CN111944888A - IFITM3 SNP rs12252的基因型在预测待测者免疫反应强度中的应用 - Google Patents

IFITM3 SNP rs12252的基因型在预测待测者免疫反应强度中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IFITM3 SNP rs12252的基因型作为标记物在预测待测者免疫反应强度中的应用。基因组中“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC”的待测者接种流感疫苗后的免疫反应强度低于“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT”的待测者。本发明具有重要的应用价值。

Description

IFITM3 SNP rs12252的基因型在预测待测者免疫反应强度中 的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及IFITM3 SNP rs12252的基因型作为标记物在预测待测者免疫反应强度中的应用。
背景技术
IFITM(IFN-inducible transmembrane)家族的分子是通过阻止病毒的进入来履行其抗病毒的功能的ISGs。IFITM3是一个很重要的抗病毒因子当小鼠缺失IFITM3这个分子时，小鼠更易感染甲型流感病毒。研究发现，IFITM3和IFITM1的抗病毒效应相比，IFITM3对于需要进入内吞体或溶酶体来完成生命周期病毒有更好的抑制作用，这类病毒包括甲型流感病毒，登革病毒以及布鲁亚病毒科的病毒等。这类病毒的复制都必须依靠内吞体的酸化度(pH<6)和Rab7蛋白的活性。
IFITM3 SNP rs12252的基因型在不同国家和地区有非常明显的差别(见图1)：例如日本人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型分布最多，而北欧和英国人群中没有rs12252-CC基因型。IFITM3 SNP rs12252的基因型的分布和人种密切相关，黄种人和白种人差异明显。当IFITM3 SNP rs12252的基因型为TT时，编码野生型IFITM3蛋白，野生型IFITM3蛋白定位于细胞内的内吞体；当IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC时，编码缺失N端21个氨基酸的IFITM3蛋白，缺失N端21个氨基酸的IFITM3蛋白定位于细胞表面。
已有研究表明，IFITM3 SNP rs12252的基因型与中国人群感染流感的重症密切相关。在中国汉族人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型在人群中所占比例为25％，而在感染甲型流感病毒H1N1/09的重症人群中所占的比例高达69％，该研究表明，携带IFITM3 SNPrs12252-CC基因型的人群在感染H1N1以后，更加容易发展为重症。另外，研究还表明IFITM3SNP rs12252-CC基因型还同流感病毒的易感性相关，携带IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的人群更易感染流感病毒。IFITM3 SNP rs12252的基因型和疾病的发展程度相关，IFITM3SNP rs12252-CC基因型的人群感染HIV和H7N9疾病的发展速度都快于IFITM3 SNPrs12252-TT基因型。
疫苗接种属于获得性免疫的范畴，是人类预防和控制疾病的重要手段。但是因为疫苗的免疫原性、流行毒株与疫苗毒株的匹配程度以及疫苗的接种途径等不同，疫苗接种后所产生的保护力不同。研究表明，流感疫苗的保护率只有50％左右，有时甚至只有20-30％。开发更具保护效力的疫苗势在必行。
发明内容
本发明的目的是如何预测待测者接种流感疫苗后的免疫反应强度。
本发明首先保护用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质在制备预测免疫反应强度的产品中的应用。
本发明还保护用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质在预测免疫反应强度中的应用。
上述任一所述的应用中，如果基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC，待测者免疫反应强度较低。如果基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT，待测者免疫反应强度较高。基因组中“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC”的待测者的免疫反应强度低于“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT”的待测者。
上述任一所述的应用中，所述用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质可为由引物F和引物R组成的特异引物对；所述特异引物对的靶序列可含有IFITM3SNP rs12252。
所述引物F可为如下b1)或b2)：
b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。
所述引物R可为如下b3)或b4)：
