnase-free ddH2O组成；
所述PCR产物纯化试剂由热敏磷酸酶(Antarctic Phosphatase)、外切核酸酶Ⅰ(Exonuclease I)、热敏磷酸酶缓冲液和纯化水组成；
所述测序产物纯化试剂1由醋酸铵和纯化水组成；
所述测序产物纯化试剂2由纯化水组成；
所述阳性对照品为含有Pol基因的cRNA；所述cRNA的核苷酸序列为序列12；
所述阴性对照品为DNase/RNase-free ddH2O。
上述试剂盒中，所述PCR扩增试剂D中的引物3和引物8的物质的量相同。
上述试剂盒中，所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B′亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
所述耐药突变位点均位于HIV-1基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
所述耐药突变位点为I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、L10I、L10V、L74V、V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、G190S、G190A、T69A/T或T69D/N。
本发明还有一个目的是提供上述成套引物的用途。
本发明提供了上述成套引物在制备检测或辅助检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的产品中的应用。
本发明还有一个目的是提供上述试剂盒的用途。
本发明提供了上述试剂盒在制备检测或辅助检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的产品中的应用。
本发明最后一个目的是提供一种检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的方法。
本发明提供的检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的方法包括如下步骤：
1)用上述成套引物中引物1和引物2对待测HIV-1的基因组RNA进行一步法RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物；
2)用上述成套引物中的引物3、引物4、引物5、引物6、引物7和引物8分别对所述PCR扩增产物进行测序，得到6条原始测序结果；
3)将所述6条原始测序结果拼接后提交至本地耐药数据库，得到待测HIV-1基因组的基因型及耐药突变位点。
上述方法中，所述步骤1)中，若所述PCR扩增产物的产量达不到测序要求，可以所述PCR扩增产物为模板，采用上述引物3和引物8再次进行PCR扩增，得到第二轮PCR扩增产物。
上述方法中，所述本地耐药数据库由斯坦福大学HIV耐药数据库(HIVDB,http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra？action＝sequenceInput)、国际艾滋病协会数据库(IAS,http://www.iasusa.org)、法国国家艾滋病研究署数据库(ANRS,http://hivfrenchresistance.org/index.htm)和相关HIV耐药文献报道耐药数据组成。
上述方法中，所述待测HIV-1来源于离体的血浆或血清。
上述成套引物或试剂盒或方法中，所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B′亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
所述耐药突变位点均位于HIV-1基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
所述耐药突变位点为I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、L10I、L10V、L74V、V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、G190S、G190A、T69A/T或T69D/N。
上述成套引物或上述试剂盒或上述方法在鉴定HIV-1的耐药性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述I84V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第84位氨基酸由异亮氨酸(I)突变成缬氨酸(V)；
上述A62V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第62位氨基酸由丙氨酸(A)突变成缬氨酸(V)；
上述A71V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第71位氨基酸由丙氨酸(A)突变成缬氨酸(V)；
上述A71T耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第71位氨基酸由丙氨酸(A)突变成苏氨酸(T)；
上述K101E耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第101位氨基酸由赖氨酸(K)突变成谷氨酸(E)；
上述K101H耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第101位氨基酸由赖氨酸(K)突变成组氨酸(H)；
上述L10I耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第10位氨基酸由亮氨酸(L)突变成异亮氨酸(I)；
上述L10V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第10位氨基酸由亮氨酸(L)突变成缬氨酸(V)；
