CN107619854B - 检测hiv-1耐药突变位点的成套引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因检测领域，提供了一种检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物，包括序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。本发明还提供了上述检测HIV‑1耐药突变位点的成套引物的应用。本发明可以只需一轮PCR反应即可扩增出大于1000拷贝每毫升的HIV‑1 pol区基因序列，减少了工作强度，降低了污染的机率，同时扩增出的片段覆盖的耐药突变位点的范围广泛，适用于我国主要HIV‑1流行亚型的耐药突变位点检测。

Description

检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，特别涉及一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用。

背景技术

艾滋病(AIDS)最早在美国同性恋人群中发现，1981年加州大学洛杉矶分校的Michelael D.Gottlieb医生发现了这种奇怪的免疫缺陷现象。在之后1983年，法国巴斯德研究院最终确认了这种疾病的元凶是人类免疫缺陷病毒(HIV)。在之后的30多年里，艾滋病在全球迅速蔓延，据世界卫生组织的数据：艾滋病毒迄今已造成3500多万例死亡。到2015年底，约有3670万(3400-3980万)名艾滋病毒携带者。2015年，全球有约210万(180-240万)人新感染艾滋病毒。中国自1985年发现第一例HIV感染病例以来，感染人数每年增长，流行发展的趋势严峻。根据中国疾病预防控制中心的数据，截至2016年9月，我国报告现存活艾滋病病毒感染者和病人65.4万例，累计死亡20.1万例。

人类免疫缺陷病毒(HIV)具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分为HIV-1型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-1型。HIV-1又进一步分为3个组：M组、O组和N组。M组内又可分为A-D，F-H和J、K共9个基因亚型，另外还有88个以上流行重组型(CRF)。2006－2007年第三次全国HIV-1分子流行病学调查结果显示，我国存在至少12种HIV-1基因型，已经成为全球HIV-1基因亚型最多的国家。我国HIV-1流行的亚型主要有CRF07_BC(35.5％)、CRF01_AE(27.6％)、CRF08_BC(20.1％)和B’(9.6％)，占HIV感染者总数的92.8％。

自从1987年第一个抗艾滋病药物齐多夫定(AZT)上市以来，抗艾滋病药物的研究突飞猛进，目前美国FDA网站上公布的抗艾滋病药物主要有6大类、35个品种。抗艾滋病药物主要包括核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、CCR5拮抗剂、整合酶抑制剂。我国自2003年以来实行“四免一关怀”政策，对艾滋病患者开展广泛的抗病毒治疗，截止2016年底，进行抗病毒治疗的人数已经达到48.9万。然而由于HIV病毒容易产生变异，并最终造成蛋白位点发生变化，使艾滋病药物失去靶点，在病人体内产生耐药，造成治疗失败。为了提高治疗的效果，防止耐药株的传播，因此有必要对治疗人群及新发感染者进行耐药的检测。这对于减缓耐药病毒株的产生及传播，以及指导患者个体化临床用药有着重要的意义。

目前HIV-1耐药的检测有两种类型，一种是表型检测，另外一种是基因型检测。表型检测是利用细胞培养的方法进行病毒培养，然后通过不同药物与病毒共培养，观察计算抑制的效率，得出病毒是否耐药的结果。但是此方法成本高昂，对实验室和人员的要求较高，难以对多个耐药突变进行评估，耗时长，劳动量大，对混合型检测灵敏度低，所以目前只限于基础研究使用。

基因型检测是采用PCR扩增测序的方法，对耐药突变位点进行分析，最终得出耐药报告。基因型检测依赖于表型检测的数据，对HIV的基因序列进行分析。它同时检测多种耐药突变，也可以检测出潜在突变点，可以预测多个耐药突变造成的影响，检测的速度快，成本低。是目前在实验室使用最为广泛的检测方法。

HIV-1耐药位点的研究主要集中在HIV-1pol基因，这里聚集着蛋白酶基因，逆转录酶基因以及整合酶基因。这段区域也是核苷类反转录酶抑制剂、非核苷类反转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂四大类HIV-1药物的靶向区域。根据我国《国家免费艾滋病抗病毒药物治疗手册》(第四版)的建议，对于接受抗病毒治疗的患者，在正常服药的情况下，在病毒载量>1000拷贝每毫升(copy/mL)的情况下，需要进行耐药检测。