b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明提供的引物F和引物R的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明设计的引物F和引物R的核苷酸序列具有85％或者更高同一性的核苷酸，且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还保护一种预测免疫反应强度的产品，可包括用于检测人基因组中IFITM3SNP rs12252的基因型的物质。
上述产品中，所述“用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质”可为所述特异引物对。
所述产品还可包括记载有判断标准的载体。
所述判断标准可为判断标准甲或判断标准乙。
所述判断标准甲可为：如果基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC，待测者免疫反应强度较低；如果基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT，待测者免疫反应强度较高。
所述判断标准乙可为：基因组中“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC”的待测者的免疫反应强度低于“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT”的待测者。
上述任一所述的产品的制备方法也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的产品的制备方法可包括将上述任一所述特异引物对中的各个引物分别单独包装的步骤。
本发明还保护预测待测者免疫反应强度的方法。
本发明保护的预测待测者免疫反应强度的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测者的基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型是CC、CT还是TT，如果IFITM3 SNPrs12252的基因型为CC，待测者免疫反应强度较低；如果IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT，待测者免疫反应强度较高。
本发明保护的预测待测者免疫反应强度的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：检测待测者的基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型是CC、CT还是TT，“IFITM3 SNPrs12252的基因型为CC”的待测者的免疫反应强度低于“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT”的待测者。
人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型作为标记物在预测待测者免疫反应强度中的应用也属于本发明的保护范围。
所述特异引物对也属于本发明的保护范围。
所述特异引物对在预测待测者免疫反应强度中的应用也属于本发明的保护范围。
所述特异引物对在制备用于预测免疫反应强度的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述低于可为在统计学上的低于。
上述任一所述免疫反应强度可为接种疫苗后的免疫反应强度。所述疫苗可为流感疫苗。所述流感疫苗的抗原可为甲型流感病毒的抗原或乙型流感病毒的抗原。所述甲型流感病毒可为甲型H1N1流感病毒或甲型H3N2流感病毒。
上述任一所述IFITM3 SNP rs12252具体位于人基因组第11条染色体的第320772位。
本发明的发明人对接种流感疫苗后的低免疫反应人群(由129个个体组成)和免疫反应正常人群(由299个个体组成)的IFITM3 SNP rs12252的基因型和等位基因分布频率进行研究。结果表明，在低免疫反应人群中IFITM3 SNPrs12252-CC基因型的分布频率为45.74％，在免疫反应正常人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率为27.4％，免疫反应正常人群与中国汉族人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率无显著差异。因此，IFITM3 SNP rs12252-CC基因型是导致低免疫反应的风险因素。人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型可以作为标记物在预测待测者接种流感疫苗后的免疫反应强度。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为不同国家和地区人群中IFITM3 SNP rs12252的基因型分布频率的数据统计结果。
图2为疫苗接种总人群、正常免疫反应人群和低免疫反应人群中IFITM3 SNPrs12252的基因型分布频率的数据统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
红细胞裂解液为天根生化科技(北京)有限公司的产品。血凝块分散专用离心管、细胞裂解液、蛋白沉淀液、核酸溶解液和蛋白酶K均为Qiagen公司的产品。
