CN103194446A

CN103194446A - IFITM3-rs12252基因中与人类重症流感相关的SNP标记及其应用

Info

Publication number: CN103194446A
Application number: CN2013101609493A
Authority: CN
Inventors: 李宁; 张永宏; 董涛; 赵艳; 覃岭
Original assignee: Beijing Youan Hospital
Current assignee: Beijing Youan Hospital
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2013-07-10

Abstract

本发明提供了一种与人类重症流感相关的SNP标记及其应用，其位于IFITM3-rs12252基因如SEQ ID NO.1所示序列的142bp处，此处碱基为C的个体发生重症流感的风险显著高于此处碱基为T的个体。本发明采用聚合酶链式反应（PCR）和测序技术筛选到与人类重症流感相关的SNP标记，并通过限制片段多态性（RFLP）方法来检测待测人群的基因型，根据基因型判定结果，为早期预测流感重症、控制流感重症的发生提供了可能。另外，本发明提供的基因型检测方法，无需高昂的仪器投入，具有简单、快捷、成本低廉等优点，便于基层推广使用。

Description

IFITM3-rs12252基因中与人类重症流感相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及IFITM3-rs12252基因中与人类重症流感相关的SNP标记及其应用。

背景技术

流感（Influenza）因其传染性强，发病率高，易引起暴发流行，严重威胁着人类的健康。虽然流感疫苗可以有效的预防流感的发生，但是流感病毒变异后可以削弱流感疫苗的效应。如2009年爆发的甲型H1N1流感，据统计，在我国确诊的12.7万例患者中，有8320例为重症及危重病例，死亡196例。由此可见，流感，尤其是重症流感已成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。

干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3）位于人类第11号染色体上，是近期发现的一种具有广谱抗囊膜病毒活性的蛋白，是由I型或II型干扰素（IFN）诱导产生的，它可以通过抑制流感病毒和其他包膜病毒进入细胞而限制病毒复制，缺失IFITM3基因后，IFN的抗病毒作用会明显变弱，由此，IFITM3是人体抗病毒免疫所必需的。

最新研究发现，IFIMT3的基因多态性与流感重症有关。目前，尚未发现有通过检测单个碱基突变来预测流感重症的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供IFITM3-rs12252基因中与人类重症流感相关的SNP标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种与人类重症流感相关的SNP标记，其位于IFITM3-rs12252基因如SEQ ID NO.1所示序列的142bp处，此处碱基为C的个体发生重症流感的风险显著高于此处碱基为T的个体。

本发明还提供用于检测上述与人类重症流感相关的SNP标记的引物对，包括正向引物F5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’和反向引物R5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’。

本发明还提供上述特异性引物对的应用，旨在鉴定IFITM3的基因多态性。由于IFITM3的基因多态性（rs12252-C基因型）与流感重症有关，所述特异性引物对能够有效地鉴定出IFITM3-rs12252的不同基因型，IFITM3-rs12252-C基因型因改变了IFITM3蛋白的N末端蛋白结构而降低其限制病毒复制的能力。根据全球千人基因组数据显示，IFITM3-rs12252-C基因型在欧洲白种人中很罕见，而在亚洲人群中更为常见。更重要地，结合rs12252-CC基因型易于发生流感重症的数据，分析结果表明中国人群中发生严重感染的群体归因风险度高达54.3%。有临床研究发现2009年的H1N1流感大流行时，在具有肺炎、呼吸或肾脏衰竭等严重并发症的中国患者中，69%的人携带rs12252-CC基因型，而在病症轻微的患者中，只有25%的人携带这一遗传突变。统计分析结果显示，rs12252-CC基因型与CT/TT基因型相比，发生严重感染的风险增加了6倍。因此，IFITM3-rs12252基因多态性在流感的发生中起着非常重要的作用。

本发明还提供鉴定与人类重症流感相关的SNP标记的方法，其包括步骤：1）提取待测个体的基因组DNA；2）以待测个体的基因组DNA为模板，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出IFITM3-rs12252基因片段；3）检测PCR扩增产物。

PCR反应使用的扩增体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA1μl，10μM引物F和R各2μl，Premix Taq HS25μl，余量为水（ddH₂O）；其中，Premix Taq HS购自TaKaRa公司，货号：DR028A。

PCR反应使用的条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

步骤3）中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶MscI对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条带（约600bp），则待测个体IFITM3-rs12252基因型为CC型，检测结果出现两条带（约450bp和约150bp），则待测个体IFITM3-rs12252基因型为TT型，检测结果出现三条带（约600bp、约450bp和约150bp），则待测个体IFITM3-rs12252基因型为杂合CT型。

酶切反应体系以20μl计为：PCR扩增产物10μl，快速消化MScI酶（Fast Digest MScI，Fermentas公司）1μl，10×FastDigest Green缓冲液2μl，无核酸酶的ddH₂O17μl。反应条件：37℃水浴，酶切30min。

