CN114934135A

CN114934135A - 扩增HIV-1 pol-env部分片段鉴定重组毒株的引物组合物及其应用

Info

Publication number: CN114934135A
Application number: CN202210497150.2A
Authority: CN
Inventors: 李林; 韩婧婉; 朱博; 王晓蕊; 施玉婷; 李韩平; 刘永健; 贾磊; 王晓林; 李敬云; 李天一
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2022-05-09
Filing date: 2022-05-09
Publication date: 2022-08-23

Abstract

本发明公开了一种扩增HIV‑1pol‑env部分片段鉴定HIV‑1毒株的方法及其专用引物组合物。本发明提供的引物组合物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。本发明可应用于HIV‑1毒株重组热点区域pol‑env部分片段序列(HXB2：4800‑6400)的扩增及鉴定、HIV‑1纯亚型毒株、重组毒株及二代重组毒株的鉴定和单一HIV‑1pol区1.3kb短片段(HXB2：2253‑3550)HIV‑1毒株鉴定分析所致的毒株错误分型的纠正。

Description

扩增HIV-1 pol-env部分片段鉴定重组毒株的引物组合物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种扩增HIV-1 pol-env部分片段鉴定重组毒株的方法及其专用引物组合物。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是引起人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)的病原体，艾滋病的疫情形势依然严峻。

HIV-1具有高度的基因多态性，且重组频发。自1990年以来，全球HIV-1重组毒株引起的感染已经从9.3％(1990-1999年)快速上升到22.8％(2010-2015年)，截至目前，共发现流行重组型毒株(Circulating Recombinant Form，CRFs)118种，独特重组型毒株(UniqueRecombinant Form,URFs)数百种。中国在内的东亚地区位居全球首位占80.5％(2010-2015)。我国已经发现了HIV-1的A、B/B’、C、D、F等亚型毒株，以及CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF55_01B、CRF59_01B等基因重组型毒株，是HIV-1亚型最复杂的国家之一，其中，四种主要流行毒株为CRF07_BC (41％)、CRF01_AE(33％)、CRF08_BC(11％)和CN.B’(4％)亚型，占我国 HIV-1感染者总数的89％。

2006年第三次全国HIV-1分子流行病学调查、2016年第四次全国HIV-1分子流行病学调查以及2018年全国HIV基因亚型监测结果显示，CRF07_BC已成为中国第一大流行的毒株，占比分别为36％、41％、39.7％；而CRF01_AE作为中国第二大流行的毒株，在这三次调查中，占比分别为28％、33％、36.9％。近年来诸如CRF80_0107、 CRF102_0107、CRF104_0107、CRF109_0107、CRF113_0107和CRF117_0107等 CRF07_BC的二代重组毒株也不断涌现。CRF07_BC毒株全长基因组序列分析表明，仅以HIV-1 pol区1.3kb短片段序列鉴定为CRF07_BC的毒株中，存在20％左右的未被发现的CRF07_BC二代重组毒株(URFs，或潜在的CRFs)，其中大部分为CRF01_AE 与CRF07_BC的二代重组毒株(CRF01_AE/CRF07_BC)。

全长基因组序列的获得，对于HIV-1重组型毒株的准确鉴定具有非常重要的意义，但由于序列长(约9.8kb)且突变频发，全长基因组扩增的阳性率仅为50％左右(数据未公开)，且测序成本较高。因此，针对HIV-1毒株的重组热点，设计出相对保守的、适用于多种我国主要流行的重组型毒株亚型鉴定引物，是HIV重组毒株流行特征研究的关键，有助于揭露我国HIV-1重组毒株的实际流行情况，为重组毒株的进一步研究提供新的参考。

发明内容

本发明一个目的是提供成套引物。

本发明提供的成套引物，包括引物组1；

所述引物组1由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1的核苷酸序列为序列表的序列1或将序列1至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物2的核苷酸序列为序列表的序列2或将序列2至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物3的核苷酸序列为序列表的序列3或将序列3至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物4的核苷酸序列为序列表的序列4或将序列4至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列。

上述成套引物还包括引物组2；

所述引物组2由引物DR-1和引物DR-2与引物DR-3和引物DR-4组成；

所述引物DR-1的核苷酸序列为序列表的序列6或将序列6至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物DR-2的核苷酸序列为序列表的序列7或将序列7至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物DR-3的核苷酸序列为序列表的序列8或将序列8至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列；

所述引物DR-4的核苷酸序列为序列表的序列9或将序列9至少一个经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得的与原序列功能相同的序列。

上述，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1：1。

所述引物3和所述引物4的摩尔比为1：1。

所述引物DR-1和引物DR-2的摩尔比为1：1。

所述引物DR-3和引物DR-4的摩尔比为1：1。

本发明还有一个目的是提供用于鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒的成套PCR试剂。

本发明提供的成套PCR试剂，包括PCR试剂1；

所述PCR试剂1包括PCR试剂1-1和PCR试剂1-2；

所述PCR试剂1-1含有权利要求1中的引物1和引物2；

所述PCR试剂1-2含有权利要求1中的引物3和引物4；

各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4μM。

上述成套PCR试剂还包括PCR试剂2；

所述PCR试剂2包括PCR试剂2-1和PCR试剂2-2；

所述PCR试剂2-1含有权利要求1中的引物DR-1和引物DR-2；

所述PCR试剂2-2含有权利要求1中的引物DR-3和引物DR-4；

各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4μM。

上述成套引物或上述的成套PCR试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

(c)鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其感染毒株亚型；

(d)鉴定或辅助鉴定待测样本是否含有人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株核酸或其含有的毒株核酸亚型；

(e)区分或辅助区分人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株和人乙型肝炎病毒，或，区分或辅助区分人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株和人丙型肝炎病毒。

本发明还有一个目的是提供试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的成套引物或上述成套PCR试剂；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

或，所述试剂盒的制备方法，包括将上述成套PCR试剂中各物质单独包装的步骤。

上述中，

所述人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株亚型为A、B/B’、C、D、F等纯亚型毒株，或CRF01_AE 重组毒株、CRF07_BC重组毒株、CRF08_BC重组毒株、CRF55_01B重组毒株、 CRF59_01B重组毒株或各个重组毒株的二代重组毒株等重组毒株。