上述L74V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第74位氨基酸由亮氨酸(L)突变成缬氨酸(V)；
上述V75M耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第75位氨基酸由缬氨酸(V)突变成甲硫氨酸(M)；
上述V90I耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第90位氨基酸由缬氨酸(V)突变成异亮氨酸(I)；
上述V106M耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第106位氨基酸由缬氨酸(V)突变成甲硫氨酸(M)；
上述V106I耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第106位氨基酸由缬氨酸(V)突变成异亮氨酸(I)；
上述V179D耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第179位氨基酸由缬氨酸(V)突变成天冬门氨酸(D)；
上述V179E耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第179位氨基酸由缬氨酸(V)突变成谷氨酸(E)；
上述V179D/V(杂合突变)耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，部分HIV-1病毒株第179位氨基酸由缬氨酸(V)突变成天冬门氨酸(D)；
上述Q58E耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，第58位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变成谷氨酸(E)；
上述Q58E/Q(杂合突变)耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的蛋白酶基因区域中，部分HIV-1病毒株第58位氨基酸由谷氨酰胺(Q)突变成谷氨酸(E)；
上述F227F/L(杂合突变)耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，部分HIV-1病毒株第227位氨基酸由苯丙氨酸(F)突变成亮氨酸(L)；
上述M184V耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第184位氨基酸由甲硫氨酸(M)突变成缬氨酸(V)；
上述D67N耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第67位氨基酸由天冬门氨酸(D)突变成天冬门酰胺(N)；
上述G190S耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第190位氨基酸由甘氨酸(G)突变成丝氨酸(S)；
上述G190A耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，第190位氨基酸由甘氨酸(G)突变成丙氨酸(A)；
上述T69A/T(杂合突变)耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，部分HIV-1病毒株第69位氨基酸由苏氨酸(T)突变成丙氨酸(A)；
上述T69D/N(混合突变)耐药位点位于HIV-1基因组的Pol基因的逆转录酶基因区域中，部分HIV-1病毒株第69位氨基酸由苏氨酸(T)突变成天冬门氨酸(D)，部分HIV-1病毒株第69位氨基酸由苏氨酸(T)突变成天冬门酰胺(N)。
上述HIV-1基因组的Pol基因及Pol基因编码的氨基酸序列为现有技术中公开的任一例，一个具体例子如下：Pol基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示；所述Pol基因编码的氨基酸序列如序列表中序列11所示。
本发明针对中国HIV-1流行病毒株序列的保守性特点，设计了覆盖度广、特异性好、灵敏度高的扩增及测序引物，提供了一种基于sanger测序法的HIV-1耐药检测方法，同时也提供一种适用于国内HIV-1耐药检测试剂盒。本发明的检测试剂盒保证了低频突变毒株的检测能力，极大地弥补了类似国外进口试剂盒存在的对中国HIV流行毒株扩增效率差、检出率低、低频突变检测率低的不足，并且具有操作简便快速、高效、经济、高通量等特点，不仅为HIV耐药检测试剂国产化打下了坚实基础，而且为国内大规模检测HIV病毒株耐药情况开拓了广阔的前景。
附图说明
图1为临床样本RNA、阳性质控品及阴性质控品RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。其中，泳道1为试剂盒阳性质控品RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道2为临床样本RNA RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道3为试剂盒阴性质控品RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；M：marker。
图2为试剂盒阳性质控品扩增产物双脱氧末端终止法的测序结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、HIV-1的Pol基因区的扩增和测序引物
本发明从艾滋病毒数据库(http://www.hiv.lanl.gov/)下载世界范围内的HIV-1病毒全长基因组序列，利用合适的进化分析软件分别对世界范围、亚洲范围以及中国范围内的HIV-1病毒全长基因组序列进行进化分析，得到HIV-1不同亚型病毒的进化关系及趋势。根据进化关系选择流行度高、地理覆盖广的B、B’(泰国B)、CRF-01AE、CRF-07BC、CRF-08BC等13个亚型基因组全长序列，利用适当的核酸同源性分析软件对HIV-1的Pol基因区进行保守性分析，找出侯选的保守性高的区段(保守性大于98％)，进一步利用合适的引物设计软件设计选择扩增引物，要求引物的3’末端不存在变异。由于所设计的扩增引物和测序引物是针对流行度高、地理覆盖广的HIV-1病毒亚型选择设计的，能够保证较高的扩增成功率以及测序反应成功率，对中国范围内的HIV-1主要亚型CRF01AE亚型、B亚型、B′亚型、CRF07BC亚型、CRF08BC亚型、C亚型有较高的检出率。