目前国内的基因型耐药检测方法主要分三种，一是雅培ViroSeq^TM HIV-1基因分型系统、达安基因人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)耐药基因型检测试剂盒(PCR-测序法)、国内外大学建立的in-house方法。这三种耐药检测的方法流程大致相同，主要过程是提取HIV-1核酸，通过一轮或者两轮PCR对HIV-1病毒基因组中蛋白酶和部分逆转录酶的基因片段进行RT-PCR，然后再使用Sanger法对PCR产物进行测序分析。前两者出现的商业化检测试剂盒，已经取得中国食品药品监督管理局批准上市。这些建立的in-house方法因为价格便宜也应用广泛，取得了很多的临床研究工作。

然而，目前上市的这两种检测系统主要是为欧美的B亚型株来设计，对中国的主要流行病毒株CRF01_AE亚型、CRF07_BC重组型，B’亚型，CRF08_BC重组型等效果并不理想。而且这些试剂盒价格昂贵，不利于在我国大规模使用。而国内外研究机构建立的in-house方法操作繁琐，操作过程、质量控制和分析方法不统一，难以大规模临床使用；且大多采用两轮PCR进行扩增，容易造成PCR产物的污染。例如，雅培ViroSeq^TM HIV-1基因分型系统不仅操作繁琐，且检测范围是2,000-750,000拷贝每毫升，而达安和实验室自建的in-house方法都是通过两轮PCR的方法来得到测序的模板，操作复杂且容易污染。

就扩增区域而言，达安基因的MAW26/RT21扩增片段的范围为HIV-1基因组的2147-3462区间，覆盖的位点包括蛋白酶基因和逆转录基因1-304氨基酸编码子位置；美国CDC的扩增片段的范围为HIV-1基因组的2243-3326区间，覆盖的位点包括蛋白酶基因和逆转录基因1-259氨基酸编码子位置；雅培的ViroSeq^TM HIV-1基因分型系统的扩增片段的范围为HIV基因组的1832-3577区间，也只是覆盖了蛋白酶基因的全长和逆转录酶的1-335位氨基酸编码子区域。上述方法均只能扩增HIV-1基因组的pol基因的部分耐药突变位点，不能覆盖所有的耐药突变位点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用。

本发明的第一个方面提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，所述成套引物含有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列：

SEQ ID No.1：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；(以下称引物1)；

SEQ ID No.2：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；(以下称引物2)；

SEQ ID No.3：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物3)；

SEQ ID No.4：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物4)；

SEQ ID No.5：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT；(以下称引物5)。

根据本发明第一方面的成套引物，所述成套引物用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段，所述基因片段包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸的编码子和逆转录酶基因区1-410位氨基酸的编码子。

根据本发明第一方面的成套引物，所述耐药突变位点为位于HIV-1基因组的Pol基因的核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside RT inhibitor resistance mutations,NRTI)相关位点、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside RT inhibitor resistancemutations,NNRTIs)相关位点和蛋白酶抑制剂(protease inhibitor resistancemutations,PI)相关位点。

所述HIV-1基因组的Pol基因的核苷类逆转录酶抑制剂相关位点、非核苷类逆转录酶抑制剂相关位点和蛋白酶抑制剂相关位点公布于斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库(https://hivdb.stanford.edu/)中。

本发明的第二个方面提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括根据本发明的第一个方面的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物。

根据本发明的第二个方面的试剂盒，所述成套引物的量为：引物1和引物2的总摩尔数(即，物质的量，单位：mol或摩尔)与引物3、引物4和引物5的总摩尔数为的比例为1:(1-2)，优选为1:(1.2-1.8)，进一步优选为1:1.5。

对引物1和引物2之间的用量关系可以不用具体限定。优选地，引物1和引物2的摩尔数比为1:1。对引物3、引物4和引物5之间的用量关系可以不用具体限定。优选地，引物3、引物4和引物5的摩尔数比为1:1:1。