实施例1、血清样本和血凝块样本的获得
根据接种流感疫苗前后的血清数据发现，当人的年龄小于5岁或大于65岁，疫苗的保护效率不高于30％，原因可能在于该年龄段人群的群体免疫力整体低下。因此，本发明的发明人选取了2009年-2015年云南省和新疆省接种流感疫苗的446人作为检测人群，且检测人群的年龄在5岁(含)-65岁(含)之间。部分个体的接种年份、采样地、样品编号、性别、年龄依次见表1中第1列至第5列。
在流感疫苗接种前和接种后分别采集每个个体的血样7mL，置于促凝采血管颠倒混匀，分离，得到血清样本和血凝块样本。将血清样本和血凝块样本置于-80℃保存。
表1
Figure BDA0002060007980000041
Figure BDA0002060007980000051
Figure BDA0002060007980000061
Figure BDA0002060007980000071
实施例2、根据IFITM3 SNP rs12252的基因型预测接种疫苗后免疫反应强度
一、血凝块样本基因组DNA的提取
提取血凝块样本的基因组DNA。提取每个血凝块样本的基因组DNA的步骤如下：
1、取血凝块样本，37℃水浴5min(目的为溶解)，得到溶解的血块。
2、完成步骤1后，取血凝块分散专用离心管，加入9mL红细胞裂解液和步骤1溶解的血块，1700rpm离心10min。
3、完成步骤2后，取所述血凝块分散专用离心管，弃上部网筛结构，先孵育5min，再置于旋转混匀器上颠倒孵育10min，最后1500rpm离心10min，弃上清。
4、完成步骤3后，取所述血凝块分散专用离心管，加入9mL红细胞裂解液，然后置于旋转混匀器上颠倒孵育10min，最后1500rpm离心10min，弃上清。
5、完成步骤4后，取所述血凝块分散专用离心管，将管底剩余的白细胞块弹匀，加入5mL细胞裂解液和9μL浓度为20μg/mL的蛋白酶k，再弹匀，56℃孵育3h。
6、完成步骤5后，取所述血凝块分散专用离心管，加入3mL蛋白沉淀液，高速震荡20s，然后4℃、12000rpm离心15min，收集上清。
7、完成步骤6后，取离心管(规格为50mL)，加入收集的上清和7mL异丙醇，轻柔颠倒10次(此时可见丝状的基因组DNA)，然后4℃、12000rpm离心15min，弃上清，用干净的纸吸残液。
8、完成步骤7后，取所述离心管，加入1mL 70％(v/v)乙醇水溶液，用吸头将离心管底部的DNA沉淀转移至另一新的离心管中，并颠倒数次清洗DNA，4℃12000rpm离心15min，弃上清，用干净的纸吸残液，空气干燥15min。
9、完成步骤8后，取所述离心管，加入200μL核酸溶解液，56℃孵育1h，得到血凝块样本的基因组DNA。
取血凝块样本的基因组DNA，检测浓度，分装，-80℃保存。
二、检测IFITM3 SNP rs12252的基因型
1、分别取1-2μL步骤一得到的血凝块样本的基因组DNA，加入核酸溶解液进行稀释，得到浓度为10μg/μL的血凝块基因组DNA溶液(作为模板)。
2、配置反应体系。反应体系为50μL，由5μL模板、5μL引物F水溶液(浓度为1μmoL)、5μL引物R水溶液(浓度为1μmoL)、5μLdNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为5mM)、0.5μLEasyPfuTaq酶和29.5μLddH2O组成。
引物F：5’-GGAAACTGTTGAGAAACCGAA-3’(序列表中序列1)；
引物R：5’-CATACGCACCTTCACGGAGT-3’(序列表中序列2)。
3、完成步骤2后，将各个反应体系置于PCR反应仪，进行PCR扩增反应，得到相应的PCR扩增产物。
反应程序：94℃变性10min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，38个循环；72℃延伸10min；4℃保持1h。
4、完成步骤3后，取PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。
5、完成步骤4后，将电泳显示单一条带的PCR扩增产物进行测序(测序引物采用引物F和引物R)。
利用分析软件DNAstar中的SeqMan分析步骤5得到的测序结果，进而判断每个个体的IFITM3 SNP rs12252的基因型。如果IFITM3 SNPrs12252的基因型为CC，简称rs12252-CC；如果IFITM3 SNPrs12252的基因型为CT，简称rs12252-CT；如果IFITM3 SNPrs12252的基因型为TT，简称rs12252-TT。
部分个体的IFITM3 SNP rs12252的基因型的检测结果见表1中第6列(CC即rs12252-CC，CT即rs12252-CT，TT即rs12252-TT)。
三、低免疫反应和正常免疫反应的判定
1、检测血清样本的HI抗体滴度
采用红细胞凝集抑制试验(hemagglutination inhibition test，HI)检测每个流感疫苗接种人群血清样本中针对疫苗成分所产生的HI抗体滴度。检测流感疫苗接种人群血清样本中HI抗体滴度所用抗原为当年的流感疫苗株所对应的野生毒株(由国家流感中心制备，根据每年的流感疫苗株有所调整)。HI抗体的检测和判定方法详见郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其实验技术.中国三峡出版社.1997.