1、HIV-1的扩增引物
引物1(正向引物)：5-GCAGAGCAGACCAGAGCCAACAG-3’(序列表中的序列1)；
引物2(反向引物)：5-GCCTCTGTTAATTGTTTTACATCATTAG-3’(序列表中的序列2)；
引物3：5’-CCTCAAGTCACTCTTTGGCA-3’(序列表中的序列3)；
引物8：5’-GCTATTAAGTCTTTTGATGGGTC-3’(序列表中的序列8)。
2、HIV-1的测序引物
引物3：5’-CCTCAAGTCACTCTTTGGCA-3’(序列表中的序列3)；
引物4：5’-TAAAATTAAAGCCAGGAATGGATG-3’(序列表中的序列4)；
引物5：5’-GGATTTTCAGGCCCAATTTTTG-3’(序列表中的序列5)；
引物6：5’-GGAAGTATACTGCATTTACCATACCTAG-3’(序列表中的序列6)；
引物7：5’-GTGATCCTTTCCATCCCTGTG-3’(序列表中的序列7)；
引物8：5’-GCTATTAAGTCTTTTGATGGGTC-3’(序列表中的序列8)。
实施例2、HIV-1基因型耐药的检测试剂盒及其检测方法
本发明的试剂盒包括RT-PCR扩增试剂A、含有实施例1中的引物1和引物2的RT-PCR扩增试剂B、RT-PCR扩增试剂C、含有实施例1中的引物3和引物8的PCR扩增试剂D、含有实施例1中的引物3-引物8的测序扩增试剂1-6。该试剂盒的检测方法具体如下：
一、RNA的提取
从待测HIV-1病人血清或血浆(来源于中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所，患者知情，经过临床诊断，含有耐药位点I84V、A71V和K101E)中提取HIV-1中的RNA，具体步骤如下：
1、向干净的1.5mL离心管中加入20μL蛋白酶K；
2、向离心管中加入200μL患者血浆样品；
3、向样本中加入400μL的Carrier RNA工作液(为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按400μL缓冲液GB加入6μL Carrier RNA的比例进行配制)盖上管盖，涡旋振荡10s混匀；
4、在56℃或室温孵育10min，简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；
5、向离心管中加入400μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡10s，彻底混匀；
6、加入15μL磁珠悬浮液G，盖上管盖并涡旋振荡10s，彻底混匀，室温(15–25℃)放置5min；
7、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
8、将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液GD，涡旋混匀；
9、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
10、将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液RW，涡旋混匀；
11、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心去除液体；
12、重复步骤10和11一次；
13、离心管于磁力架上，室温晾干5-10min；
14、将离心管从磁力架上取下，加入50-100μL RNase-free ddH2O，涡旋混匀，室温孵育10min；
15、将离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液(样品RNA)转移至新的离心管中，并于适当条件保存或者直接用于下一步扩增。
二、逆转录及RT-PCR、产物纯化
1、逆转录及RT-PCR
本发明采用一步法RT-PCR反应体系完成逆转录及RT-PCR。
以步骤一获得的RNA为模板，用引物1和引物2进行RT-PCR，得到PCR扩增产物。
一步法RT-PCR反应体系如表1所示，一步法RT-PCR反应条件如表2所示。加入4μL阴性对照品及阳性对照品；阳性对照品为含有HIV-1基因组中Pol基因片段的cRNA(cRNA的核苷酸序列如序列12所示)，Pol基因片段上包含M46I、K103N和T215Y三个耐药突变位点，浓度为1×105cp/ml。整个加样过程在冰上操作，加入模板后混匀简短离心，置于PCR反应仪中。
RT-PCR扩增试剂A为2×Reaction Mix(英维捷基(上海)贸易有限公司，货号：12574026)；
RT-PCR扩增试剂B由用于RT-PCR扩增的正向引物和反向引物、dUTP(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，货号：R0133)、DNase/RNase-free ddH2O(天根生化科技有限公司，货号：RT121-02)组成。RT-PCR扩增的正向引物和反向引物分别为实施例1中的引物1和引物2，浓度均为0.2μmol/人份；dUTP浓度为0.25mmol/L。其中，引物2既作为逆转录反应的特异引物，同时又作为RT-PCR反应中的下游引物。
RT-PCR扩增试剂C为由III RT/Platinum Taq Mix(英维捷基(上海)贸易有限公司，货号：12574026)和Antarctic Thermolabile UDG(NEB(北京)有限公司，货号：M0372S)组成。
表1、RT-PCR反应体系
RT-PCR扩增试剂A 12.5μL
RT-PCR扩增试剂B 7.5μL
RT-PCR扩增试剂C 1μL
模板RNA 4μL
表2、RT-PCR反应条件