本发明还有一个目的是提供如下方法。

本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

(1)以待测病毒的核酸为模板，用上述引物1和引物2进行扩增，得到第一轮 PCR扩增产物；

(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，用上述引物3和引物4进行扩增，得到第二轮PCR扩增产物；

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp 或1715bp的特异DNA片段，则所述待测病毒为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待测病毒不为或候选不为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；

或，本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

(1)以待测者的核酸为模板，用上述引物1和引物2进行扩增，得到第一轮PCR 扩增产物；

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp 或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者感染或候选感染人免疫缺陷病毒；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者未感染或候选未感染人免疫缺陷病毒。

或，本发明提供的一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

步骤I：以待测病毒的核酸为模板，用上述引物DR-1和引物DR-2进行扩增，得到扩增产物，得到第一轮PCR扩增产物；

再以所述第一轮PCR扩增产物为模板，用上述引物DR-3和引物DR-4进行扩增，得到第二轮PCR扩增产物；

检测所述第二轮PCR扩增产物大小，若待测病毒得到1000-1500bp或1315bp的片段，则所述待测病毒为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；若未得到1000-1500bp或 1315bp的片段，则该待测病毒不为或候选不为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；

步骤II：

(1)以用I的方法确定的为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的待测病毒的核酸为模板，用上述引物1和引物2进行扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

步骤I：

以待测病毒的核酸为模板，用上述引物DR-1和引物DR-2进行扩增，得到扩增产物，得到第一轮PCR扩增产物；

步骤II：

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp 或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者感染或候选感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者未感染或候选未感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株。

上述各个方法中，在获得第二轮PCR扩增产物后，通过测序比对，确定待测样本的人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株亚型。具体为：将第二轮PCR扩增产物测序后Los Alamos HIVdatabases数据库(http://www.hiv.lanl.gov/)比对，进行亚型鉴定，获得亚型鉴定结果。

人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列作为靶基因在开发制备具有如下任一功能产品中的应用也是本发明保护的范围；

或，人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol区短片段和pol-env部分序列作为靶基因在开发制备具有如下任一功能产品中的应用也是本发明保护的范围：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

(e)区分或辅助区分人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株和人乙型肝炎病毒，或，区分或辅助区分人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株和人丙型肝炎病毒；

(f)区分或辅助区分人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株亚型、分型鉴定或纠正亚型鉴定的结果；

所述人免疫缺陷病毒Ⅰ型重组毒株pol-env部分序列为序列表中序列5第4800-6400 位或与其同源性在95％以上且具有相同功能的序列；

所述人免疫缺陷病毒Ⅰ型重组毒株pol区短片段的核苷酸序列为序列表中序列5第2253-3550位或与其同源性在95％以上且具有相同功能的序列。

本发明以中国HIV-1CRF01_AE、CRF07_BC及其重组毒株的近似全长序列为基础，进行重组热点区域分析。根据重组热点区域分析结果，应用Primer 5.0设计了一组巢式PCR扩增引物，以我国主要HIV-1流行毒株CRF07_BC及其重组毒株的血浆标本及其他病毒(HBV、HCV)的标本为研究对象，对引物进行了特异性鉴定，确定引物组合物HIV-07RF(含HIV-07RF-1F、HIV-07RF-1R、HIV-07RF-2F与HIV-07RF-2R) 能有效扩增我国B亚型毒株、CRF01_AE重组毒株、CRF07_BC重组毒株及其二代重组毒株等主要的HIV-1流行毒株的pol-env部分片段序列，而与HBV、HCV等无交叉反应，尤其是可用于HIV-1CRF07_BC及其二代重组毒株pol-env部分片段序列扩增及亚型鉴定等相关研究。本发明可应用于HIV-1毒株重组热点区域pol-env部分片段序列(HXB2：4800-6400)的扩增及鉴定、HIV-1纯亚型毒株、HIV-1重组毒株及二代重组的鉴定和单一HIV-1 pol区1.3kb短片段(HXB2：2253-3550)分析所致的毒株错误分型的纠正，有助于了解HIV-1重组毒株流行的真实情况，对于HIV-1重组模式分析及相关致病机制的研究和艾滋病新型防治方法的发现具有潜在的应用前景，为艾滋病防治工作和公共卫生策略的制定提供参考。

附图说明

图1为我国部分地区HIV-1CRF07_BC二代重组毒株的近似全长序列(本实验室获得)重组热点区域分布图(HXB2坐标：790-9417)。注：左边框表示HIV-1 pol 区1.3kb(HXB2：2253-3550)；右边框表示HIV-1 pol-env部分片段(HXB2：4800-6400)。

图2为HIV-1 pol-env部分片段(HXB2：4800-6400)与HIV-1 pol区1.3kb短片段(HXB2：2253-3550)双片段序列分析对HIV-1二代重组毒株的鉴别效果与单一HIV-1 pol区1.3kb短片段(HXB2：2253-3550)序列分析对于HIV-1二代重组毒株的鉴别效果对比图。注：This Study组为本实验室可获得的用于本次引物敏感性实验的HIV-1 CRF07_BC二代重组毒株(URF)，其他URF序列下载自Los Alamos HIV databases。

图3为HIV-1 pol-env部分片段(HXB2：4800-6400)目的基因上游序列多态性位点分布图，注：附图坐标(HXB2：4300-4800)；左边框表示引物HIV-07RF-1F区域；右边框表示引物HIV-07RF-2F区域。

图4为HIV-1 pol-env部分片段(HXB2：4800-6400)目的基因下游序列多态性位点分布图，注：附图坐标(HXB2：6200-6700)；左边框表示引物HIV-07RF-2R区域；右边框表示引物HIV-07RF-1R区域。

图5为我国HIV-1优势毒株B亚型毒株(N＝12)、CRF01_AE重组毒株(N＝12)、CRF07_BC重组毒株(N＝24)及其二代重组毒株(N＝33)pol-env部分片段(HXB2： 4772-6435)扩增产物电泳鉴定图。