2、低免疫反应和正常免疫反应的判定
流感疫苗的抗原包括H1N1流感病毒的抗原、H3N2流感病毒的抗原和B型流感病毒的抗原，所以检测HI抗体滴度分别针对三种不同的抗原进行。流感疫苗接种人群为2009年-2015年的人群样本，每年流感疫苗的成分会有所差异，所以检测HI抗体滴度所采用的抗原为接种疫苗株所对应的野生毒株。每个个体的血清针对H1N1流感病毒的抗原、H3N2流感病毒的抗原和B型流感病毒的抗原进行HI抗体滴度检测，每种抗原需要检测疫苗接种个体免疫接种前和接种后的HI抗体滴度。每个个体根据所测定的HI抗体滴度结果被分为低免疫反应人群和正常免疫人群两种群体。疫苗接种个体如果其对于接种的三种抗原其中两种都产生了低免疫反应，则这样的个体认定为低免疫反应人群。疫苗接种的低免反应的定义为疫苗接种前和接种后相比不能产生4倍升高或免疫后检测到的HI抗体滴度低于40，只要满足其中之一则认定为低免疫反应。
分析人群接种流感疫苗的HI抗体检测结果发现，有的个体在疫苗接种前其HI抗体滴度已高达320，对于这样的HI抗体检测结果难以判定该个体针对该抗原的免疫反应是正常的或低下的，为了提高分析结果的精确度，故在数据分析时将该类检测结果认定为无效数据。在判定个体是否为低免疫反应人群时，将该部分无效结果去除后，只根据其余有效的HI结果判定。如果去除无效数据后，个体只剩下一种或没有抗原的HI抗体滴度结果是有效的话，这样的个体因无法判定其免疫反应的情况，从分析人群中去除。如果去除无效数据后，个体只剩下两种抗原的抗体滴度结果是有效的，并且针对两种抗原的免疫反应均为正常或低下，便可以根据有效的测定结果判定个体的免疫反应是低下或正常。如果去除无效数据后，个体只剩下两种抗原的抗体滴度结果是有效的，但是针对两种抗原的免疫反应一个为正常，而另一个为低下，该个体的免疫反应类别无法判定，将该个体从分析人群中去除。2009年-2015年流感疫苗接种人群中有18个无法判定的人群，故用于数据分析的个体总数为428个。
部分个体的低免疫反应和正常免疫反应的判定的结果见表1中第7列。
四、数据统计和分析
1、分析统计疫苗接种总人群、正常免疫反应人群和低免疫反应人群中IFITM3 SNPrs12252的基因型和等位基因分布频率的数据，绘制百分比分布饼图。
实验结果见图2：在疫苗接种人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率为33％，在中国汉族人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率为25％，在正常免疫反应人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率为27％(基本上与中国汉族人群的分布频率相同)，而在低免疫反应人群中IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率为46％，远高于疫苗接种人群、正常免疫反应人群和中国汉族人群的分布频率。上述结果表明，IFITM3 SNP rs12252-CC基因型可能同疫苗接种后的低免疫反应相关。
2、将疫苗接种人群、免疫反应正常人群和低免疫反应人群数据按照IFITM3 SNPrs12252的基因型和等位基因分布频率分别归类，然后分别同中国汉族人群IFITM3 SNPrs12252的基因型人群的数据进行卡方检验，用于检验疫苗接种人群、免疫反应正常人群和低免疫反应人群的IFITM3 SNP rs12252的基因型和等位基因分布频率是否有显著差异。统计结果见表2。
表2. IFITM3 rs12252等位基因和基因型在中国普通人群和流感疫苗接种人群中的频率分布
Figure BDA0002060007980000101
注:IFITM3为干扰素诱导的跨膜蛋白3，※为同汉族人群比较的结果，利用卡方检验计算X2和P值。
结果表明，疫苗接种人群的IFITM3 SNP rs12252的基因型分布同中国汉族人群的基因型分布没有统计学差异，原因可能是因为疫苗接种人群并非是特异选取的，而是随机形成的，但疫苗接种人群的IFITM3 SNP rs12252-CC基因型明显高于中国汉族人群；免疫反应正常人群的IFITM3 SNP rs12252的基因型和等位基因分布与中国汉族人群没有明显差异；低免疫反应人群的IFITM3 SNP rs12252的基因型和等位基因分布频率与中国汉族人群具有显著差异，并且IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的分布频率均显著高于中国汉族人群和正常免疫反应人群。
3、将疫苗接种人群和免疫反应正常人群的IFITM3 SNP rs12252的基因型和等位基因分布频率的数据同低免疫反应人群的数据进行卡方检验。统计结果见表3。
表3. IFITM3 rs12252等位基因和基因型在中国流感疫苗接种人群中的频率分布
Figure BDA0002060007980000111
注:IFITM3为干扰素诱导的跨膜蛋白3，※为同汉族人群比较的结果，利用卡方检验计算X2和P值。
统计结果表明，低免疫反应人群、免疫反应正常人群和疫苗接种人群的IFITM3SNP rs12252的基因型和等位基因分布频率都有明显的差异。在低免疫反应人群中IFITM3SNP rs12252-CC基因型的分布频率为45.74％，在免疫反应正常人群中IFITM3 SNPrs12252-CC基因型的分布频率为27.4％，免疫反应正常人群与中国汉族人群中IFITM3 SNPrs12252-CC基因型的分布频率无显著差异。由此可见，疫苗接种人群中，IFITM3 SNPrs12252-CC基因型的分布频率高于中国汉族人群是由于低免疫反应人群携带大量IFITM3SNP rs12252-CC基因型导致的。