扩增完成后，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2、第二轮PCR扩增(备选)
如第一轮RT-PCR产物经凝胶电泳鉴定有明显目的条带，且扩增产物产量达到测序要求时，则进行如下步骤3的纯化及稀释；
如第一轮RT-PCR产物经凝胶电泳鉴定无明显目的条带(或扩增产物产量达不到测序要求时)，则以步骤1得到的PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增反应体系如表3所示；PCR反应条件如表4所示。整个加样过程在冰上操作，加入模板后混匀短暂离心，置于PCR反应仪中。
PCR扩增试剂D由引物3、引物8和DNase/RNase-free ddH2O组成。引物3和引物8的浓度均为0.4μmol/人份。
表3、第二轮PCR反应液MIX配制表
RT-PCR扩增试剂A 12.5μL
RT-PCR扩增试剂C 1μL
PCR扩增试剂D 9.5μL
第一轮RT-PCR产物 2μL
表4、PCR反应热循环程序
3、PCR产物的纯化及稀释
取5μL PCR产物纯化试剂和15μL的PCR扩增产物置于新的0.2mL离心管中，PCR产物纯化试剂由热敏磷酸酶(Antarctic Phosphatase)(NEB(北京)有限公司，货号：M0289S)、外切核酸酶Ⅰ(Exonuclease I)(NEB(北京)有限公司，货号：M0293V)、热敏磷酸酶缓冲液(NEB(北京)有限公司，货号：M0289S)和纯化水组成，移液器吸打混匀后短暂离心，置于PCR仪中进行反应。得到纯化后的PCR产物。反应程序如表5所示：
表5、PCR产物纯化程序
温度(℃) 37 18
时间(min) 20 20
循环数 1 1
取5μL纯化后的PCR产物在含2×GelRed染料的1％的琼脂糖凝胶电泳，检验产物浓度和纯度。电泳结果如图1所示，其中，泳道1为试剂盒阳性对照品的RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道2为待测临床样本RNA的RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果；泳道3为试剂盒阴性对照品的RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，可以看出，待测临床样本RNA的RT-PCR扩增产物的条带大小和试剂盒阳性对照品的RT-PCR扩增产物的条带大小相同，说明待测临床样本RNA的RT-PCR扩增产物是正确的。
三、双脱氧末端终止法测序
1、双脱氧末端终止法测序
以步骤二获得的纯化后的PCR扩增产物为模板，用分别含有引物3-引物8的6种测序扩增试剂进行双脱氧末端终止法测序反应，得到6种测序反应产物。
每个测序反应体系如表6所示，每个测序反应条件如表7所示。整个加样过程在冰上操作，加入模板后混匀简短离心，置于PCR反应仪中。
表6、测序反应体系
表7、测序反应条件
上述6种测序扩增试剂分别命名为测序扩增试剂1，测序扩增试剂2，测序扩增试剂3，测序扩增试剂4，测序扩增试剂5和测序扩增试剂6；
命名为测序扩增试剂1的测序扩增试剂由引物3和Terminator v3.1Ready Reaction Mix(英维捷基(上海)贸易有限公司，货号：4337455)、缓冲液、纯化水组成；
命名为测序扩增试剂2的测序扩增试剂由引物4和Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水组成；
命名为测序扩增试剂3的测序扩增试剂由引物5和Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水组成；
命名为测序扩增试剂4的测序扩增试剂由引物6和Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水组成；
命名为测序扩增试剂4的测序扩增试剂由引物7和Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水组成；
命名为测序扩增试剂6的测序扩增试剂由引物8和Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水组成；
其中，测序引物的浓度均为3.2pmol/反应。
2、测序反应产物纯化
96孔板纯化方法：
(1)每孔内加入测序产物纯化试剂1(测序产物纯化试剂1由醋酸铵和纯化水组成)33μL，排枪吸打混匀，-20℃避光静置5分钟，2000g以上4℃离心30分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。
(2)加入70μL测序产物纯化试剂2(纯化水)，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，2000g以上4℃离心5分钟。倒置96孔板于吸水纸上，100g短暂离心。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。
(3)将96孔板放入真空抽干浓缩仪60℃抽干10分钟(或者在室温风干20分钟以上)，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
(4)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。
单个0.2mL离心管纯化方法：
(1)离心管内加入测序产物纯化试剂133μL，移液器吸打混匀，-20℃避光静置5分钟，2000g以上4℃离心半小时，吸弃上层液体。
(2)加入70μL测序产物纯化试剂2，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，2000g以上4℃离心5分钟，吸弃上层液体。
(3)将离心管放入真空抽干浓缩仪60℃抽干10分钟(或者在室温风干20分钟以上)，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
(4)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。