注，B亚型毒株样本：1：LS10393；2：LS10409；3：LS10466；4：LS10517；5： LS10944；6：LS11161；7：LS11268；8：LS11919；9：LS12168；10：LS12566；11： LS12646；12：LS13351；CRF01_AE重组毒株样本：1：LS10191；2：LS10219；3： LS10248；4：LS10387；5：LS10395；6：LS10430；7：LS10532；8：LS11323；9： LS11535；10：LS11723；11：LS11783；12：LS11872；CRF07_BC重组毒株样本：1： LS10309；2：LS10345；3：LS10369；4：LS10634；5：LS10676；6：LS10903；7： LS11269；8：LS11317；9：LS11322；10：LS11332；11：LS11333；12：LS11375； 13：LS11401；14：LS11438；15：LS11439；16：LS11440；17：LS11505；18：LS11540； 19：LS11588；20：LS11592；21：LS11624；22：LS12406；23：LS12434；24：LS12466； CRF07_BC二代重组毒株样本：1：MSM-LS10525；2：MSM-LS10913；3：MSM-LS11546； 4：MSM-LS11585；5：MSM-LS12565；6：MSM-LS12580；7：MSM-LS12663；8： MSM-LS12782；9：MSM-LS12824；10：MSM-LS13010；11：MSM-LS13037；12： MSM-LS13469；13：MSM-LS13740；14：MSM-LS14092；15：MSM-LS14402；16：MSM-LS14718；17：MSM-LS14873；18：MSM-LS16178；19：MSM-LS16399；20： MSM-LS16437；21：MSM-LS16656；22：MSM-LS16782；23：HES-LS10180；24： HES-LS10470；25：HES-LS10482；26：HES-LS10867；27：HES-LS13810；28： HES-LS16846；29：IDU-LS14734；30：IDU-LS16576；31：IDU-LS17859；32：IDU-LS4017； 33：IDU-LS5051。

图6为我国HIV-1优势毒株B亚型毒株(N＝12)、CRF01_AE重组毒株(N＝12)、CRF07_BC重组毒株(N＝24)及其二代重组毒株(N＝33)pol区1.3kb短片段(HXB2： 2253-3550)扩增产物电泳鉴定图。

图7为引物组合HIV-07RF的特异性鉴定电泳图(HBV)；M：DL-2000Plus Marker； 1：HBV-13699；2：HBV-13704；3：HBV-13711；4：HBV-13716；5：HBV-13732；6： HBV-13876；7：HBV-13899；8：HBV-13905；9：HBV-16032；10：HBV-16073；11： HBV-18147；12：HBV-18166；13：HBV-18186；14：HBV-18233；15：HBV-18302； 16：HBV-18388；17：HBV-18779；18：HBV-18790；19：HBV-18834；20：HBV-18865； 21：HBV-18915；22：HBV-18938；23：HBV-18942；24：HBV-484；25：阴性对照(水)； 26：阴性对照(水)。

图8为引物组合HIV-07RF的特异性鉴定电泳图(HCV)；M：DL-2000Plus Marker； 1：HCV-13671；2：HCV-13673；3：HCV-13755；4：HCV-13878；5：HCV-13879；6： HCV-14045；7：HCV-14357；8：HCV-14069；9：HCV-17529；10：HCV-17532；11： HCV-17591；12：HCV-17635；13：HCV-17763；14：HCV-17905；15：HCV-17958； 16：HCV-18029；17：HCV-18059；18：HCV-18234；19：HCV-18102；20：HCV-18252； 21：HCV-18304；22：HCV-18328；23：HCV-18345；24：HCV-18362；25：阴性对照 (水)；26：阴性对照(水)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

HBV代表人乙型肝炎病毒，HCV代表人丙型肝炎病毒。

实施例1、鉴定HIV-1毒株的引物及方法的建立

一、鉴定HIV-1毒株的引物组合物的设计

以中国主要艾滋病流行地区的HIV-1CRF07_BC及其二代重组毒株的近似全长序列(本实验室获得)为基础，进行重组热点区域分析。

图1-图4分析结果提示HIV-1 pol-env部分片段(HXB2：序列5第4800-6400位) 是CRF07_BC毒株的高频重组区，将该片段序列与pol区短片段(HXB2：序列5第 2253-3550位，1.3kb)序列共同用于HIV-1重组型毒株鉴定，能够鉴别出90％以上的被单一HIV-1 pol区短片段(HXB2：序列5第2253-3550)错误分型的CRF07_BC重组毒株(This Study组)，且对CRF01_AE与CRF07_BC的二代重组毒株(URF_0107) 鉴别率达98.2％(54/55)，结果提示该区域具有良好的亚型鉴别效果。

利用BioEdit软件进行序列分析，基于序列分析结果用软件Primer 5.0在HIV-1pol-env部分片段(序列5第4800-6400位，1.7kb)的保守区设计一组巢式PCR扩增引物组合物(命名为引物组合物HIV-07RF)，由引物HIV-07RF-1F、HIV-07RF-1R、 HIV-07RF-2F与HIV-07RF-2R共4条引物组成。扩增pol区短片段(序列5第2253-3550 位，1.3kb)设计引物对DR-1、DR-2、DR-3及DR-4如下表1所示。

各条引物的序列和针对基因的位置见表1。

表1为各条引物的序列和针对基因的位置

二、HIV-1 pol-env部分片段鉴定HIV-1毒株的方法的建立

A、待测样本的核酸为RNA

1、提取待测样本的RNA；

2、RT-PCR

以RNA为模板，用HIV-07RF-1F和HIV-07RF-1R组成的引物对进行RT-PCR(第一轮PCR扩增)，得到第一轮PCR扩增产物。

第一轮PCR扩增的反应体系见表2。

表2为第一轮PCR扩增的反应体系

成分	体积(ul)	体系终浓度
			PrimeScript 1 Step Enzyme Mix(TaKaRa，RR057A)	1.0
2×1Step Buffer(Dye Plus)(TaKaRa，RR057A)	12.5
			HIV-07RF-1F(20μM)	0.5	0.4μM
HIV-07RF-1R(20μM)	0.5	0.4μM
			RNA	5
ddH<sub>2</sub>O	5.5
			Total	25