4、不同遗传模型中IFITM3 SNP rs12252的等位基因同低免疫反应的相关性研究
因为IFITM3 SNP rs12252的等位基因的遗传模式未知，所以分别采用等位基因显性模型、等位基因共显性模型和等位基因隐性模型分析rs12252-CC同低免疫反应的相关性和风险系数。分析结果见表4。
表4.疫苗接种反应中按照不同基因遗传模型的IFITM3 rs12252相关性
Figure BDA0002060007980000112
Figure BDA0002060007980000121
注:CI为置信区间，利用卡方检验计算X2和P值。
实验结果如下：
1、等位基因共显性模型：IFITM3 SNP rs12252-CC基因型同接种流感疫苗的低免疫反应明显相关(P＝0.0006，OR(95％CI)1.68(1.25-2.28))；
2、等位基因隐性模型：rs12252-CC同接种流感疫苗的低免疫反应明显相关(P＝0.0002，OR(95％CI)2.23(1.45-3.43))；
3、等位基因显性模型：IFITM3 SNP rs12252-CC基因型和IFITM3 SNP rs12252-CT基因型同接种流感疫苗的低免疫反应明显无关(P＝0.103，OR(95％CI)1.57(0.90-2.72))。
依照感染流感病毒人群的血清学数据，IFITM3 SNP rs12252-CC基因型的人群HI抗体滴度高于IFITM3 SNP rs12252-TT基因型和IFITM3 SNP rs12252-TC基因型人群，可推测IFITM3 SNP rs12252的等位基因的遗传模型为隐性遗传模型，IFITM3 SNP rs12252-CC基因型同接种流感疫苗的低免疫反应明显相关。由此可见，IFITM3 SNP rs12252-CC基因型是导致低免疫反应的风险因素。
<110> 中山大学 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
<120> IFITM3 SNP rs12252的基因型在预测待测者免疫反应强度中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggaaactgtt gagaaaccga a 21
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
catacgcacc ttcacggagt 20

Claims (10)

1.用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质在制备预测免疫反应强度的产品中的应用。
2.用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质在预测免疫反应强度中的应用。
3.一种预测免疫反应强度的产品，包括用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质。
4.如权利要求1或2所述的应用、或、权利要求3所述的产品，其特征在于：所述用于检测人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型的物质为由引物F和引物R组成的特异引物对；所述特异引物对的靶序列含有IFITM3 SNP rs12252。
5.如权利要求4所述的应用、或、权利要求4所述的产品，其特征在于：
所述引物F为如下b1)或b2)：
b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R为如下b3)或b4)：
b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。
6.预测待测者免疫反应强度的方法一或预测待测者免疫反应强度的方法二：
预测待测者免疫反应强度的方法一，包括如下步骤：检测待测者的基因组中IFITM3SNP rs12252的基因型是CC、CT还是TT，如果IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC，待测者免疫反应强度较低；如果IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT，待测者免疫反应强度较高；
预测待测者免疫反应强度的方法二，包括如下步骤：检测待测者的基因组中IFITM3SNP rs12252的基因型是CC、CT还是TT，“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CC”的待测者的免疫反应强度低于“IFITM3 SNP rs12252的基因型为CT或TT”的待测者。
7.人基因组中IFITM3 SNP rs12252的基因型作为标记物在预测待测者免疫反应强度中的应用。
8.权利要求4或5中所述特异引物对。
9.权利要求4或5中所述特异引物对在预测待测者免疫反应强度中的应用。
10.权利要求4或5中所述特异引物对在制备用于预测免疫反应强度的试剂盒中的应用。
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