根据本发明的第二个方面的试剂盒，所述试剂盒中还含有RT-PCR扩增试剂。

所述RT-PCR扩增试剂可以商购获得，例如可以为购自Takara公司的one-step 2.0RT-PCR Kit扩增试剂盒，货号为RR055A。

本发明的第三个方面提供了根据本发明的第一个方面的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，或者根据本发明的第二个方面的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒在制备检测或者辅助检测HIV-1耐药突变位点的制剂中的应用。

本发明的第四个方面提供了根据本发明的第一个方面的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，或者根据本发明的第二个方面的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，或者根据本发明的第三个方面的检测或者辅助检测HIV-1耐药突变位点的制剂在检测或者辅助检测HIV-1耐药突变位点中的应用。

本发明的第五个方面提供了一种检测HIV-1耐药突变位点的方法，所述方法包括：

使用根据本发明的第一个方面的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，或者根据本发明的第二个方面的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，或者根据本发明的第三个方面的检测或者辅助检测HIV-1耐药突变位点的制剂中的引物1、引物2、引物3、引物4和引物5对待测HIV-1的基因组RNA进行一步法RT-PCR扩增，得到PCR扩增产物；

然后对上述PCR扩增产物进行测序，获得上述PCR扩增产物的原始测序结果；

将上述原始测序结果拼接后提交给上述的斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，得到HIV-1基因组的耐药突变位点。

本发明的成套引物是针对中国的HIV-1流行株的保守序列，设计出的范围广，特异性优异的扩增序列。使用本发明的成套引物可以一步法扩增出大于1000拷贝每毫升的HIV-1pol区基因序列，满足了中国HIV-1耐药检测的市场需求，让1000拷贝每毫升的样本得以简单扩增；在面临HIV-1高度变异的亚型方面，可以保证中国国内HIV-1流行株的有效扩增，从而为HIV-1耐药检测试剂的国产化，以及目前的分子流行病学监测提供简单、有效、经济的解决方案。

使用本发明的成套引物在操作上只需要使用一轮PCR扩增即可得到测序的模板，减少了工作强度，降低了污染的机率；同时，扩增出的产物的范围覆盖了HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域，而HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域包含目前在斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库中蛋白酶与逆转录酶区域所有的耐药相关位点，因此，使用本发明的成套引物可以一次性、准确、快速、经济的获得我国HIV-1流行株的耐药突变位点信息。

本发明的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。

附图说明

图1是本发明实施例2的电泳检测结果图。图1中，“M”代表DNA Marker，从上到下的三条带依次为2000bp、1200bp和800bp；NC代表阴性对照，PC代表阳性对照。

图2是本发明实施例3的电泳检测结果图。图2中，“M”代表DNA Marker，从上到下的三条带依次为2000bp、1200bp和800bp；数字1-20依次代表表2中的编号为1-20的样本的电泳检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下述具体实施方式中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用来说明用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段的扩增引物。

本实施例从艾滋病序列数据库(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html)中下载全球范围内的HIV-1病毒全长基因组序列，利用序列分析软件，参考2016HIV-1序列大纲选取pol基因上下游的基因序列。根据2013-5-17中国食品药品监督管理局颁布的《人类免疫缺陷病毒检测试剂临床研究注册技术审查指导原则》，重点选择中国境内流行的HIV主要为M组HIV-1(目前境内尚未见N组和O组HIV-1的报道，HIV-2感染病例的报道极少)，其基因型主要为B/B’、BC重组型(包括CRF 07_BC重组型和CRF 08_BC重组型)以及AE重组型(CRF 01_AE重组型)，选择其中保守位置的片段来进行引物设计。理论推测该引物组合可以成功扩增出HIV-1的主要亚型A亚型、B亚型、C亚型、D亚型、01AE重组型、02AG重组型、07BC重组型和08BC重组型。

设计出来的HIV-1的Pol基因区的扩增引物如下：

引物1(SEQ ID No.1)：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；

引物2(SEQ ID No.2)：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；

引物3(SEQ ID No.3)：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；

引物4(SEQ ID No.4)：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；

引物5(SEQ ID No.5)：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT。

其中，引物1和引物2为正向引物，引物3、引物4和引物5为反向引物。

实施例2

本实施例用来说明HIV-1的Pol基因区的扩增及耐药突变位点的检测。

一、RNA的提取

采用Qiagen离心柱法病毒RNA提取试剂盒(购自凯杰企业管理(上海)有限公司，货号52904)从HIV-1病人的血清或者血浆中来提取HIV-1的RNA，具体步骤如下：