第一轮PCR扩增的反应程序见表3。

表3为第一轮PCR扩增的反应程序

3、PCR扩增

以第一轮PCR扩增产物为模板，用HIV-07RF-2F和HIV-07RF-2R组成的引物对进行PCR(第二轮PCR扩增)，得到第二轮PCR扩增产物。

第二轮PCR扩增的反应体系见表4。

表4第二轮PCR扩增的反应体系

成分	体积(ul)
		Premix Taq(Ex Taq Version 2.0plus dye)(TaKaRa，RR902A)	25
HIV-07RF-2F(20μM，终浓度为0.4μM)	1
		HIV-07RF-2R(20μM，终浓度为0.4μM)	1
第一轮PCR扩增产物	2
		ddH<sub>2</sub>O	21
Total	50

第二轮PCR扩增的反应程序见表5。

表5为第二轮PCR扩增的反应程序

检测第二轮PCR扩增产物的大小，若得到1500-2000bp或1715bp的片段(含有序列5第4800-6400位)，则该待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1毒株的核酸；若未得到1500-2000bp或1715bp(含有序列5第4800-6400 位)的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。

B、待测样本的核酸为DNA

1、提取待测样本的DNA。

2、以步骤1的DNA为模板，用引物HIV-07RF-1F和HIV-07RF-1R组成的引物对进行PCR(第一轮PCR扩增)，得到第一轮PCR扩增产物。

第一轮PCR扩增的反应体系见表6。

表6为第一轮PCR扩增的反应体系

第一轮PCR扩增的反应程序见表7。

表7第一轮PCR扩增的反应程序

第二轮PCR扩增反应体系和反应程序同实施例2的二。

检测第二轮PCR扩增产物的大小，若得到1500-2000bp或1715bp的片段(含有序列5第4800-6400位，则该待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1毒株的核酸；若未得到1500-2000bp或1715bp的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。

三、pol区短片段和HIV-1 pol-env部分片段结合鉴定HIV-1重组毒株的方法的建立

I、pol区短片段的鉴定

提取待测样本的RNA作为模板，用DR-1及DR-2、DR-3及DR-4组成的引物对进行RT-PCR(第一轮PCR扩增)，得到第一轮PCR扩增产物。

第一轮PCR扩增的反应体系见表8。

表8为第一轮PCR扩增的反应体系

成分	体积(ul)	体系终浓度
			PrimeScript 1 Step Enzyme Mix(TaKaRa，RR057A)	1.0
2×1Step Buffer(Dye Plus)(TaKaRa，RR057A)	12.5
			DR1(20μM)	0.5	0.4μM
DR2(20μM)	0.5	0.4μM
			RNA	5
ddH<sub>2</sub>O	5.5
			Total	25

第一轮PCR扩增的反应程序见表9。

表9为第一轮PCR扩增的反应程序

以第一轮PCR扩增产物为模板，用DR3和DR4组成的引物对进行PCR(第二轮 PCR扩增)，得到第二轮PCR扩增产物。

第二轮PCR扩增的反应体系见表10。

表10第二轮PCR扩增的反应体系

成分	体积(ul)
		Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)(TaKaRa，RR902A)	25
DR3(20μM，终浓度为0.4μM)	1
		DR4(20μM，终浓度为0.4μM)	1
第一轮PCR扩增产物	2
		ddH<sub>2</sub>O	21
Total	50

第二轮PCR扩增的反应程序见表11。

表11为第二轮PCR扩增的反应程序

或，

提取待测样本的DNA作为模板，用DR-1及DR-2、DR-3及DR-4组成的引物对进行两轮巢式PCR扩增。

第一轮PCR扩增的反应体系见表12。

表12为第一轮PCR扩增的反应体系

第一轮PCR扩增的反应程序见表13。

表13第一轮PCR扩增的反应程序

第二轮PCR扩增反应体系和反应程序同上述待测样本为RNA时的第二轮。

检测扩增产物大小，若待测样本得到1000-2000bp或1315bp的片段(含有序列5 第2253-3550位)，则待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1 毒株的核酸；若未得到1000-2000bp或1315bp(含有序列5第2253-3550位)的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。

将该pol区1.3kb短片段第二轮扩增产物测序后在Los Alamos HIV databases数据库 (http://www.hiv.lanl.gov/)进行序列分析，所得亚型鉴定结果即为pol区短片段鉴定结果。

II、HIV-1 pol-env部分片段的鉴定

与上述二的方法相同。

检测第二轮PCR扩增产物的大小，若得到1500-2000bp或1715bp的片段(含有序列5第4800-6400位)，则该待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有 HIV-1毒株的核酸；若未得到1500-2000bp或1715bp的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。

将该pol-env部分片段第二轮PCR扩增产物进行测序后在Los Alamos HIVdatabases 数据库(http://www.hiv.lanl.gov/)进行序列分析，所得亚型鉴定结果即为pol-env部分片段鉴定结果。

Ⅲ、HIV-1 pol-env部分片段与pol区短片段结合的鉴定

1、pol区短片段鉴定

与上述I的方法相同，得到第二轮PCR扩增；

检测扩增产物大小，若待测样本得到1000-2000bp或1315bp的片段(序列5第2253-3550位)，则待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1毒株的核酸；若未得到1000-2000bp或1315bp(序列5第2253-3550位)的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。

2、HIV-1 pol-env部分片段鉴定

将上述鉴定为感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1毒株的核酸的待测样本作为第一轮扩增产物的待测样本，按照上述二的方法进行检测，得到第二轮PCR扩增产物。

检测第二轮PCR扩增产物的大小，若得到1500-2000bp或1715bp的片段(序列5 第4800-6400位，则该待测样本感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1 毒株的核酸；若未得到1500-2000bp或1715bp的片段，则该待测样本不感染或候选不感染HIV-1毒株，或者不含有或候选不含有HIV-1毒株的核酸。将上述1得到的待测样本pol区1.3kb短片段第二轮扩增产物与上述2得到的pol-env部分片段第二轮扩增产物测序后Los AlamosHIV databases数据库(http://www.hiv.lanl.gov/)比对，结果相结合进行序列分析，以纠正单独pol区1.3kb短片段鉴定结果，所得亚型鉴定结果即为最终鉴定结果。