上机电泳(电压为1500V)，得到6条测序原始序列。试剂盒阳性质控品扩增产物双脱氧末端终止法的测序结果如图2所示。
四、HIV基因型耐药分析
1、测序原始序列的拼接
借助测序序列分析软件及序列拼接软件，对6条测序原始序列进行质量分析，去除测序质量差的序列并进行拼接，得到的待测样品的HIV基因组的Pol基因的核苷酸序列为序列9。
2、序列分析
将经上述步骤1拼接好的序列1提交至本地耐药数据库进行基因型和耐药分型分析。
基因型和耐药分型结果如表8所示。待测样品中HIV含有I84V、A71V、K101E三个耐药位点。
表8、基因型和耐药分型结果
实施例3、HIV-1基因型耐药的检测试剂盒的应用
收集50例已知基因型和耐药位点的HIV-1感染者的血浆样本(中国医科大学附属第一医院，患者知情，经过临床诊断，50例临床样本的基因型和耐药位点的检测结果如表9所示)，用实施例2中的HIV-1基因型耐药的检测试剂盒及其检测方法对50例HIV-1感染者血浆样本的基因型和耐药位点的进行检测。
50例临床样本基因型耐药检测结果如表9所示：50例临床样本中，蛋白酶基因区存在耐药位点的样本比例为22％(11/50)；逆转录酶基因区存在耐药位点的样本比例为24％(12/50)，与临床诊断结果一致，说明本发明的HIV-1基因型耐药的检测试剂盒及其检测方法可以准确、有效的对待测样本的HIV-1基因型和耐药位点进行检测。
表9、50例临床样本基因型和耐药位点的检测结果

Claims (9)

1.一种检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物，由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物6、序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成。
2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：
所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B'亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
所述耐药突变位点位于HIV-1基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子。
3.一种检测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的试剂盒，为1)或2)：
1)包括权利要求1或2所述的成套引物；
2)包括RT-PCR扩增试剂B和测序扩增试剂；
所述RT-PCR扩增试剂B由上述成套引物中的引物1、上述成套引物中的引物2、dUTP和Dnase/Rnase-free ddH2O组成；
所述测序扩增试剂由测序扩增试剂1、测序扩增试剂2、测序扩增试剂3、测序扩增试剂4、测序扩增试剂5和测序扩增试剂6组成；
所述测序扩增试剂1是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物3组成；
所述测序扩增试剂2是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物4组成；
所述测序扩增试剂3是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物5组成；
所述测序扩增试剂4是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物6组成；
所述测序扩增试剂5是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物7组成；
所述测序扩增试剂6是由Terminator v3.1Ready Reaction Mix、缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物8组成。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物1和所述引物2的摩尔量相同；所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7和所述引物8的摩尔量相同；
所述引物1或所述引物2与所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述引物7或所述引物8的摩尔量的比为5:3.2。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR扩增试剂D，所述PCR扩增试剂D由上述成套引物中的引物3、上述成套引物中的引物8和Dnase/Rnase-free ddH2O组成。
6.根据权利要求3-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照品；所述阳性对照品为含有Pol基因的cRNA；所述cRNA的核苷酸序列为序列12。
7.根据权利要求3-6中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B'亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型；
所述耐药突变位点均位于HIV-1基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子。
8.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-7中任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的产品中的应用。
9.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3-7中任一所述的试剂盒在鉴定HIV-1的耐药性中的应用。
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