1、取一支离心管，加入560μL的裂解缓冲液；

2、加入140μL血浆，振荡混匀15秒；

3、室温孵育10分钟；

4、短暂离心，将离心管壁的液体收集到底部；

5、加入560μL无水乙醇，振荡混匀15秒；之后短暂离心将液体收集到离心管底部；

6、小心吸出630μL步骤5的溶液加入到QIAamp小离心柱上，盖上盖子，6000g离心1分钟，将小离心柱放至一个清洁的2mL收集管上，将之前的收集管丢弃；

7、小心打开QIAamp小离心柱，重复步骤6；

8、小心打开QIAamp小离心柱，加入500μL洗液1，盖上管盖，6000g离心1分钟，将小离心柱放至一个清洁的2mL收集管上，将之前的收集管丢弃；

9、小心打开QIAamp小离心柱，加入500μL洗液2，盖上管盖，20000g离心3分钟，将小离心柱放至一个清洁的2mL收集管上，将之前的收集管丢弃；

10、将QIAamp小离心柱放置在一个1.5mL的离心管上，将之前的废液收集管丢弃。小心打开小离心柱并将60μL洗脱缓冲液加入，盖上管盖，室温静置1分钟，6000g离心1分钟。

二、RT-PCR扩增

本发明采用一步法RT-PCR反应体系完成逆转录及PCR过程。

以步骤一提取的RNA为模板，使用引物1、引物2、引物3、引物4和引物5进行RT-PCR，得到PCR产物。

RT-PCR反应体系：

PCR Mix 30μL

模板RNA 20μL

AMV-Optimized Taq 1μL

其中，PCR Mix中含有反应用Buffer，dNTP(终浓度为400μM)，引物1、引物2、引物3、引物4和引物5组成的引物组合(引物组合的终浓度为0.2μmol/L，其中，引物1和引物2的摩尔比为1:1，引物3、引物4和引物5之间的摩尔比为1:1:1，引物1和引物2的总量与引物3、引物4和引物5的总量的摩尔比为1:5)。模板RNA的浓度参见表1(位于869-13469拷贝每毫升的范围内)。AMV-Optimized Taq可以为购自宝日医生物工程有限公司公司货号为RR055A的商品。

阳性对照(Positive Control阳性对照)为HIV-1 8E5阳性对照品，通过在HIV RNA阴性人血浆中稀释培养HIV-1B型病毒(8E5)来制备，血浆经美国FDA批准的检验法检验，结果为对HIV-1/2、HCV、HTLV-1和HBsAg无抗体反应性性。8E5病毒含完整但具有缺陷的病毒基因组。在RT基因密码子219上存在单个碱基插入24。病毒载量为50,000-100,000拷贝每毫升，该阳性对照可以购自雅培贸易有限公司，货号4J94-91。

阴性对照(Negative Control阴性对照)为无核酸酶水。

配制RT-PCR反应体系的整个加样过程在冰盒上操作，加入模板后振荡混匀，短暂离心，然后将样本置于PCR仪中，按照如下的RT-PCR反应程序进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应程序：

首先，42℃30min，即RT(reverse transcription反转录)步骤，此步骤速度为1kb/3min；

然后，93℃12min，使得RTase失活；

接着，(93℃20s、60℃40s、68℃2min)进行45个循环；

然后，72℃10min；

最后，12℃保存。

三、电泳检测

使用1×TAE溶液，配成1.5％的琼脂糖凝胶。将电泳仪电压设量为10v/cm，恒压电泳，20分钟左右观察结果。

结果如图1所示。其中，图1中的标号说明如表1所示。图1中，“M”代表DNA Marker，从上到下的三条带依次为2000bp、1200bp和800bp；NC代表阴性对照，PC代表阳性对照。