实施例2、鉴定HIV-1毒株的引物组合物的敏感性检测

一、实验样本

将临床确诊的81位HIV感染者(知情同意的志愿者)的血浆标本作为实验样本，其中12例为感染HIV-1B亚型毒株的患者、12例为感染HIV-1CRF01_AE重组毒株的患者、24例为感染HIV-1CRF07_BC重组毒株的患者、33例为感染CRF07_BC二代重组毒株(URF)的患者(已鉴定)。

二、HIV-1 pol-env部分片段鉴定HIV-1毒株

分别将步骤一的各个患者的血浆按照实施例1的二的A方法进行检测。

将第二轮PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。

部分结果见图5所示，部分样本在1500-2000bp间相同位置显示一条特异性条带，将该部分样本作为阳性样本。

将上述第二轮PCR扩增产物回收并测序，测序结果表明，各阳性样本在相同位置显示的特异性条带均为1715bp(含有序列5第4800-6400位)。

统计各样本的检测结果见表14。

表14临床确诊的81位HIV感染者的鉴定结果

注：*12近似全长扩增阴性+12近似全长扩增阳性；**经近似全长扩增阳性鉴定

上述阳性样本的例数为采用两轮PCR鉴定阳性的结果。

上述阳性率为阳性样本的例数/总样本例数的百分含量。

可以看出，24例感染HIV-1CRF07_BC亚型毒株的患者样本中，12例为近似全长扩增阳性样本，12例为近似全长扩增阴性样本，HIV-1 pol-env部分片段扩增结果均为阳性，可以很好的弥补近似全长扩增鉴定(HIV亚型鉴定金标准，采用近似全长基因组扩增(序列5第790位-9417位))效率低的不足；33例感染HIV-1CRF07_BC二代重组毒株的患者样本，均为近似全长扩增阳性样本，经近似全长重新鉴定后确定为 CRF07_BC二代重组毒株(具体重组型见表15)，HIV-1 pol-env部分片段扩增结果同样均为阳性。

无论是HIV-1的纯亚型毒株，还是重组毒株或二代重组毒株，引物均有良好的扩增鉴定效果，引物组合物的敏感性为81/81*100％＝100.0％。

三、pol区短片段和HIV-1 pol-env部分片段结合鉴定HIV-1毒株

分别将步骤一的各个患者的血浆按照实施例1的三的三种方法进行检测。

其中，pol区短片段和HIV-1 pol-env部分片段结合鉴定中先进行pol区短片段的鉴定，再将鉴定为感染或候选感染HIV-1毒株，或者含有或候选含有HIV-1毒株的核酸的待测样本(图6)作为第一轮扩增的待测样本进行HIV-1 pol-env部分片段的鉴定 (图5)。

统计各样本的检测结果见表15。

表15为pol区短片段和HIV-1 pol-env部分片段结合鉴定临床确诊的81位HIV感染者感染毒株亚型

从上述可以看出，采用HIV-1 pol-env部分片段鉴定HIV-1毒株或采用pol区短片段和 HIV-1 pol-env部分片段结合鉴定HIV-1毒株的灵敏度高于单独使用pol区短片段，尤其是对于重组毒株或二代重组毒株的鉴定灵敏度有大幅度提高，和之前分析的一致。

实施例3、鉴定HIV-1的引物组合物的特异性检测

一、实验样本

将临床确诊且核酸检测阳性的24位HBV感染者(知情同意的志愿者；编号分别为1：HBV-13699；2：HBV-13704；3：HBV-13711；4：HBV-13716；5：HBV-13732； 6：HBV-13876；7：HBV-13899；8：HBV-13905；9：HBV-16032；10：HBV-16073； 11：HBV-18147；12：HBV-18166；13：HBV-18186；14：HBV-18233；15：HBV-18302； 16：HBV-18388；17：HBV-18779；18：HBV-18790；19：HBV-18834；20：HBV-18865； 21：HBV-18915；22：HBV-18938；23：HBV-18942；24：HBV-484)作为实验样本，将临床确诊且核酸检测阳性的24位HCV感染者(知情同意的志愿者；编号分别为1： HCV-13671；2：HCV-13673；3：HCV-13755；4：HCV-13878；5：HCV-13879；6： HCV-14045；7：HCV-14357；8：HCV-14069；9：HCV-17529；10：HCV-17532；11： HCV-17591；12：HCV-17635；13：HCV-17763；14：HCV-17905；15：HCV-17958； 16：HCV-18029；17：HCV-18059；18：HCV-18234；19：HCV-18102；20：HCV-18252； 21：HCV-18304；22：HCV-18328；23：HCV-18345；24：HCV-18362)。

二、鉴定

HCV感染者按照实施例1的二的A方法进行检测。

HBV感染者按照实施例1的二的B方法进行检测。

HBV感染者第二轮PCR扩增产物的琼脂糖凝胶见图7，HCV感染者第二轮PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶见图8，可以看出，扩增得到1715bp的实验样本为阳性样本，用“+”表示，没有扩增得到1715bp的实验样本为阴性样本，用“-”表示。

统计各个样本的检测结果见表16。

表16为各个感染者的鉴定结果

样本

检测结果

样本

检测结果

样本

检测结果

样本

检测结果

HBV-13699

－

HBV-18186

－

HCV-13671

－

HCV-17763

－

HBV-13704

－

HBV-18233

－

HCV-13673

－

HCV-17905

－

HBV-13711

－

HBV-18302

－

HCV-13755

－

HCV-17958

－

HBV-13716

－

HBV-18388

－

HCV-13878

－

HCV-18029

－

HBV-13732

－

HBV-18779

－

HCV-13879

－

HCV-18059

－

HBV-13876

－

HBV-18790

－

HCV-14045

－

HCV-18234

－

HBV-13899

－

HBV-18834

－

HCV-14357

－

HCV-18102

－

HBV-13905

－

HBV-18865

－

HCV-14069

－

HCV-18252

－

HBV-16032

－

HBV-18915

－

HCV-17529

－

HCV-18304

－

HBV-16073

－

HBV-18938

－

HCV-17532

－

HCV-18328

－

HBV-18147

－

HBV-18942

－

HCV-17591

－

HCV-18345

－

HBV-18166

－

HBV-484

－

HCV-17635

－

HCV-18362

－

各个样本均为阴性结果。结果表明，本发明提供的引物组合物对2种其它病毒检测无交叉阳性，具有非常好的特异性，是一种较好的扩增引物。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 扩增HIV-1 pol-env部分片段的引物组合物及其应用