本发明还提供含有上述特异性引物对的用于检测人类重症流感的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明通过监测IFITM3-rs12252基因型为早期预测流感重症、控制流感重症的发生提供了可能。另外，本发明提供的基因型检测方法仅包括普通的PCR扩增技术及琼脂糖凝胶电泳技术，无需高昂的仪器投入，具有简单、快捷、成本低廉等优点，便于基层推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例1中使用MScI限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切的电泳图谱；其中，M:为DNA分子量标准（50bp Ladder）；样品1-1、1-2和1-3为CT基因型酶切产物；样品2-1、2-2和2-3为CC基因型酶切产物；样品3-1、3-2和3-3为TT基因型酶切产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或按照制造厂商说明书建议的条件。以下实施例中的试验结果，均设置了三次重复实验。

实施例1与人类重症流感相关的SNP标记的获得

1SNP位点的获得以及PCR-RFLP分型

（1）扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据IFITM3-rs12252基因序列（SEQ ID NO.1）设计引物，包括正向引物F5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’和反向引物R5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段。该SNP位点位于IFITM3-rs12252基因序列的142bp处，该处碱基可以为C或T，当该处碱基为T时，可被MscI内切酶（识别序列为TGG^CCA）识别。

其中，PCR反应体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA1μl，10μM引物F和R各2μl，Premix Taq HS25μl，余量为ddH₂O；其中，Premix Taq HS购自TaKaRa公司（货号：DR028A）。使用Premix Taq HotStart Version（TaKaRa公司）。

PCR反应条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

（2）针对第142位碱基的不同选择适当的内切酶进行PCR-RFLP

该PCR产物用MscI内切酶酶切，反应体系以20μl计为：PCR扩增产物10μl，快速消化MScI酶（Fast Digest MScI，Fermentas公司）1μl，10×FastDigest Green缓冲液2μl，无核酸酶的ddH₂O17μl。反应条件为：37℃水浴，酶切30min。

然后，将得到的酶切产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察。

制胶：用蒸馏水将与胶接触的器皿洗干净，室温自然晾干，将含有Golden View的2%琼脂糖凝胶倒入模板中，插入13个孔的梳子，待胶自然聚合后，拔出梳子，则制得含有13个孔的2%的琼脂糖凝胶。

电泳：向15μl酶切产物中加入6×上样缓冲液3μl，按照CC型（1-1.1-2.1-3）；CT型（2-1.2-2.2-3）；TT型（3-1.3-2.3-3）顺序上样，100V恒压，电泳2小时。

2基因型判定及关联分析

根据PCR-RFLP的结果判定该位点在检测群体中的基因型。当扩增片段的142bp处碱基均为C时，MscI内切酶不可识别该位点，即PCR扩增片段不能被切开，凝胶中只有一条带，长度约为600bp，该基因型记为CC型；当142bp处的碱基都为T时，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个约为450bp，另一个片段约为150bp，该基因型记为TT型；当142bp处既含有C碱基又含有T碱基时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别约为600bp、450bp和150bp，该基因型记为杂合型CT型。即，该位点可分为三种基因型：CC型:600，CT型:600/450/150，TT型:450/150。（图1）

实施例2IFITM3-rs12252不同基因型与人类重症流感的关联分析及检测应用

按照实施例1的方法，对50个人的基因组DNA样品进行PCR-RFLP检测，将这50份DNA样品使用基因检测的金标准---基因测序法进行测序检测。从该50个有基因测序结果的样品中，抽取9份，分为3组（CT基因型、CC基因型、TT基因型），每组各3个人基因组DNA样品，对该9份样品进行MscI酶切，再通过与基因测序结果进行比较，从而验证本发明方法的可靠性与可操作性。实验结果与基因测序的结果100%吻合。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种与人类重症流感相关的SNP标记，其特征在于，其位于IFITM3-rs12252基因如SEQ ID NO.1所示序列的142bp处，此处碱基为C的个体发生重症流感的风险显著高于此处碱基为T的个体。

2.用于检测权利要求1所述与人类重症流感相关的SNP标记的引物对，其特征在于，包括正向引物F5’-GAAAAGGAAACTGTTGAGAACCGAA-3’和反向引物R5’-GAGCCTCCTCCTAAACCTGCAC-3’。

3.鉴定与人类重症流感相关的SNP标记的方法，其包括步骤：

1）提取待测个体的基因组DNA；

2）以待测个体的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出IFITM3-rs12252基因片段；

3）检测PCR扩增产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR反应使用的扩增体系以50μl计为：150-200ng/μl人基因组DNA1μl，10μM引物F和R各2μl，PremixTaqHS25μl，余量为水；其中，Premix Taq HS购自TaKaRa公司，货号：DR028A。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）中PCR反应使用的条件为：95℃10分钟；95℃60秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；72℃5分钟。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3）中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为：用内切酶MscI对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条带，则待测个体IFITM3-rs12252基因型为CC型，检测结果出现两条带，则待测个体IFITM3-rs12252基因型为TT型，检测结果出现三条带，则待测个体IFITM3-rs12252基因型为杂合CT型。

7.含有权利要求2所述引物对的用于检测人类重症流感的试剂盒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

10.权利要求1所述与人类重症流感相关的SNP标记在鉴定IFITM3基因多态性中的应用。