表1：图1的标号说明和样本载量表

根据图1所示的结果可以看出，本实施例的样本1-9均可以扩增出2000bp左右的DNA条带。说明本实施例通过采用实施例1的成套引物可以扩增出目的条带；尤其是当病毒载量在1000拷贝每毫升附近(例如样本7为869拷贝每毫升、样本9为1133拷贝每毫升、样本3为1182拷贝每毫升、样本6为1539拷贝每毫升、样本8为1614拷贝每毫升、样本4为1716拷贝每毫升)时，依然能有效的扩增出目的条带。这相比雅培ViroSeq^TM HIV-1基因分型系统的2000-750000拷贝每毫升的检测范围，适用性更广泛，充分满足了扩增靶区域的临床需求。

将样本1-9扩增出的2000bp左右的DNA条带进行sanger法测序，得知该片段为1977bp(如序列表中SEQ ID No.6所示的序列)，经过与HIV-1的序列进行比对可知，该片段为HIV-1基因组的1822-3798之间的序列，而该区域完全覆盖了HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域，说明本实施例通过采用实施例1的成套引物完全可以从病毒载量1000拷贝每毫升左右的病毒载量(copy/mL)的样本中扩增出HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域，从而可以进一步通过与斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，以进一步获得较为全面的HIV-1的耐药突变位点信息。

实施例3：

本实施例用来说明本发明的用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段的扩增引物对于不同亚型的扩增检测情况。

从20例(参见表2)不同亚型的样本中提取HIV-1病毒的RNA，检查不同亚型的扩增情况和耐药突变位点信息。

HIV-1病毒的RNA提取和RT-PCR扩增方法如实施例2所示，在此不再赘述。

经过电泳检测(方法参见实施例2)后发现，样本1-20均可以扩增出2000bp左右的DNA条带，将扩增获得的片段经sanger法测序后发现序列长度为1977bp，经过与HIV-1的序列进行比对可知，所有片段均为HIV-1基因组的1822-3798之间的序列，该区域完全覆盖了HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域。将所有的片段均分别提交斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，得到HIV-1的耐药突变位点信息，结果参见表2。

表2：不同亚型的样本检测结果

根据表2所示的结果可以发现，本实施例可以覆盖中国的主要HIV-1病毒亚型，可以让1000拷贝每毫升左右的病毒载量的样本用非常简单的操作扩增出来，并均可以扩增出完全覆盖HIV-1蛋白酶全长和逆转录酶的1-410区域的片段，从而可以进一步通过与斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库进行比对，以进一步获得较为全面的HIV-1的耐药突变位点信息。

综上可见，本发明的上述实施例提供的HIV-1病毒pol区基因扩增引物，不仅覆盖了斯坦福大学艾滋病毒耐药性数据库中蛋白酶和逆转录酶所有耐药位点，而且充分考虑的中国的病毒亚型特征，针对中国重要的流行病毒株CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和B’设计扩增位点，在一系列的实验中表现出了优异的扩增能力。除此之外，我们还考虑到扩增靶区域的临床需求，在1000拷贝每毫升的样本检测中，该成套引物扩增效果也非常好。经过上述的系列验证，该组引物具备下步进行临床试剂开发和病毒基因进化分析的价值。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 北京安普生化科技有限公司

<120> 检测HIV-1耐药突变位点的成套引物及其应用

<160> 7

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 1

gaaatgatga cagcatgtca gggag 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 2

gaaatgatga cagcatgcca gggag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 3

caaactccca ctcaggaatc caggt 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 4

caaactccca ttcaggaatc caggt 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> 5

caaattccca ctcaggaatc caggt 25

<210> 6

<211> 1977

<212> DNA

<213> HIV-1 HXB2

<220>

<400> 6

gaaatgatga cagcatgtca gggagtagga ggacccggcc ataaggcaag agttttggct 60

gaagcaatga gccaagtaac aaattcagct accataatga tgcagagagg caattttagg 120

aaccaaagaa agattgttaa gtgtttcaat tgtggcaaag aagggcacac agccagaaat 180

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gagaacttaa taagagaact caagacttct gggaagttca attaggaata ccacatcccg 1020

cagggttaaa aaagaaaaaa tcagtaacag tactggatgt gggtgatgca tatttttcag 1080

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caatattcca aagtagcatg acaaaaatct tagagccttt tagaaaacaa aatccagaca 1260