<160> 9

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)

<223> r=a 或 g

<400> 1

atgcatggac aagtrgactg tagt 24

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atttttccac atgttaaaat tttctgttac attt 34

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cttaagacag cagtacaaat ggcagtattc 30

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

tctgtgggta cacaggcatg tgt 23

<210> 5

<211> 9719

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60

cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180

acaaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatggaatg gatgacccgg 240

agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 300

agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gacatcgagc ttgctacaag ggactttccg 360

ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 420

cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 480

gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 540

tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 600

agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacctgaaag 660

cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 720

caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 780

aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgatgggaa 840

aaaattcggt taaggccagg gggaaagaaa aaatataaat taaaacatat agtatgggca 900

agcagggagc tagaacgatt cgcagttaat cctggcctgt tagaaacatc agaaggctgt 960

agacaaatac tgggacagct acaaccatcc cttcagacag gatcagaaga acttagatca 1020

ttatataata cagtagcaac cctctattgt gtgcatcaaa ggatagagat aaaagacacc 1080

aaggaagctt tagacaagat agaggaagag caaaacaaaa gtaagaaaaa agcacagcaa 1140

gcagcagctg acacaggaca cagcaatcag gtcagccaaa attaccctat agtgcagaac 1200

atccaggggc aaatggtaca tcaggccata tcacctagaa ctttaaatgc atgggtaaaa 1260

gtagtagaag agaaggcttt cagcccagaa gtgataccca tgttttcagc attatcagaa 1320

ggagccaccc cacaagattt aaacaccatg ctaaacacag tggggggaca tcaagcagcc 1380

atgcaaatgt taaaagagac catcaatgag gaagctgcag aatgggatag agtgcatcca 1440

gtgcatgcag ggcctattgc accaggccag atgagagaac caaggggaag tgacatagca 1500

ggaactacta gtacccttca ggaacaaata ggatggatga caaataatcc acctatccca 1560

gtaggagaaa tttataaaag atggataatc ctgggattaa ataaaatagt aagaatgtat 1620

agccctacca gcattctgga cataagacaa ggaccaaagg aaccctttag agactatgta 1680

gaccggttct ataaaactct aagagccgag caagcttcac aggaggtaaa aaattggatg 1740

acagaaacct tgttggtcca aaatgcgaac ccagattgta agactatttt aaaagcattg 1800

ggaccagcgg ctacactaga agaaatgatg acagcatgtc agggagtagg aggacccggc 1860

cataaggcaa gagttttggc tgaagcaatg agccaagtaa caaattcagc taccataatg 1920

atgcagagag gcaattttag gaaccaaaga aagattgtta agtgtttcaa ttgtggcaaa 1980

gaagggcaca cagccagaaa ttgcagggcc cctaggaaaa agggctgttg gaaatgtgga 2040

aaggaaggac accaaatgaa agattgtact gagagacagg ctaatttttt agggaagatc 2100

tggccttcct acaagggaag gccagggaat tttcttcaga gcagaccaga gccaacagcc 2160

ccaccagaag agagcttcag gtctggggta gagacaacaa ctccccctca gaagcaggag 2220

ccgatagaca aggaactgta tcctttaact tccctcaggt cactctttgg caacgacccc 2280

tcgtcacaat aaagataggg gggcaactaa aggaagctct attagataca ggagcagatg 2340

atacagtatt agaagaaatg agtttgccag gaagatggaa accaaaaatg atagggggaa 2400

ttggaggttt tatcaaagta agacagtatg atcagatact catagaaatc tgtggacata 2460

aagctatagg tacagtatta gtaggaccta cacctgtcaa cataattgga agaaatctgt 2520

tgactcagat tggttgcact ttaaattttc ccattagccc tattgagact gtaccagtaa 2580

aattaaagcc aggaatggat ggcccaaaag ttaaacaatg gccattgaca gaagaaaaaa 2640

taaaagcatt agtagaaatt tgtacagaga tggaaaagga agggaaaatt tcaaaaattg 2700

ggcctgaaaa tccatacaat actccagtat ttgccataaa gaaaaaagac agtactaaat 2760

ggagaaaatt agtagatttc agagaactta ataagagaac tcaagacttc tgggaagttc 2820

aattaggaat accacatccc gcagggttaa aaaagaaaaa atcagtaaca gtactggatg 2880

tgggtgatgc atatttttca gttcccttag atgaagactt caggaagtat actgcattta 2940

ccatacctag tataaacaat gagacaccag ggattagata tcagtacaat gtgcttccac 3000

agggatggaa aggatcacca gcaatattcc aaagtagcat gacaaaaatc ttagagcctt 3060

ttagaaaaca aaatccagac atagttatct atcaatacat ggatgatttg tatgtaggat 3120

ctgacttaga aatagggcag catagaacaa aaatagagga gctgagacaa catctgttga 3180

ggtggggact taccacacca gacaaaaaac atcagaaaga acctccattc ctttggatgg 3240

gttatgaact ccatcctgat aaatggacag tacagcctat agtgctgcca gaaaaagaca 3300

gctggactgt caatgacata cagaagttag tggggaaatt gaattgggca agtcagattt 3360

acccagggat taaagtaagg caattatgta aactccttag aggaaccaaa gcactaacag 3420

aagtaatacc actaacagaa gaagcagagc tagaactggc agaaaacaga gagattctaa 3480

aagaaccagt acatggagtg tattatgacc catcaaaaga cttaatagca gaaatacaga 3540

agcaggggca aggccaatgg acatatcaaa tttatcaaga gccatttaaa aatctgaaaa 3600

caggaaaata tgcaagaatg aggggtgccc acactaatga tgtaaaacaa ttaacagagg 3660

cagtgcaaaa aataaccaca gaaagcatag taatatgggg aaagactcct aaatttaaac 3720

tgcccataca aaaggaaaca tgggaaacat ggtggacaga gtattggcaa gccacctgga 3780

ttcctgagtg ggagtttgtt aatacccctc ccttagtgaa attatggtac cagttagaga 3840