tagttatcta tcaatacatg gatgatttgt atgtaggatc tgacttagaa atagggcagc 1320

atagaacaaa aatagaggag ctgagacaac atctgttgag gtggggactt accacaccag 1380

acaaaaaaca tcagaaagaa cctccattcc tttggatggg ttatgaactc catcctgata 1440

aatggacagt acagcctata gtgctgccag aaaaagacag ctggactgtc aatgacatac 1500

agaagttagt ggggaaattg aattgggcaa gtcagattta cccagggatt aaagtaaggc 1560

aattatgtaa actccttaga ggaaccaaag cactaacaga agtaatacca ctaacagaag 1620

aagcagagct agaactggca gaaaacagag agattctaaa agaaccagta catggagtgt 1680

attatgaccc atcaaaagac ttaatagcag aaatacagaa gcaggggcaa ggccaatgga 1740

catatcaaat ttatcaagag ccatttaaaa atctgaaaac aggaaaatat gcaagaatga 1800

ggggtgccca cactaatgat gtaaaacaat taacagaggc agtgcaaaaa ataaccacag 1860

aaagcatagt aatatgggga aagactccta aatttaaact gcccatacaa aaggaaacat 1920

gggaaacatg gtggacagag tattggcaag ccacctggat tcctgagtgg gagtttg 1977

<210> 7

<211> 9719

<212> DNA

<213> HIV-1 HXB2

<220>

<400> 7

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180

acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa 840

aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca 900

agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt 960

agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca 1020

ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc 1080

aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa 1140

gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac 1200

atccaggggc aaatggtaca tcaggccata tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa 1260

gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa gtgataccca tgttttcagc attatcagaa 1320

ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc 1380

atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatag agtgcatcca 1440

gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagca 1500

ggaactacta gtacccttca ggaacaaata ggatggatga caaataatcc acctatccca 1560

gtaggagaaa tttataaaag atggataatc ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat 1620

agccctacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgta 1680

gaccggttct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg 1740

acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcattg 1800

ggaccagcgg ctacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtagg aggacccggc 1860

cataaggcaa gagttttggc tgaagcaatg agccaagtaa caaattcagc taccataatg 1920

atgcagagag gcaattttag gaaccaaaga aagattgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa 1980

gaagggcaca cagccagaaa ttgcagggcc cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga 2040

aaggaaggac accaaatgaa agattgtact gagagacagg ctaatttttt agggaagatc 2100

tggccttcct acaagggaag gccagggaat tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc 2160

ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2220

ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2280

tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2340

atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2400

ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2460

aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2520

tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2580

aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa 2640

taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaga tggaaaagga agggaaaatt tcaaaaattg 2700

ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat 2760

ggagaaaatt agtagatttc agagaactta ataagagaac tcaagacttc tgggaagttc 2820

aattaggaat accacatccc gcagggttaa aaaagaaaaa atcagtaaca gtactggatg 2880

tgggtgatgc atatttttca gttcccttag atgaagactt caggaagtat actgcattta 2940

ccatacctag tataaacaat gagacaccag ggattagata tcagtacaat gtgcttccac 3000

agggatggaa aggatcacca gcaatattcc aaagtagcat gacaaaaatc ttagagcctt 3060

ttagaaaaca aaatccagac atagttatct atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat 3120

ctgacttaga aatagggcag catagaacaa aaatagagga gctgagacaa catctgttga 3180

ggtggggact taccacacca gacaaaaaac atcagaaaga acctccattc ctttggatgg 3240

gttatgaact ccatcctgat aaatggacag tacagcctat agtgctgcca gaaaaagaca 3300

gctggactgt caatgacata cagaagttag tggggaaatt gaattgggca agtcagattt 3360

acccagggat taaagtaagg caattatgta aactccttag aggaaccaaa gcactaacag 3420

aagtaatacc actaacagaa gaagcagagc tagaactggc agaaaacaga gagattctaa 3480

aagaaccagt acatggagtg tattatgacc catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga 3540

agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa 3600

caggaaaata tgcaagaatg aggggtgccc acactaatga tgtaaaacaa ttaacagagg 3660

cagtgcaaaa aataaccaca gaaagcatag taatatgggg aaagactcct aaatttaaac 3720

tgcccataca aaaggaaaca tgggaaacat ggtggacaga gtattggcaa gccacctgga 3780

ttcctgagtg ggagtttgtt aatacccctc ccttagtgaa attatggtac cagttagaga 3840

aagaacccat agtaggagca gaaaccttct atgtagatgg ggcagctaac agggagacta 3900

aattaggaaa agcaggatat gttactaata gaggaagaca aaaagttgtc accctaactg 3960

acacaacaaa tcagaagact gagttacaag caatttatct agctttgcag gattcgggat 4020

tagaagtaaa catagtaaca gactcacaat atgcattagg aatcattcaa gcacaaccag 4080

atcaaagtga atcagagtta gtcaatcaaa taatagagca gttaataaaa aaggaaaagg 4140

tctatctggc atgggtacca gcacacaaag gaattggagg aaatgaacaa gtagataaat 4200

tagtcagtgc tggaatcagg aaagtactat ttttagatgg aatagataag gcccaagatg 4260

aacatgagaa atatcacagt aattggagag caatggctag tgattttaac ctgccacctg 4320

tagtagcaaa agaaatagta gccagctgtg ataaatgtca gctaaaagga gaagccatgc 4380

atggacaagt agactgtagt ccaggaatat ggcaactaga ttgtacacat ttagaaggaa 4440

aagttatcct ggtagcagtt catgtagcca gtggatatat agaagcagaa gttattccag 4500

cagaaacagg gcaggaaaca gcatattttc ttttaaaatt agcaggaaga tggccagtaa 4560

aaacaataca tactgacaat ggcagcaatt tcaccggtgc tacggttagg gccgcctgtt 4620

ggtgggcggg aatcaagcag gaatttggaa ttccctacaa tccccaaagt caaggagtag 4680

tagaatctat gaataaagaa ttaaagaaaa ttataggaca ggtaagagat caggctgaac 4740

atcttaagac agcagtacaa atggcagtat tcatccacaa ttttaaaaga aaagggggga 4800

ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta 4860

aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac agggacagca 4920

gaaatccact ttggaaagga ccagcaaagc tcctctggaa aggtgaaggg gcagtagtaa 4980

tacaagataa tagtgacata aaagtagtgc caagaagaaa agcaaagatc attagggatt 5040

atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagaaca 5100

tggaaaagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaggga aagctagggg atggttttat 5160

agacatcact atgaaagccc tcatccaaga ataagttcag aagtacacat cccactaggg 5220

gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat 5280

ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaagagat atagcacaca agtagaccct 5340

gaactagcag accaactaat tcatctgtat tactttgact gtttttcaga ctctgctata 5400

agaaaggcct tattaggaca catagttagc cctaggtgtg aatatcaagc aggacataac 5460

aaggtaggat ctctacaata cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 5520

ccacctttgc ctagtgttac gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 5580

aagggccaca gagggagcca cacaatgaat ggacactaga gcttttagag gagcttaaga 5640

atgaagctgt tagacatttt cctaggattt ggctccatgg cttagggcaa catatctatg 5700

aaacttatgg ggatacttgg gcaggagtgg aagccataat aagaattctg caacaactgc 5760

tgtttatcca ttttcagaat tgggtgtcga catagcagaa taggcgttac tcgacagagg 5820

agagcaagaa atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca 5880

gcctaaaact gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg 5940

tttcataaca aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag 6000

agctcatcag aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagtaag tagtacatgt 6060

aacgcaacct ataccaatag tagcaatagt agcattagta gtagcaataa taatagcaat 6120

agttgtgtgg tccatagtaa tcatagaata taggaaaata ttaagacaaa gaaaaataga 6180

caggttaatt gatagactaa tagaaagagc agaagacagt ggcaatgaga gtgaaggaga 6240

aatatcagca cttgtggaga tgggggtgga gatggggcac catgctcctt gggatgttga 6300

tgatctgtag tgctacagaa aaattgtggg tcacagtcta ttatggggta cctgtgtgga 6360

aggaagcaac caccactcta ttttgtgcat cagatgctaa agcatatgat acagaggtac 6420

ataatgtttg ggccacacat gcctgtgtac ccacagaccc caacccacaa gaagtagtat 6480

tggtaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaatga catggtagaa cagatgcatg 6540

aggatataat cagtttatgg gatcaaagcc taaagccatg tgtaaaatta accccactct 6600

gtgttagttt aaagtgcact gatttgaaga atgatactaa taccaatagt agtagcggga 6660

gaatgataat ggagaaagga gagataaaaa actgctcttt caatatcagc acaagcataa 6720

gaggtaaggt gcagaaagaa tatgcatttt tttataaact tgatataata ccaatagata 6780

atgatactac cagctataag ttgacaagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc 6840

caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc 6900

taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac 6960

aatgtacaca tggaattagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag 7020

cagaagaaga ggtagtaatt agatctgtca atttcacgga caatgctaaa accataatag 7080

tacagctgaa cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa 7140

gaatccgtat ccagagagga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata 7200

tgagacaagc acattgtaac attagtagag caaaatggaa taacacttta aaacagatag 7260

ctagcaaatt aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag caatcctcag 7320

gaggggaccc agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt ttctactgta 7380

attcaacaca actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact gaagggtcaa 7440

ataacactga aggaagtgac acaatcaccc tcccatgcag aataaaacaa attataaaca 7500

tgtggcagaa agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt 7560

catcaaatat tacagggctg ctattaacaa gagatggtgg taatagcaac aatgagtccg 7620

agatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat 7680

ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg 7740

tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag 7800

caggaagcac tatgggcgca gcctcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt 7860

ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt 7920

tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat 7980

acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca 8040

ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca 8100

cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa 8160

ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat 8220

gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca 8280

taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga 8340

atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg 8400

gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca 8460

ttcgattagt gaacggatcc ttggcactta tctgggacga tctgcggagc ctgtgcctct 8520

tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg gaacttctgg 8580

gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat tggagtcagg 8640

aactaaagaa tagtgctgtt agcttgctca atgccacagc catagcagta gctgagggga 8700

cagatagggt tatagaagta gtacaaggag cttgtagagc tattcgccac atacctagaa 8760

gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataagatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt 8820

agtgtgattg gatggcctac tgtaagggaa agaatgagac gagctgagcc agcagcagat 8880

agggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 8940

gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 9000

ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 9060

cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat 9120

atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca 9180

ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 9240

gagccagata agatagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg 9300

agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc 9360

ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgacat 9420

cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg 9480

actggggagt ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg 9540

gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 9600

gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 9660

tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagca 9719

Claims (9)

1.一种检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，所述成套引物含有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所示的核苷酸序列：

SEQ ID No.1：GAAATGATGACAGCATGTCAGGGAG；

SEQ ID No.2：GAAATGATGACAGCATGCCAGGGAG；

SEQ ID No.3：CAAACTCCCACTCAGGAATCCAGGT；

SEQ ID No.4：CAAACTCCCATTCAGGAATCCAGGT；

SEQ ID No.5：CAAATTCCCACTCAGGAATCCAGGT，其中：

所述成套引物用于扩增HIV-1基因组的Pol基因蛋白酶和逆转录酶基因片段，所述基因片段包含蛋白酶基因区1-99位氨基酸的编码子和逆转录酶基因区1-410位氨基酸的编码子。

2.根据权利要求1所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，其特征在于：

所述耐药突变位点为位于HIV-1基因组的Pol基因的核苷类逆转录酶抑制剂相关位点、非核苷类逆转录酶抑制剂相关位点和蛋白酶抑制剂相关位点。

3.一种检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物。

4.根据权利要求3所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：

所述成套引物的量为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数为的比例为1:(1-2)。

5.根据权利要求4所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：所述成套引物的量为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数为的比例为1:(1.2-1.8)。

6.根据权利要求4所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：所述成套引物的量为：SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.5所示的核苷酸序列的引物的总摩尔数为的比例为1:1.5。

7.根据权利要求5或6所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：

所述SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的引物和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的引物的摩尔数比为1:1；

SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的引物、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列的引物和SEQID No.5所示的核苷酸序列的引物的摩尔数比为1:1:1。

8.根据权利要求7所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒中还含有RT-PCR扩增试剂。

9.权利要求1或2所述的检测HIV-1耐药突变位点的成套引物，或者权利要求3-8中任一项所述的检测HIV-1耐药突变位点的试剂盒，在制备检测或者辅助检测HIV-1耐药突变位点的制剂中的应用。

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