aagaacccat agtaggagca gaaaccttct atgtagatgg ggcagctaac agggagacta 3900

aattaggaaa agcaggatat gttactaata gaggaagaca aaaagttgtc accctaactg 3960

acacaacaaa tcagaagact gagttacaag caatttatct agctttgcag gattcgggat 4020

tagaagtaaa catagtaaca gactcacaat atgcattagg aatcattcaa gcacaaccag 4080

atcaaagtga atcagagtta gtcaatcaaa taatagagca gttaataaaa aaggaaaagg 4140

tctatctggc atgggtacca gcacacaaag gaattggagg aaatgaacaa gtagataaat 4200

tagtcagtgc tggaatcagg aaagtactat ttttagatgg aatagataag gcccaagatg 4260

aacatgagaa atatcacagt aattggagag caatggctag tgattttaac ctgccacctg 4320

tagtagcaaa agaaatagta gccagctgtg ataaatgtca gctaaaagga gaagccatgc 4380

atggacaagt agactgtagt ccaggaatat ggcaactaga ttgtacacat ttagaaggaa 4440

aagttatcct ggtagcagtt catgtagcca gtggatatat agaagcagaa gttattccag 4500

cagaaacagg gcaggaaaca gcatattttc ttttaaaatt agcaggaaga tggccagtaa 4560

aaacaataca tactgacaat ggcagcaatt tcaccggtgc tacggttagg gccgcctgtt 4620

ggtgggcggg aatcaagcag gaatttggaa ttccctacaa tccccaaagt caaggagtag 4680

tagaatctat gaataaagaa ttaaagaaaa ttataggaca ggtaagagat caggctgaac 4740

atcttaagac agcagtacaa atggcagtat tcatccacaa ttttaaaaga aaagggggga 4800

ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta 4860

aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac agggacagca 4920

gaaatccact ttggaaagga ccagcaaagc tcctctggaa aggtgaaggg gcagtagtaa 4980

tacaagataa tagtgacata aaagtagtgc caagaagaaa agcaaagatc attagggatt 5040

atggaaaaca gatggcaggt gatgattgtg tggcaagtag acaggatgag gattagaaca 5100

tggaaaagtt tagtaaaaca ccatatgtat gtttcaggga aagctagggg atggttttat 5160

agacatcact atgaaagccc tcatccaaga ataagttcag aagtacacat cccactaggg 5220

gatgctagat tggtaataac aacatattgg ggtctgcata caggagaaag agactggcat 5280

ttgggtcagg gagtctccat agaatggagg aaaaagagat atagcacaca agtagaccct 5340

gaactagcag accaactaat tcatctgtat tactttgact gtttttcaga ctctgctata 5400

agaaaggcct tattaggaca catagttagc cctaggtgtg aatatcaagc aggacataac 5460

aaggtaggat ctctacaata cttggcacta gcagcattaa taacaccaaa aaagataaag 5520

ccacctttgc ctagtgttac gaaactgaca gaggatagat ggaacaagcc ccagaagacc 5580

aagggccaca gagggagcca cacaatgaat ggacactaga gcttttagag gagcttaaga 5640

atgaagctgt tagacatttt cctaggattt ggctccatgg cttagggcaa catatctatg 5700

aaacttatgg ggatacttgg gcaggagtgg aagccataat aagaattctg caacaactgc 5760

tgtttatcca ttttcagaat tgggtgtcga catagcagaa taggcgttac tcgacagagg 5820

agagcaagaa atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca 5880

gcctaaaact gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg 5940

tttcataaca aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag 6000

agctcatcag aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagtaag tagtacatgt 6060

aacgcaacct ataccaatag tagcaatagt agcattagta gtagcaataa taatagcaat 6120

agttgtgtgg tccatagtaa tcatagaata taggaaaata ttaagacaaa gaaaaataga 6180

caggttaatt gatagactaa tagaaagagc agaagacagt ggcaatgaga gtgaaggaga 6240

aatatcagca cttgtggaga tgggggtgga gatggggcac catgctcctt gggatgttga 6300

tgatctgtag tgctacagaa aaattgtggg tcacagtcta ttatggggta cctgtgtgga 6360

aggaagcaac caccactcta ttttgtgcat cagatgctaa agcatatgat acagaggtac 6420

ataatgtttg ggccacacat gcctgtgtac ccacagaccc caacccacaa gaagtagtat 6480

tggtaaatgt gacagaaaat tttaacatgt ggaaaaatga catggtagaa cagatgcatg 6540

aggatataat cagtttatgg gatcaaagcc taaagccatg tgtaaaatta accccactct 6600

gtgttagttt aaagtgcact gatttgaaga atgatactaa taccaatagt agtagcggga 6660

gaatgataat ggagaaagga gagataaaaa actgctcttt caatatcagc acaagcataa 6720

gaggtaaggt gcagaaagaa tatgcatttt tttataaact tgatataata ccaatagata 6780

atgatactac cagctataag ttgacaagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc 6840

caaaggtatc ctttgagcca attcccatac attattgtgc cccggctggt tttgcgattc 6900

taaaatgtaa taataagacg ttcaatggaa caggaccatg tacaaatgtc agcacagtac 6960

aatgtacaca tggaattagg ccagtagtat caactcaact gctgttaaat ggcagtctag 7020

cagaagaaga ggtagtaatt agatctgtca atttcacgga caatgctaaa accataatag 7080

tacagctgaa cacatctgta gaaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagaaaaa 7140

gaatccgtat ccagagagga ccagggagag catttgttac aataggaaaa ataggaaata 7200

tgagacaagc acattgtaac attagtagag caaaatggaa taacacttta aaacagatag 7260

ctagcaaatt aagagaacaa tttggaaata ataaaacaat aatctttaag caatcctcag 7320

gaggggaccc agaaattgta acgcacagtt ttaattgtgg aggggaattt ttctactgta 7380

attcaacaca actgtttaat agtacttggt ttaatagtac ttggagtact gaagggtcaa 7440

ataacactga aggaagtgac acaatcaccc tcccatgcag aataaaacaa attataaaca 7500

tgtggcagaa agtaggaaaa gcaatgtatg cccctcccat cagtggacaa attagatgtt 7560

catcaaatat tacagggctg ctattaacaa gagatggtgg taatagcaac aatgagtccg 7620

agatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat 7680

ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg 7740

tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag 7800

caggaagcac tatgggcgca gcctcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt 7860

ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt 7920

tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat 7980

acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca 8040

ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca 8100

cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa 8160

ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat 8220

gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca 8280

taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga 8340

atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg 8400

gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca 8460

ttcgattagt gaacggatcc ttggcactta tctgggacga tctgcggagc ctgtgcctct 8520

tcagctacca ccgcttgaga gacttactct tgattgtaac gaggattgtg gaacttctgg 8580

gacgcagggg gtgggaagcc ctcaaatatt ggtggaatct cctacagtat tggagtcagg 8640

aactaaagaa tagtgctgtt agcttgctca atgccacagc catagcagta gctgagggga 8700

cagatagggt tatagaagta gtacaaggag cttgtagagc tattcgccac atacctagaa 8760

gaataagaca gggcttggaa aggattttgc tataagatgg gtggcaagtg gtcaaaaagt 8820

agtgtgattg gatggcctac tgtaagggaa agaatgagac gagctgagcc agcagcagat 8880

agggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 8940

gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 9000

ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 9060

cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaaag aagacaagat 9120

atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca 9180

ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 9240

gagccagata agatagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg 9300

agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc 9360

ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgacat 9420

cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg 9480

actggggagt ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg 9540

gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 9600

gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 9660

tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagca 9719

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ttggaaatgt ggaaaggaag gac 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cactccctga catgctgtca tcat 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cagagccaac agccccacca 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ctgccagttc tagctctgct tc 22

Claims

1.成套引物，包括引物组1；

所述引物组1由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物还包括引物组2；

所述引物组2由引物DR-1和引物DR-2与引物DR-3和引物DR-4组成；

3.用于鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒的成套PCR试剂，包括PCR试剂1；

所述PCR试剂1包括PCR试剂1-1和PCR试剂1-2；

所述PCR试剂1-1含有权利要求1中的引物1和引物2；

所述PCR试剂1-2含有权利要求1中的引物3和引物4；

各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4μM。

4.根据权利要求3所述的成套PCR试剂，其特征在于：所述成套PCR试剂还包括PCR试剂2；

所述PCR试剂2包括PCR试剂2-1和PCR试剂2-2；

所述PCR试剂2-1含有权利要求1中的引物DR-1和引物DR-2；

所述PCR试剂2-2含有权利要求1中的引物DR-3和引物DR-4；

各个所述引物在其对应的PCR试剂中的浓度均为0.4μM。

5.权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的成套PCR试剂在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

6.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述的成套引物或权利要求3或4所述的成套PCR试剂；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

或，所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求3或4所述成套PCR试剂中各物质单独包装的步骤。

7.根据权利要求5所述的应用或权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：

所述人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株亚型为A、B/B’、C、D、F等纯亚型毒株，或CRF01_AE重组毒株、CRF07_BC重组毒株、CRF08_BC重组毒株、CRF55_01B重组毒株、CRF59_01B重组毒株及各个重组毒株的二代重组毒株等重组毒株。

8.一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

(1)以待测病毒的核酸为模板，用权利要求1或2中的引物1和引物2进行扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，用权利要求1或2中的引物3和引物4进行扩增，得到第二轮PCR扩增产物；

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待测病毒为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待测病毒不为或候选不为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；

或，一种鉴定或辅助鉴定待检者是否感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

(1)以待测者的核酸为模板，用权利要求1或2中的引物1和引物2进行扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者感染或候选感染人免疫缺陷病毒；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者未感染或候选未感染人免疫缺陷病毒。

或，一种鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的方法，包括如下步骤：

步骤I：以待测病毒的核酸为模板，用权利要求2中的所述引物DR-1和引物DR-2进行扩增，得到扩增产物，得到第一轮PCR扩增产物；

再以所述第一轮PCR扩增产物为模板，用权利要求2中的所述引物DR-3和引物DR-4进行扩增，得到第二轮PCR扩增产物；

检测所述第二轮PCR扩增产物大小，若待测病毒得到1000-1500bp或1315bp的片段，则所述待测病毒为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；若未得到1000-1500bp或1315bp的片段，则该待测病毒不为或候选不为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；

步骤II：

(1)以用I的方法确定的为或候选为人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株的待测病毒的核酸为模板，用权利要求1或2中的引物1和引物2进行扩增，得到第一轮PCR扩增产物；

步骤I：

以待测病毒的核酸为模板，用权利要求2中的所述引物DR-1和引物DR-2进行扩增，得到扩增产物，得到第一轮PCR扩增产物；

步骤II：

(3)检测所述第二轮PCR扩增产物，若第二轮PCR扩增产物中具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者感染或候选感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株；如果第二轮PCR扩增产物中不具有1500-2000bp或1715bp的特异DNA片段，则所述待检者未感染或候选未感染人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述各个方法中，在获得第二轮PCR扩增产物后，通过测序比对，确定待测样本的人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株亚型。

10.人免疫缺陷病毒Ⅰ型重组毒株pol-env部分序列作为靶基因在开发制备具有如下任一功能产品中的应用；

或，人免疫缺陷病毒Ⅰ型重组毒株pol区短片段和pol-env部分序列作为靶基因在开发制备具有如下任一功能产品中的应用：

(a)扩增人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株pol-env部分序列；

(b)鉴定或辅助鉴定人免疫缺陷病毒Ⅰ型毒株或其亚型；

所述人免疫缺陷病毒Ⅰ型重组毒株pol-env部分序列为序列表中序列5第4800-6400位或与其同源性在95％以上且具有相同功能的序列；